本发明涉及一种产孢装置及其应用，具体涉及一种模拟野生环境的产孢装置及其在牛樟芝中的应用。
背景技术：
目前真菌的产孢方法主要是藉由液体震荡培养方式在一定时间内自然形成孢子，此过程易造成孢子继代繁殖衰老与死亡，无法提高孢子数与活性。
牛樟芝富含多醣体及三萜类，其中，具有抗氧化、抗发炎、抗肿瘤及提高免疫力等功效及相关生物活性成分被不断的研究和发现，其培养技术及野生孢子的取得与繁殖越来越受到学者的关注。目前牛樟芝产孢的方式皆由野生牛樟木分离牛樟芝菌至平板培养基再移至液态培养基进行摇瓶振荡培养，此过程易受到杂菌污染且培养条件限制(包括菌种繁殖老化及生物活性成分含量降低)，无法提高牛樟芝发酵期间的孢子数且易造成老化。尤其是平板培养需要较长时间，且形成的孢子数量较少，其活性亦相对较低；另一方面采用液态振荡培养，其孢子数较高于平板培养，但因孢子快速生长、培养条件不足、亦加速老化，不适合牛樟芝孢子大量生产。
技术实现要素：
为了解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种模拟野生环境的产孢装置，该装置包括产孢罐、木块放置框、无菌空气扩散板及孢子收集板，所述产孢罐上端设有密封盖、温度控制系统接入口及加湿系统接入口，所述木块放置框设置至于产孢罐内，所述木块放置框的两侧分别设有无菌空气扩散板和孢子收集板；所述产孢罐上设有营养液滴入口、无菌空气系统通入口、孢子输出口；所述无菌空气扩散板与无菌空气系统通入口相通，所述无菌空气系统通入口上设有空气控制阀，所述孢子收集板与孢子输出口相通；所述孢子输出口上设有压力控制阀，所述营养液滴入口与营养液输入系统相通，所述营养液滴入口设置在产孢罐的密封盖上，所述营养液滴入口设有营养液滴入控制阀。
使用时，将产孢装置灭菌，在超净工作台中，将需要产孢的原生菌植入已灭菌的木块中，使木块平均吸附一定浓度的菌液，打开产孢罐的密封盖，并将吸附有菌液的木块放入木块放置框中，调节无菌空气系统通入口上的空气控制阀使无菌空气从无菌空气扩散板上进入产孢罐中，调节营养液滴入口上的营养液滴入控制阀控制营养液的流入速度，同时通过调节温度控制系统和加湿系统分别控制温度和湿度，以加速原生菌的生长，待原生菌产孢达到一定数量时，通过调整孢子输出口上的压力控制阀使孢子进入孢子收集板并从孢子输出口输出。
作为优选，所述无菌空气扩散板为半圆柱形，其靠近木块放置框的切面均匀设有孔状结构，该孔状结构有利于空气的均匀进入。
作为优选，所述孢子收集板为近似椭半球形，其靠近木块放置框的切面均匀设有孔状结构，该孔状结构有利于孢子的收集。
作为进一步优选，所述无菌空气扩散板及孢子收集板为不锈钢材质结构。
本发明模拟野生环境的产孢装置能够加速原生孢子的繁殖，可以大幅缩短孢子形成时间、防止杂菌污染，同时通过使用本发明模拟野生环境的产孢装置获得的孢子活性好，本发明模拟野生环境的产孢装置可应用于各类真菌类孢子的繁殖、缩短培养时间，提高生物活性，所述真菌类优选为牛樟芝、冬虫夏草、桑黄菌、白桦菌、金花菌。
一种模拟野生环境的产孢装置在真菌类孢子繁殖中的应用，其包括以下步骤：
1)营养液输入系统装入灭菌后的液态培养基；
2)在超净工作台中，将原生菌植入已灭菌的木块中，使木块表面平均吸附菌液达到一定浓度，并移入产孢罐的木块放置框中，调节无菌空气系统通入口上的空气控制阀使无菌空气通过无菌空气扩散板进入产孢罐中；调节营养液滴入口上的营养液滴入控制阀，控制营养液的流入速度，以加速原生菌的生长，同时控制产孢装置的温度及湿度；待原生菌产孢达到一定数量时，通过调整孢子输出口上的压力控制阀使孢子进入孢子收集板并从孢子输出口输出，通入到原生菌发酵系统，得孢子液态溶液。
作为优选，所述木块为适合菌种生长的野生木块或麦梗胜肽木块，所述麦梗胜肽木块进一步优选为圆柱形结构。
