一种细胞划痕装置和方法与流程

本发明属于细胞表型学、光热学技术领域，具体涉及一种细胞划痕装置和方法。

背景技术

细胞划痕实验可以监测贴壁细胞迁移能力变化情况，被广泛应用于细胞活性实验基础研究领域。细胞迁移能力增强往往是肿瘤细胞发生发展过程中的特征性表现，通过干扰细胞的迁移能力有利于控制肿瘤的转移，减慢肿瘤患者病情的发展及恶化。因此，细胞迁移实验是医学基础研究领域的重要手段，具有广泛的实用价值。

目前细胞迁移实验包括transwell小室实验及细胞划痕实验，前者是将一定数量的细胞悬浮于无血清培养基中加入transwell小室内，小室外为含有胎牛血清的完全培养基。细胞可通过小室底部微孔穿越至外侧。通过一定时间后对穿越至小室底部外侧的细胞进行计数可明确细胞的迁移能力变化情况。后者细胞划痕实验则是通过将贴壁细胞培养至80%左右的细胞密度时在底板划出等宽的细胞空白带，在无血清培养基的环境下培养细胞，观察细胞向空白带迁移生长的速度，比较空白带细胞覆盖的面积占原空白带的总百分比来明确实验各组细胞迁移能力的强弱。

transwell小室实验检测结果较为客观，准确性好易于操作被广泛应用。细胞接种过程中需要达到组间数量一致，细胞贴壁密度均匀一致是影响transwell小室实验结果的关键。此方法中transwell小室为一次性消耗品，费用较高，增加了实验成本。

然而传统的细胞划痕实验需要实验者在无菌条件下用枪头划出宽度相同，笔直的细胞空白带，技术存在如下技术缺陷：

（1）划痕时所用枪头较软，实验者操作时所用力度决定了细胞空白带宽度。能够在培养板中各小室底部划出相同宽度且笔直的细胞空白带有一定难度。

（2）划痕时枪头与直尺间的摩擦震动易导致手套、衣物、直尺等培养皿上方物体表面细菌掉落，极易发生污染，导致实验失败。

（3）细胞空白带的变化需要动态观察、拍片，但所选择的位置缺乏标记方法，导致每次寻找原观察位点需花费较长时间。

技术实现要素：

本项发明旨在为细胞迁移实验提供一种客观高效的细胞划痕激光装置及方法，使得细胞划痕的制备更加精确和易于控制。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种细胞划痕装置，其特征在于，包括激光源、温度传感器、移动装置、控制器，所述激光源固定设置移动装置上，用于垂直照射细胞培养板形成划痕，所述移动装置的控制端与控制器连接，所述温度传感器的信号输出端与控制器连接，所述温度传感器设置在细胞培养板上，所述控制器用于通过控制所述移动装置来控制所述激光源的移动速度。

所述激光源还包括准直透镜、光阑，聚光透镜，所述激光源发出的光束经准直透镜后形成平行光束，然后经光阑后形成横截面为正方形的平行光束，最后经聚光透镜后垂直入射到细胞培养板上。

所述的一种细胞划痕装置，还包括计时器，所述计时器用于记录激光源激光源照射到温度传感器时，温度传感器的温度上升到t所需的时间，所述t为细胞培养板划痕所需温度。

所述控制器用于控制所述移动装置，使所述激光源的移动速度为v=a/t，其中，a表示入射到细胞培养板的激光束的边长，t表示温度传感器的温度上升到划痕所需温度的时间。

本发明还提供了所述的一种细胞划痕装置的细胞划痕方法，包括以下步骤：

s1：将细胞培养板固定好；

s2、移动激光源，使激光源移动到激光出射方向垂直对准细胞培养板上温度传感器所在位置；

s3、记录激光照射在温度传感器上后，温度传感器温度上升到t所需的时间，所述t为细胞培养板划痕所需温度；

s4、移动激光源，使激光源移动到激光出射方向垂直对准细胞培养板上需要划痕位置，然后通过控制器驱动移动装置，使激光源以速度为v=a/t进行移动，其中，a表示入射到细胞培养板的激光束光斑的边长，t表示温度传感器的温度上升到划痕所需温度的时间。

所述的一种细胞划痕方法，还包括细胞培养平板的制备步骤：在细胞培养板的各个小室中接种细胞至贴壁，完全培养细胞生长密度达到-%；将小室内的培养基吸出，换pbs液清洗次，并吸出液体及漂浮细胞，加入无血清培养基继续培养观察。

