6-氟硼二吡咯酰胺-吲哚类化合物、制备方法及作为荧光探针检测活细胞多核化的方法与流程

本发明属于生物技术及化学领域，涉及一类6-氟硼二吡咯酰胺-吲哚类化合物、制备方法及作为荧光探针检测活细胞多核化的方法。

背景技术

细胞多核化是指一个细胞质中同时存在两个或多个细胞核的现象，细胞多核化的现象存在于细胞的病理和生理状态。细胞多核化现象的形成是由于细胞的染色体进行了复制，但是在细胞分裂的过程中，由于染色体的异常运动，而形成了不同大小的细胞核，或者复制后的细胞核没有进行正确的分离而共存于一个细胞中。通常的情况下，除了主要细胞核，其他的滞后染色体也与核包膜结合，其形态上类似但小于主要细胞核，它们被称为微核。异常的细胞分裂或融合会产生多核细胞，任何阻断细胞分裂进程的因素都可诱导细胞多核化，如涉及细胞分裂的基因突变和功能障碍，以及可以抑制细胞分裂的化合物，如细胞松弛素b和紫杉醇，都可以造成细胞多核化现象。

细胞多核化与染色体的不稳定性密切相关，细胞多核化与多种疾病相关。多核化的巨型细胞与慢性炎症有关，如细菌或者病毒等传染源可以诱导宿主细胞的多核化。细胞多核化与染色体的不稳定性和癌症的产生和发展密切相关，细胞的多核化在实体肿瘤中非常常见。另外，污染的环境也可以造成细胞的多核化现象，所以在公共卫生领域经常需要测定日常使用的日化品是否能够造成细胞的染色体不稳定，其表现的现象就是细胞多核化。

目前评估细胞多核化的方法具有一定的缺陷性。通常研究者采用多种细胞核染色方法如姬姆萨、苏木精，来确定细胞的多核化。这些方法适用于固定的细胞，但是在染色的过程中，细胞边缘往往是模糊不清，难以判断。另一种方法，采用细胞核荧光染料染色，如dapi，hoechst染料，已经被用于观察活细胞的多核化。在这一方法中，核荧光的成像与明场细胞图像中叠加，操作起来比较复杂，并且明场下细胞通常是透明的，细胞边缘比较难以确定。这些都影响了细胞多核化的判定。

正确的评估检测细胞多核化现象具有重要的社会意义。无论是临床检测评估肿瘤细胞中的多核化状态，或者是评估检测环境污染对于细胞多核化的诱导产生作用，这都需要一种能够快速评估检测细胞多核化的实验方法。一个好的细胞多核化检测方法应该是经济、简便、快速、灵敏、精确和具有普适性。目前市场上的细胞多核化的检测方法都不能满足上述所有要求。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是，提供一种6-氟硼二吡咯酰胺-吲哚类化合物、制备方法及作为荧光探针检测活细胞多核化的方法，该类化合物具有低细胞毒性并较快穿透活细胞的细胞膜，特异性地对活细胞细胞质进行荧光染色的特点。相比较，这类化合物不能染细胞核，所以在荧光激发下细胞核形成了一个一个的空洞，从而能够用于检测评估活细胞中细胞多核化的现象。

本发明采用如下技术方案实现的：

本发明的化合物是具体下面通式所示的6-氟硼二吡咯酰胺-吲哚类化合物。

(ｉ)

其中，r选自甲基、乙基、丙基、丁基或戊基。

本发明涉及的一部分6-氟硼二吡咯酰胺-吲哚类化合物的名称和结构式列在下表中。

。

本发明还提供通式i所示的化合物的制备方法，反应式如下。

反应条件：(a),pocl3,dcm（二氯甲烷）;tea（三乙胺）,bf3·et2o（乙醚）；(b),2m（mol/l）hcl,h2o/meoh（甲醇）,2h,60^oc;(c),et3n（三乙胺），dmf（二甲基甲酰胺）,rt。