作为进一步的优选技术方案，所述麦梗胜肽木块的组分如下(重量百分比)：
其中，所述麦梗粉为麦梗干燥后磨成的粉。
作为进一步优选技术方案，所述麦梗胜肽木块的制作方法如下：按比例称取麦梗粉、薏仁提取物、玉米蛋白粉、麦芽提取物、麦芽糊精及水，混合于木块成型模具内进行灭菌后冷却干燥成型。
另一方面，本发明提供了一种模拟野生环境的产孢装置在牛樟芝孢子繁殖中的应用，其包括以下步骤：
1)营养液输入系统装入灭菌后的液态培养基；
2)在超净工作台中，将牛樟芝原生菌植入已灭菌的木块中，使木块表面平均吸附菌液达到一定浓度，并移入产孢罐的木块放置框中，调节无菌空气系统通入口上的空气控制阀使无菌空气通过无菌空气扩散板进入产孢罐中；调节营养液滴入口上的营养液滴入控制阀，控制营养液的流入速度，以加速原生菌的生长，同时控制产孢装置的温度及湿度，待原生菌产孢达到一定数量时，通过调整孢子输出口上的压力控制阀使孢子进入孢子收集板并从孢子输出口输出，通入到原生菌发酵系统，得孢子液态溶液。
作为进一步优选的技术方案，所述营养液的组成如下(重量百分比)：2％薏仁提取物、5％麦芽糖及2～10％葡萄糖，余量为水。
作为进一步优选的技术方案，所述木块为麦梗胜肽木块，所述麦梗胜肽木块的组分如下(重量百分比)：
其中，所述麦梗粉为麦梗干燥后磨成的粉。
作为进一步优选的技术方案，所述木块为麦梗胜肽木块，所述麦梗胜肽木块的制作方法如下：按比例称取麦梗粉、薏仁提取物、玉米蛋白粉、麦芽提取物、麦芽糊精及水，混合于木块成型模具内进行灭菌后冷却干燥成型。
作为进一步优选的技术方案，所述产孢装置的温度控制在10～30℃。
作为进一步优选的技术方案，所述产孢装置的湿度控制在70～90％rh。
通过使用本发明的模拟野生环境的产孢装置所收集的孢子，其生长速率及活性均远远高于传统液体培养收集的孢子，利用本发明模拟野生环境的产孢装置可以大幅缩短牛樟芝孢子形成时间、防止杂菌污染，促进牛樟芝次生代谢产物的合成。
附图说明
图1为实施例1中模拟野生环境的产孢装置的结构示意图。
其中，图中1为产孢罐，2为无菌空气扩散板，3为木块放置框，4为孢子收集板，5为无菌空气系统通入口，6为孢子输出口，7为营养液滴入口，8为温度控制系统接入口，9为加湿系统接入口，10为密封盖，11为营养液滴入控制阀，12为空气控制阀，13为压力控制阀。
具体实施方式
实施例中的薏仁提取物、玉米蛋白粉、麦芽提取物、麦芽糊精均可通过商业途径购买得到，本发明实施例中的薏仁提取物、玉米蛋白粉、麦芽提取物、麦芽糊精菌购买于鉅得生技股份有限公司。
实施例中的麦梗采购于中国台湾台中市大雅农会，经晒干后，通过粉碎机磨成粉末，20目过筛备用。
5％香兰素冰醋酸的配置如下：将5g香兰素溶于100ml冰醋酸中。
牛樟芝原生菌(ccrc35396)够买于中国台湾新竹食品工业发展研究所。
meb培养液的配置如下：每1l水中溶解蛋白胨1g，葡萄糖20g，麦芽抽提物20g，高压蒸汽灭菌。
孢子数目检测：取一毫升之液态震荡培养液分别以无菌水稀释103、104及105倍数之孢子菌液，以血细胞计数板及显微镜观察计算孢子数，再取上述三种浓度之菌液1毫升至麦芽浸粉琼脂培养基(mea，maltoseextractagar)培养48小时后菌落计数。
多醣体萃取及检测
精称牛樟芝样品1克，置入50ml的离心管中，加入10ml双蒸水(ddh2o)混合，于水浴锅下加热95℃持续1hr，加热完待冷却后，分装离心(10000rpm10分，4℃)，取上清液，加蒸馏水定容至10ml。过滤，取滤液1ml，加95％酒精4ml放置4℃的冰箱沉淀24h。以转速6000rpm离心20min，收集多醣体沉淀物，以75％5ml酒精洗涤2次，去除残留葡萄糖，再以6000rpm离心15min，收集沉淀物，置于55℃烘箱中烘干；将多醣体沉淀物以2mlddh2o复溶，经漩涡振荡器均匀后放置振荡培养箱(37℃，150rpm，15分)；随后分别取上清液0.5ml加9.5mlddh2o稀释，取0.5ml稀释液，加入0.5ml5％苯酚后，再沿管壁慢慢加入1m的h2so42.5ml，室温下反应10分钟，于490nm波长测定吸光值(od值)。多醣体标准溶液配制