所述步骤s2中，还包括以下步骤：通过聚光透镜调节入射到细胞培养板的激光光斑的大小，至光斑宽度与细胞划痕宽度相适应。

本发明与现有技术相比具有以下有益效果：

(1)本发明是电热学法，可以通过高温导致细胞受损死亡的原理，为提高细胞迁移实验效率以及疾病治疗提供更加可靠的手段和依据；

(2)本发明可以精确的控制细胞划痕的宽度，培养板中各小室的细胞划痕达到一致性，为实验的客观性、提高成功率提供保证。

(3)细胞划痕实验可告别单一直线划痕，改为“z”字形或“弓”字形等轨迹，便于标记寻找观察部位，整个操作过程简便易行，可通过控制光源移动轨迹即可。

附图说明

图1为本发明实施例提出的一种细胞划痕装置的结构示意图；

图2为应用本发明实施例提出的一种细胞划痕装置进行细胞划痕的示意图；

图中：1为移动装置，2为激光源，3为准直透镜，4为光阑，5为激光聚光镜，6为激光束，7为温度传感器，8为细胞培养板，9为控制器，10为激光束投射经过部位（细胞死亡），11为培养板底部细胞（细胞存活），12为培养板固定器。

具体实施方式

在对本发明进行介绍之前，首先对其设计原理进行说明。激光被称为“最快的刀”、“最准的尺”，其不易发生散射、路径中能量不易衰减。经激光聚光镜汇聚的光束可精准的投射到纳米级的面积范围内。通过控制照射部位的温度来调控激光光源移动控制器，进而使激光束按合适的速度移动。

可贴壁细胞是利用细胞表面糖蛋白结构与细胞培养皿底部及邻近细胞发生吸附。蛋白质在高温60~100℃下可发生变质，结构及功能发生改变导致与周围物质发生吸附的能力消失，随即发生脱离。高温状态下细胞会死亡发生破裂分解，也可导致细胞脱落。

本发明将上述设计原理、电激光热学技术与细胞划痕实验相结合，提供了一种能够精准形成细胞划痕的装置和方法。

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。

如图1所示，本发明实施例提出了一种细胞划痕装置，包括激光源2、温度传感器7、移动装置1、控制器9，所述激光源2固定设置移动装置1上，用于垂直照射细胞培养板8形成划痕，所述移动装置1的控制端与控制器9连接，所述温度传感器2的信号输出端与控制器9连接，所述温度传感器7设置在细胞培养板8上，所述控制器9用于通过控制所述移动装置1来控制所述激光源1的移动速度。

进一步地，如图1所示，所述激光源2还包括准直透镜3、光阑4，聚光透镜5，所述激光源发出的光束经准直透镜3后形成平行光束，然后经光阑4后形成横截面为正方形的平行光束，最后经聚光透镜5后垂直入射到细胞培养板8上。其中，光阑可以对光束的光斑形状进行调节，聚光透镜5可以将光束进行会聚，在细胞培养板上形成预期的光斑形状、大小，光束移动的形成边缘整齐，宽度一致的细胞死亡带，随即发生细胞裂解、脱落，形成实验所需的细胞空白带，空白带邻近的细胞可向空白带迁移生长。

进一步地，本实施例的一种细胞划痕装置，还可以包括计时器，所述计时器用于记录激光源2激光源照射到温度传感器7时，温度传感器7的温度上升到100℃所需的时间，100℃为细胞培养板划痕所需温度。

进一步地，本实施例中，所述控制器用于控制所述移动装置1，使所述激光源2的移动速度为v=a/t，其中，a表示入射到细胞培养板8的激光束的边长，t表示温度传感器的温度上升到划痕所需温度的时间。

其中，温度传感器可以采用一般的热电偶，通过热电偶探测温度，可以校准光源移动速度，激光束照射到细胞培养板8上后，温度传感器测量细胞培养板8的温度，当温度传感器探测到温度达到100℃（细胞变质所需温度）时，通过计时器精确记录照射时间t，该时间即为细胞培养板在激光束的照射下温度上升到100℃所需的照射时间，激光经准直透镜后形成平行光束，经光阑过滤光束形成横截面为正方形，其边长与光束移动方向平行或垂直，再经聚光凸透镜汇聚，在培养板底部形成实验所需的光斑，假设光斑边长为a，通过移动装置控制光束按照v=a/t的速度移动，确保照射部位温度达到100℃时恰好移走，终止照射，避免了细胞过度受热碳化，与培养板发生粘连，以及培养板发生变形，影响细胞增殖迁移。