具体而言，首先制备中间体1和2：

步骤(a)中,将3,5-二甲基吡咯-2-甲醛和2,4-二甲基吡咯-3-甲氰溶于无水dcm中，在0^oc氩气保护下搅拌9-15分钟，慢慢加入pocl3；反应在0^oc进行1-1.5小时之后，在25^oc进行4-5个小时；加入干tea，14-18分钟后滴加bf3·et2o；将反应混合物加热至50-53^oc，搅拌2-2.5小时；将反应混合物用旋转蒸发仪蒸干，并使用etoac萃取，然后用h2o洗涤并用na2so4干燥；粗产物通过硅胶柱色谱法纯化，得到红色粉末的产物。

步骤(a)中,将3,5-二甲基吡咯-2-甲醛和2,4-二甲基吡咯-3-甲氰溶于无水dcm中，在0^oc氩气保护下搅拌10分钟，慢慢加入pocl3；反应在0^oc进行1小时之后，在25^oc进行4个小时；加入干tea，15分钟后滴加bf3·et2o；将反应混合物加热至50^oc，搅拌2小时；将反应混合物用旋转蒸发仪蒸干，并使用etoac萃取，然后用h2o洗涤并用na2so4干燥；粗产物通过硅胶柱色谱法纯化，得到红色粉末的产物。

步骤(b)中,将中间体1溶于体积比1：1的水/meoh溶剂中，滴加入浓盐酸，加热至60-65^oc搅拌2-2.5小时；将反应产物通过柱层析进行分离纯化得到中间体2为红色固体的产物。

步骤(b)中,将中间体1溶于体积比1：1的水/meoh溶剂中，滴加入浓盐酸，加热至60^oc搅拌2小时；将反应产物通过柱层析进行分离纯化得到中间体2为红色固体的产物。

步骤(c)中,将中间体2与各种n-取代的6-氨基吲哚溶解于溶剂二甲基甲酰胺dmf中，加入三乙胺，室温下搅拌2-2.5个小时；终止反应，采用dcm溶解反应混合物，用碳酸氢钠溶液洗涤，饱和氯化钠溶液洗涤，水洗洗涤，加入硫酸钠干燥除水，反应混合物通过柱层析进行分离纯化得到最终的6-氟硼二吡咯酰胺-吲哚类化合物探针。

步骤(c)中,将中间体2与各种n-取代的6-氨基吲哚溶解于溶剂二甲基甲酰胺dmf中，加入三乙胺，20-26^oc下搅拌2个小时；终止反应，采用dcm溶解反应混合物，用碳酸氢钠溶液洗涤，饱和氯化钠溶液洗涤，水洗洗涤，加入硫酸钠干燥除水，反应混合物通过柱层析进行分离纯化得到最终的6-氟硼二吡咯酰胺-吲哚类化合物探针。

本发明的6-氟硼二吡咯酰胺-吲哚类化合物，作为荧光探针在检测活细胞多核化现象的应用，所述化合物为活细胞细胞质定位的特异性荧光探针；检测活细胞多核化的方法包括以下步骤：

（1），培养的肿瘤细胞采用0.1微摩尔/升的紫杉醇处理过夜可以造成染色质的不正常迁移，造成细胞多核化现象；

（2），向需要检测的细胞样品中加入10微摩尔/升的荧光染料共同孵育10分钟；（3），进行没有结合染料的洗脱；由于培养的肿瘤细胞附着在培养板上，通过洗脱漂洗掉未结合的染料后；

（4），用荧光显微镜，对于所述的染料采用蓝色荧光激发，对肿瘤细胞进行直接的观察。

步骤（2）中，所述化合物溶于二甲亚砜中，将其加入到细胞样品的培养基中至终浓度为10微摩尔/升，染色10分钟；步骤（3）中，采用ph为7.4的磷酸盐缓冲液洗脱没有吸收的荧光探针。

本发明的染色原理如下。

本发明的目的在于提供一种细胞质特异性染色的荧光探针从而建立一种检测活细胞多核化现象的方法。此方法经济、简单、准确、具有普适性，可用于大量样本的检测。

活细胞的生理功能相对稳定，荧光探针进入活细胞后，表现为细胞质的荧光染色，细胞核没有荧光染色。其细胞生理学方面的解释为：由于活细胞的生理功能相对稳定，荧光染料在活细胞内聚集到一个较低的浓度便趋于饱和，荧光染料在细胞质内与胞内蛋白进行结合，从而阻止了荧光染料穿过核孔复合体从而进入细胞核内。因此，本试验中的荧光探针对于活细胞染色结果为：细胞核没有荧光，细胞质特异性的荧光染色。图1显示了本发明专利中的5个化合物进行的活肿瘤细胞染色，只进行细胞质的荧光染色，细胞核步进行荧光染色。