称取葡萄糖(glucose)标准品(sigma公司)以去离子水配制0、1、2.5、5、10、25、50、100μg/ml之glucose标准液；取出0.5ml，各置于试管中，加入0.5ml5％酚液，再加入2.5ml浓硫酸；以紫外线光谱仪于490nm波长测吸光值。
总三萜(triterpene)的测定
称取样品0.3g后加入30ml95％etoh，于避光下超音波震荡30分钟，并于室温下持续搅拌萃取2小时；之后，离心3000rpm，30分钟后，收集上清液；再将残渣重复于室温下持续搅拌萃取2小时；之后，离心3000rpm，30分钟后，收集上清液；合并收集2次萃取所得上清液，再以95％etoh定量至100ml，即制备得粗三萜之萃取液。
制作标准曲线，称取熊果酸(ursolicacid)标准品(sigma公司)以95％etoh配置5、10、25、100、250、500、1000g/ml之ursolicacid标准液；样品萃取液及95％etoh(对照组)各取出0.1ml，加入含有5％香兰素冰醋酸溶液0.15ml，震荡均匀；再加入过氯酸0.5ml，均匀震荡；各置于60℃水浴中45分钟，冷却5分钟后，加入2.25ml冰醋酸，震荡均匀；以可见光/紫外线光谱仪测定在548nm下的od值。
总三萜类含量计算公式：由熊果酸标准品浓度μg/ml所建立熊果酸标准曲线-回归方程式求出。
实施例1
一种模拟野生环境的产孢装置，该装置包括产孢罐1、木块放置框3、无菌空气扩散板2及孢子收集板4，所述产孢罐1上端设有密封盖10，所述木块放置框3设置至于产孢罐1内，所述木块放置框3的两侧分别设有无菌空气扩散板2和孢子收集板4；所述产孢罐1上设有营养液滴入口7、无菌空气系统通入口5、孢子输出口6；所述无菌空气扩散板2与无菌空气系统通入口5相通，所述无菌空气系统通入口5上设有空气控制阀12，所述孢子收集板4与孢子输出口6相通；所述孢子输出口6上设有压力控制阀13，所述营养液滴入口7与营养液输入系统相通，所述营养液滴入口7设置在产孢罐的密封盖10上，所述营养液滴入口7设有营养液滴入控制阀11；所述木块放置框3设有木块；所述产孢罐1的底部设有温度控制系统接入口8及加湿系统接入口9。其中无菌空气扩散板2为不锈钢板，呈半圆柱状，其靠近木块放置框3的切面均匀设有圆形孔状结构，每平方公分具有0.5平方公分的圆孔；所述孢子收集板4为不锈钢板呈椭半球形状，其靠近木块放置框3的切面均匀设有圆形孔状结构，每平方公分具有0.5平方公分的孔洞。
使用时，将产孢装置灭菌，在超净工作台中，将需要产孢的原生菌植入已灭菌的木块中，使木块平均吸附一定浓度的菌液，打开产孢罐的密封盖10，并将吸附有菌液的木块放入木块放置框3中，调节无菌空气系统通入口5上的空气控制阀12使无菌空气通过无菌空气扩散板进入产孢罐1中，调节营养液滴入口7上的有营养液滴入控制阀11控制营养液的流入速度，以加速原生菌的生长，同时可以通过温度控制系统接入口8控制产孢罐内温度，通过加湿系统接入口9控制产孢罐内的湿度，待原生菌产孢达到一定数量时，通过调整孢子输出口6上的压力控制阀13使孢子进入孢子收集板4并从孢子输出口6输出。
实施例2
1)在木块放置框中放置麦梗胜肽木块，所述麦梗胜肽木块的制作方法如下：将麦梗粉100g、薏仁提取物50g、玉米蛋白粉50g、麦芽提取物20g及麦芽糊精20g，加水760g，混合于木块成型模具内进行灭菌后冷却成型；
2)营养液输入系统装入灭菌后的液态培养基，其质量分数如下：2％薏仁提取物、5％麦芽糖及10％葡萄糖，余量为水；