其中，移动装置1可以为二维电动平移台，可以为其他具有自动二维平移功能装置。

其中，本实施例中，细胞培养板8由聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane，简称pdms)制作，其上形成有6到96个小室阵列，该材料在100℃以下不会发生变形、燃烧，而导热能力较差有利于防止热扩散，对邻近未照射部位细胞造成损害。

如图1所示，本实施例的一种细胞划痕装置还可以包括培养板固定器12，培养板固定器12上设置有凹槽，凹槽尺寸与细胞培养板尺寸一致，可根据常用培养板（长方形）及培养皿（圆形）底座形状设计不同形状凹槽及弹簧固定片，确保培养板位置固定，不易移动。传统培养板为向上开口的长方形大室，内含多孔底板为圆型的小室。本装置在结构上，完全适应现有的多孔板平台。可以理解的是，培养板小室的横截面形状不局限于长方形，其也可以是圆形，三角形等其他规则或不规则图形。并且，培养板小室的数量也可以是96、48、24、12、6等其他标准规格多孔板的孔的数量，或者是设计者规定的其他数量。

其中，激光源2可以选用超短脉冲激光，波长为1064nm，功率为100mw。其优点为可瞬间使光波照射部位温度升高，达到细胞划痕所需的100℃。几乎不存在热扩散对邻近细胞的损伤。激光源投射到细胞培养板的光斑大小，尺寸和形状都可以根据需要调节，光源可通过移动装置调控移动速度及移动方向，使照射部位受热温度为100℃。适用于单孔、多孔依次连续照射，便于后续实验需求。

如图2所示，通过移动装置1可以控制激光源的运动轨迹，通过设置移动装置的移动轨迹，即可以实现不同形状，如“z”字形或“弓”字形的细胞划痕，以使细胞划痕具有特殊的位置标记，便于对观察细胞空白带的变化。

此外，本发明还提供了上述细胞划痕装置的细胞划痕方法，包括以下步骤：

s1：将细胞培养板8固定好；

s2、移动激光源2，使激光源2移动到激光出射方向垂直对准细胞培养板8上温度传感器7所在位置；

s3、记录激光照射在温度传感器7上后，温度传感器7温度上升到t0所需的时间，所述t0为细胞培养板划痕所需温度；

s4、移动激光源2，使激光源2移动到激光出射方向垂直对准细胞培养板8上需要划痕位置，然后通过控制器9驱动移动装置1，使激光源2以速度为v=a/t进行移动，其中，a表示入射到细胞培养板8的激光束光斑的边长，t表示温度传感器的温度上升到划痕所需温度的时间。

进一步地，所述的一种细胞划痕方法，还包括细胞培养平板的制备步骤：在细胞培养板的各个小室中接种细胞至贴壁，完全培养细胞生长密度达到80~90%；将小室内的培养基吸出，换pbs液（kcl0.2g，nacl8g，kh2po40.27g，na2hpo4·h2o1.42g，按上述质量称取各组分，溶于约800ml三蒸水，充分溶解；滴加浓盐酸调节ph值至7.2-7.4；加入去离子水定容至1l；灭菌分装后，4℃冰箱内存储备用）清洗2次，并吸出液体及漂浮细胞，加入无血清培养基继续培养观察。

进一步地，所述步骤s2中，还包括以下步骤：通过聚光透镜5调节入射到细胞培养板8的激光光斑的大小，至光斑宽度与细胞划痕宽度相适应。

其中，所述步骤s3中，需要记录激光照射在温度传感器7上后，温度传感器7温度上升到100摄氏度所需的时间。

上述实施例以可以精准的在贴壁细胞培养板上形成细胞空白带后进行细胞迁移实验为例进行说明，其大通量、易于调控、客观精确、方便快捷的特点具有独特的优势。综上所述，本发明提供了一种用于细胞划痕实验的设备，其一次可以实现多组的平行实验，通量高，易于标记，从而大大提高了实验者的操作效率，具有较好的应用前景。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。