细胞多核化现象的形成是由于细胞的染色体进行了复制，但是在细胞分裂的过程中，由于染色体的异常运动，而形成了不同大小的细胞核，或者复制后的细胞核没有进行正确的分离而共存于一个细胞中。通常的情况下，除了主要细胞核，其他的滞后染色体也与核包膜结合，其形态上类似但小于主要细胞核，它们被称为微核。在多核化的细胞内，无论是主要的细胞核或者各种微核均是具有核膜包裹的状态。上述荧光探针作为一种优良的细胞质定位荧光探针，在细胞质内与胞浆蛋白进行结合，不能进入到细胞核中，这里既包括主要的细胞核，也包括各种微核。所以荧光探针能够非常清晰地展示出细胞多核化的现象。图2显示了本发明专利中的5个化合物显示的细胞多核化现象。

本试验方法中采用细胞质特异性定位荧光染料来进行细胞染色，有效地展示细胞多核化现象，从而在荧光显微镜下可以观察到活细胞的多核化现象。本试验方法对于细胞的染色只需要10分钟，即可以在荧光显微镜下观察到活细胞的多核化现象。

本发明的进行生物学操作的技术方案如下：利用特异性的细胞质荧光染料（表1），该染料在活细胞内只分布于细胞质，不能进行细胞核的染色。荧光探针与细胞孵育之后，在洗脱后可以观察到细胞质内的细胞核的具体形态（如图2所示）。

术语和简称：

“6-氟硼二吡咯酰胺”是指6-(1’，3’，7’，9’-四甲基-氟硼二吡咯)酰胺。

本发明的有益效果是，本发明设计了一类6-氟硼二吡咯酰胺-吲哚类化合物，该类化合物具有对活细胞的细胞质特异性染色，不进入活细胞的细胞核。通过荧光显微镜对细胞进行荧光成像，进而可以清晰地观察到细胞核多核化的现象，并进行评价。本发明的制备方法和检测方法经济、简便、快速、灵敏、精确和具有普适性，涉及的细胞多核化检测方法具有操作简单，检测结果准确并且成本低廉的优点。

该类化合物具有低细胞毒性并较快穿透活细胞的细胞膜，特异性地对活细胞细胞质进行荧光染色的特点。相比较，这类化合物不能染细胞核，所以在荧光激发下细胞核形成了一个一个的空洞，从而能够用于检测评估活细胞中细胞多核化的现象。

该类化合物的结构是以6-氟硼二吡咯酰胺-吲哚母核为基础设计合成的一系列分子探针。由于氟硼二吡咯环的存在，这类化合物具有优良的荧光特性；同时该类化合物具有较高的脂溶性,可以快速渗透到活细胞中，形成特征鲜明的细胞质染色而细胞核不染色的荧光图像，从而可以清晰地呈现出活细胞中细胞核的具体形态和数目。尤其是可以精确呈现出细胞多核化的具体形态和数目。众所周知，细胞多核化现象与基因组不稳定性密切相关，所以细胞多核化现象频繁出现在基因突变的肿瘤细胞中；另外，污染的外界环境也能诱导正常细胞慢慢发生基因突变，以至于出现多核化现象。综上所述，这类荧光探针能够用于检测和评估生物医学和环境检测相关行业中由于染色体不稳定而出现多核化现象的活细胞。

附图说明

图1：本发明专利中的5个化合物进行的活肿瘤细胞染色。

图2：本发明专利中的5个化合物展现活细胞多核化现象。

具体实施方式

实施例1（制作中间体1和2）

步骤（a），将3,5-二甲基吡咯-2-甲醛(100mg,0.81mmol）和2,4-二甲基吡咯-3-甲氰(89mg,0.74mmol)溶于无水dcm(15ml)中，在0^oc氩气保护下搅拌10分钟，慢慢加入pocl3(124mg,0.81mmol)。反应在0^oc进行1小时之后，在25^oc进行4个小时。加入干tea(750mg,7.4mmol)，15分钟后滴加bf3·et2o(0.93ml,7.4mmol)。将反应混合物加热至50^oc，搅拌2小时。将反应混合物用旋转蒸发仪蒸干，并使用etoac(200ml)萃取，然后用h2o(3×50ml)洗涤并用na2so4干燥。粗产物通过硅胶柱色谱法(石油醚/etoac5:1)纯化，得到红色粉末的产物，产率为54%。