3)在超净工作台中，将牛樟芝原生菌(ccrc35396)植入已灭菌的麦梗胜肽木块中，使麦梗胜肽表面平均吸附菌液达2×107cfu/cm2，并移入产孢罐的木块放置框中，调节无菌空气系统通入口上的空气控制阀使无菌空气通过无菌空气扩散板进入产孢罐中，调节营养液滴入口上的营养液滴入控制阀，控制营养液的的流入速度10毫升/小时，以加速原生菌的生长，同时控制产孢装置的温度28℃，湿度80％rh，待原生菌产孢达到107fcu/克时，通过调整孢子输出口上的压力控制阀使孢子进入孢子收集板并从孢子输出口输出，通入到meb培养基中，得孢子液态溶液。
实施例3(传统的制备牛樟芝孢子的实施例)
先取牛樟芝菌原生菌(ccrc35396)液1毫升滴入传统的mea平板培养基，28℃条件下进行牛樟芝平板培养7到14天后，再以接种环勾出牛樟芝菌丝置入meb液体培养液进行震荡培养5～10天。测定其孢子数后再以灭菌过的meb培养液进行稀释至孢子数在106cfu/ml，备用。
实施例4
(1)将实施例2中产孢装置制备得到的孢子液态溶液，分析其孢子数后，再以灭菌过的meb培养液稀释至106cfu/ml备用；
(2)将实施例3中制备得到的孢子液态溶液，以灭菌过的meb培养液稀释至106cfu/ml备用；
(3)将步骤(1)及(2)之牛樟芝孢子培养液各100ml置于28℃之振荡培养箱培养5天，每组均采用三个重复，每天各取1毫升以高倍显微镜观察及活菌计数法测定其孢子生长数量，分析均采用三个重复，相关结果见表1。
表1
单位：cfu/ml
从表1可以看出，本发明采用模拟野生环境的产孢装置培养的孢子较传统液体深层发酵产生的孢子，在培养1至5天期间总孢子量增加20-100倍，不但能够缩短牛樟芝液态发酵周期，亦能有效提高其生长速率及活性。
实施例5
(1)将实施例2中产孢装置制备得到的孢子液态溶液，分析其孢子数后，再以meb培养液稀释至106cfu/ml备用；
(2)将实施例3中制备得到的孢子液态溶液，以meb培养液稀释至106cfu/ml备用；
(3)将薏仁洗净沥干后称重100克移入500ml的三角烧瓶，再加入去离子水80ml经121℃30分钟高压灭菌，作为固态培养基，冷却后于无菌操作台内分别注入步骤(1)和(2)牛樟芝菌液5ml，每组均采用三个重复，移至28±1℃暗室培养20天，每10天取出1瓶进行分析，比较其多醣体及总三萜含量，分析均采用三个重复，相关结果见表2。
表2
单位：mg/g
由表2可知，采用实施例2获得的孢子进行固体培养，发酵10天及20天时，多醣体含量分别为127.6±13.2mg/g、263.8±16.5mg/g，三萜含量分别为41.2±0.9mg/g、81.3±1.8mg/g；采用实施例3获得的孢子进行固体培养，发酵10天及20天时，多醣体含量分别为61.3±17.2mg/g、87.6±14.6mg/g，三萜含量分别为27.1±1.3mg/g、51.2±2.3mg/g；结果表明：实施例2获得的孢子活性明显高于实施例3获得的孢子活性，显著提高了牛樟芝次生代谢产物的合成。
本发明实施例对本发明要求保护的技术范围中点值未穷尽之处以及在实施例技术方案中对单个或者多个技术特征的同等替换所形成的新的技术方案，同样都在本发明要求保护的范围内；同时本发明方案所有列举或者未列举的实施例中，在同一实施例中的各个参数仅仅表示其技术方案的一个实例(即一种可行性方案)，而各个参数之间并不存在严格的配合与限定关系，其中各参数在不违背公理以及本发明述求时可以相互替换，特别声明的除外。
本发明方案所公开的技术手段不仅限于上述技术手段所公开的技术手段，还包括由以上技术特征任意组合所组成的技术方案。以上所述是本发明的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。