¹hnmr(400mhz,cdcl3):δ=2.30(s,3h),2.36(s,3h),2.59(s,3h),2.62(s,3h),6.23(s,1h),7.13(s,1h).hrms(esi):m/z[m+h]计算c14h15n3bf2:274.13216;获得数据:274.13153。

步骤（b），将中间体1(55mg，0.2mmol)溶于5ml的水/meoh(1：1)溶剂中，滴加入浓盐酸至终浓度为2m，加热至60^oc搅拌2小时。将反应产物通过柱层析进行分离纯化得到中间体2为红色固体，产率为32%。

¹hnmr(400mhz,cdcl3):δ=2.31(s,3h),2.34(s,3h),2.61(s,3h),2.65(s,3h),6.25(s,1h),7.43(s,1h),11.02(s,1h).hrms(esi):m/z[m+h]计算c14h16n2o2bf2:293.1273;获得数据:273.1312。

实施例2（制作中间体1和2）

步骤（a），将3,5-二甲基吡咯-2-甲醛(100mg,0.81mmol）和2,4-二甲基吡咯-3-甲氰(89mg,0.74mmol)溶于无水dcm(15ml)中，在0^oc氩气保护下搅拌15分钟，慢慢加入pocl3(124mg,0.81mmol)。反应在0^oc进行1.5小时之后，在28^oc进行4.5个小时。加入干tea(750mg,7.4mmol)，20分钟后滴加bf3·et2o(0.93ml,7.4mmol)。将反应混合物加热至53^oc，搅拌2.5小时。将反应混合物用旋转蒸发仪蒸干，并使用etoac(200ml)萃取，然后用h2o(3×50ml)洗涤并用na2so4干燥。粗产物通过硅胶柱色谱法(石油醚/etoac5:1)纯化，得到红色粉末的产物，产率为53%。

¹hnmr(400mhz,cdcl3):δ=2.30(s,3h),2.36(s,3h),2.59(s,3h),2.62(s,3h),6.23(s,1h),7.13(s,1h).hrms(esi):m/z[m+h]计算c14h15n3bf2:274.13216;获得数据:274.13153。

步骤（b），将中间体1(55mg，0.2mmol)溶于5ml的水/meoh(容积1：1)溶剂中，滴加入浓盐酸至终浓度为2m，加热至65^oc搅拌2.5小时。将反应产物通过柱层析进行分离纯化得到中间体2为红色固体，产率为33%。

¹hnmr(400mhz,cdcl3):δ=2.31(s,3h),2.34(s,3h),2.61(s,3h),2.65(s,3h),6.25(s,1h),7.43(s,1h),11.02(s,1h).hrms(esi):m/z[m+h]计算c14h16n2o2bf2:293.1273;获得数据:273.1312。

实施例3（制作中间体1和2）

步骤（a），将3,5-二甲基吡咯-2-甲醛(100mg,0.81mmol）和2,4-二甲基吡咯-3-甲氰(89mg,0.74mmol)溶于无水dcm(15ml)中，在0^oc氩气保护下搅拌9分钟，慢慢加入pocl3(124mg,0.81mmol)。反应在0^oc进行1.2小时之后，在24^oc进行4.2个小时。加入干tea(750mg,7.4mmol)，14分钟后滴加bf3·et2o(0.93ml,7.4mmol)。将反应混合物加热至52^oc，搅拌2.2小时。将反应混合物用旋转蒸发仪蒸干，并使用etoac(200ml)萃取，然后用h2o(3×50ml)洗涤并用na2so4干燥。粗产物通过硅胶柱色谱法(石油醚/etoac5:1)纯化，得到红色粉末的产物，产率为52%。

¹hnmr(400mhz,cdcl3):δ=2.30(s,3h),2.36(s,3h),2.59(s,3h),2.62(s,3h),6.23(s,1h),7.13(s,1h).hrms(esi):m/z[m+h]计算c14h15n3bf2:274.13216;获得数据:274.13153。

步骤（b），将中间体1(55mg，0.2mmol)溶于5ml的水/meoh(容积1：1)溶剂中，滴加入浓盐酸至终浓度为2m，加热至62^oc搅拌2.2小时。将反应产物通过柱层析进行分离纯化得到中间体2为红色固体，产率为31%。

¹hnmr(400mhz,cdcl3):δ=2.31(s,3h),2.34(s,3h),2.61(s,3h),2.65(s,3h),6.25(s,1h),7.43(s,1h),11.02(s,1h).hrms(esi):m/z[m+h]计算c14h16n2o2bf2:293.1273;获得数据:273.1312。

实施例4：6-氟硼二吡咯酰胺-n-甲基-吲哚的合成方法。

称取中间体2(58毫克,0.2毫摩尔)和6-氨基-n-甲基吲哚(30毫克,0.2毫摩尔)溶解于2毫升dmf中，缓慢滴入1.2eq的0.24毫摩尔的三乙胺，室温搅拌2小时。采用10毫升dcm溶解反应混合物，分别用10毫升的碳酸氢钠洗涤两次，10毫升饱和氯化钠洗两次，10毫升水洗两次。加入硫酸钠去除水，经过柱层析得到6-氟硼二吡咯酰胺-n-甲基-吲哚，产率为63%。

化合物的鉴定数据如下：

1hnmr(400mhz,cdcl3):δ=2.30(s,3h),2.33(s,3h),2.60(s,3h),2.64(s,3h),3.35(s,3h),6.25(s,1h),7.01-7.14(m,3h),7.28-7.46(m,3h),8.56(m,1h)；

hrms(esi):m/z[m+h]计算c23h24bf2n4o:421.2011;获得数据：421.1999。

实施例5：6-氟硼二吡咯酰胺-n-乙基-吲哚的合成方法。

称取中间体2(58毫克,0.2毫摩尔)和6-氨基-n-乙基吲哚(32毫克,0.2毫摩尔)溶解于2毫升dmf中，缓慢滴入1.2eq的0.24毫摩尔的三乙胺，20^oc搅拌2.5小时。采用10毫升dcm溶解反应混合物，分别用10毫升的碳酸氢钠洗涤两次，10毫升饱和氯化钠洗两次，10毫升水洗两次。加入硫酸钠去除水，经过柱层析得到6-氟硼二吡咯酰胺-n-乙基-吲哚，产率为43%。

化合物的鉴定数据如下：

1hnmr(400mhz,cdcl3):δ=1.05(t,j=8.0hz,3h),2.31(s,3h),2.34(s,3h),2.63(s,3h),2.65(s,3h),3.80(m,2h),6.25(s,1h),7.03-7.15(m,3h),7.31-7.41(m,3h),8.50(m,1h)；

hrms(esi):m/z[m+h]计算c24h26bf2n4o:435.2168;获得数据:435.2177。

实施例6：6-氟硼二吡咯酰胺-n-丙基-吲哚的合成方法。

称取中间体2(58毫克,0.2毫摩尔)和6-氨基-n-丙基吲哚(35毫克,0.2毫摩尔)溶解于2毫升dmf中，缓慢滴入1.2eq的0.24毫摩尔的三乙胺，26^oc搅拌2.2小时。采用10毫升dcm溶解反应混合物，分别用10毫升的碳酸氢钠洗涤两次，10毫升饱和氯化钠洗两次，10毫升水洗两次。加入硫酸钠去除水，经过柱层析得到6-氟硼二吡咯酰胺-n-丙基-吲哚，产率为51%。

化合物的鉴定数据如下：

1hnmr(400mhz,cdcl3):δ=0.88(t,j=8.0hz,3h),1.99-2.05(m,2h),2.31(s,3h),2.33(s,3h),2.63(s,3h),2.65(s,3h),3.67-3.71(m,2h),6.25(s,1h),6.84-7.09(m,3h),7.29-7.39(m,3h),8.37-8.40(m,1h)；

hrms(esi):m/z[m+h]计算c25h28bf2n4o:449.2324;获得数据:449.2423。

实施例7：6-氟硼二吡咯酰胺-n-丁基-吲哚的合成方法。

称取中间体2(58毫克,0.2毫摩尔)和6-氨基-n-丁基吲哚(37毫克,0.2毫摩尔)溶解于2毫升dmf中，缓慢滴入1.2eq的0.24毫摩尔的三乙胺，23^oc搅拌2小时。采用10毫升dcm溶解反应混合物，分别用10毫升的碳酸氢钠洗涤两次，10毫升饱和氯化钠洗两次，10毫升水洗两次。加入硫酸钠去除水，经过柱层析得到6-氟硼二吡咯酰胺-n-丁基-吲哚，产率为37%。

化合物的鉴定数据如下：

1hnmr(400mhz,cdcl3):δ=0.88(t,j=8.0hz,3h),1.39-1.43(m,2h),1.62-1.65(m,2h),2.31(s,3h),2.33(s,3h),2.63(s,3h),2.65(s,3h),3.68-3.72(m,2h),6.25(s,1h),7.29-7.42(m,3h),8.11-8.16(m,3h),8.39-8.44(m,1h)；

hrms(esi):m/z[m+h]计算c26h30bf2n4o:463.2481;获得数据:463.2455。

实施例8：6-氟硼二吡咯酰胺-n-戊基-吲哚的合成方法。

称取中间体2(58毫克,0.2毫摩尔)和6-氨基-n-戊基吲哚(40毫克,0.2毫摩尔)溶解于2毫升dmf中，缓慢滴入1.2eq的0.24毫摩尔的三乙胺，室温搅拌2小时。采用10毫升dcm溶解反应混合物，分别用10毫升的碳酸氢钠洗涤两次，10毫升饱和氯化钠洗两次，10毫升水洗两次。加入硫酸钠去除水，经过柱层析得到6-氟硼二吡咯酰胺-n-戊基-吲哚，产率为45%。

化合物的鉴定数据如下：

1hnmr(400mhz,cdcl3):δ=0.89(t,j=8.0hz,3h),1.36-1.45(m,2h),1.74-2.02(m,4h),2.31(s,3h),2.33(s,3h),2.63(s,3h),2.65(s,3h),3.67-3.70(m,2h),6.25(s,1h),7.30-7.42(m,3h),8.11-8.15(m,3h),8.57-8.68(m,1h)；

hrms(esi):m/z[m+h]计算c27h32bf2n4o:477.2637;获得数据：477.2546。

实施例9、筛选上述5个荧光探针在活细胞的细胞质特异性荧光定位染色

将上述5个化合物分别溶于二甲亚砜中，将其分别加入到hepg2细胞的培养基中至终浓度为10微摩尔/升，染色10分钟后，采用ph为7.4的磷酸盐缓冲液洗脱没有吸收的荧光探针。在荧光显微镜下观察，如图1所示，所有的荧光探针均表现出细胞质特异性的荧光染色。01：6-氟硼二吡咯酰胺-n-甲基-吲哚；02：6-氟硼二吡咯酰胺-n-乙基-吲哚；03：6-氟硼二吡咯酰胺-n-丙基-吲哚；04：6-氟硼二吡咯酰胺-n-丁基-吲哚；05：6-氟硼二吡咯酰胺-n-戊基-吲哚。

实施例10、采用荧光探针化合物6-氟硼二吡咯酰胺-n-戊基-吲哚检测活细胞多核化现象的实验验证。

上述五个荧光探针均可以作为细胞多核化检测的试剂，在此我们展示6-氟硼二吡咯酰胺-n-戊基-吲哚的染色结果，其结果与其它四个探针效果相似。采用细胞毒性药物紫杉醇(0.1微摩尔/每升)分别处理肿瘤细胞株-hepg2细胞8个小时，使得hepg2细胞的染色质发生不正常迁移，表现为细胞多核化现象。在这种情况下，采用10微摩尔/升6-氟硼二吡咯酰胺-n-戊基-吲哚荧光探针对活细胞进行染色10分钟，观察细胞多核化的情况：在荧光显微镜下，活细胞为细胞质荧光染色，细胞质中的多个小细胞核没有进行荧光着色，所以可以清楚的观察到细胞多核化的状态(图2)。