本发明涉及生物制药领域，尤其是一种快速高效制备高纯度神经节苷脂的方法。
背景技术：
神经节苷脂是最复杂的鞘糖脂，微量地存在于脊椎动物几乎所有的组织中，但在哺乳动物的大脑和脊髓组织中含量最高，约含0.3％左右。目前GM1纯化以常压硅胶柱为主，例如，中国专利公开了一种提取分离神经节苷脂的方法，申请号：201510598064.0，申请日：
2015.09.18，它包括三个步骤：1、将哺乳动物神经组织置于醇溶剂中加热搅拌回流提取，然后提取液经搅拌降温，过滤获得含有神经节苷脂成分的沉淀物I；2、沉淀物I加热溶解于有机溶剂I中，并维持加热温度在搅拌条件下进行杂质吸附，过滤所得溶液经浓缩后用丙酮低温沉淀，过滤获得富集神经节苷脂成分的沉淀物II；3、沉淀物II用有机溶剂II加热搅拌洗涤，滤得沉淀为神经节苷脂，该方法成本较低，但是存在生产周期长，收率偏低的问题，急需一种提取速度快、提取纯度高和生产效率高的制备神经节苷脂的方法。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明提供一种提取纯度高、提取速度快、步骤简单的度神经节苷脂的方法。
一种快速高效制备高纯度神经节苷脂的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
步骤A：猪脑提取物的提取；所述猪脑粗提物提取包括以下步骤：
A1：提取步骤：将绞碎后的鲜猪脑和提取液加入提取罐中，所述鲜猪脑和提取液的质量浓度比为1：(3-5)，搅拌20-30分钟，静置分层30-40分钟，然后压滤，压滤完成后收集上清液和滤液，所述提取液包括氯仿和甲醇，所述氯仿和甲醇的比例为1：(1-3)；
A2：分层步骤：将步骤A1收集到的滤液加入滤液体积20％-30％的饮用水，搅拌5-15分钟后静置10-15小时，分层后收集上清液；
A3：皂化步骤：将步骤A1中的上清液和步骤A2中的上清液混合，得到混合物，加入混合物体积0.2％-0.4％的氢氧化钠固体于分层水解罐中，控制温度在60±5℃之间，搅拌30-40分钟得到水解液；
A4：树脂层析步骤：将步骤A3所得的水解液通过大孔树脂，先用2倍柱体积的水冲洗树脂，再用2倍柱体积的50％甲醇溶液冲洗树脂，最后用甲醇洗脱，洗脱完成后收集洗脱液；
A5：酸水解步骤：将步骤A4中所得的洗脱液进行浓缩，得到浓缩液，然后将浓缩液和盐酸置于容器中调节PH值，使容器中浓缩液的PH值达到3.5-4.0，得到浓缩液A，再将浓缩液A加热至80℃后搅拌2小时，冷却至室温，得到浓缩液B，并向浓缩液B中加入饱和NaOH调节PH值，使容器中的浓缩液PH值达到7.0-9.0，获得浓缩液C；所述盐酸浓度为6-8mol/l；
A6：丙酮沉淀过滤、干燥：将步骤A5中所得的浓缩液C和丙酮置于容器内进行搅拌均匀，然后置于-10℃～-15℃的温度条件下静置沉淀，沉淀时间为4-6小时，得到丙酮沉淀液，并对丙酮沉淀液进行真空抽滤，得到滤饼，然后将滤饼放入真空干燥箱进行干燥，获得猪脑粗提物；所述浓缩液C和丙酮质量浓度比为1：(4-6)；
步骤B：GM1硅胶层析纯化步骤：将100-200目硅胶装柱后压柱，取步骤A所得的猪脑粗提物用流动相溶解后上样，所述流动相包括三氯甲烷、甲醇和水，再用流动相高压洗脱，在线检测收集GM1洗脱液，将GM1洗脱液浓缩至无有机溶剂，得到GM1浓缩液；
步骤C：阳离子树脂纯化：将阳离子树脂用纯水清净，然后将阳离子树脂用盐酸溶液浸泡3-5h，浸泡完毕后用纯水将阳离子树脂清洗至中性，所述盐酸的浓度为4％-6％，然后加入纯水浸泡，搅拌，装柱，避免气泡进入柱中，将步骤B中所得的GM1浓缩液进行上样，上样流速为5BV/h，然后用1BV的纯水洗脱，收集洗脱液，然后向洗脱液中加入饱和氢氧化钠溶液调节pH值，使洗脱液pH值达到5.0-7.0，用30k中空纤维超滤膜超滤，补加一倍体积纯水，超滤至截留溶液小于洗脱液的1/2后，加入10倍量的丙酮，置于-10℃～-15℃的温度条件下静置沉淀，静置沉淀时间为10-20小时，得到沉淀液，将沉淀液真空抽滤，抽滤后得到的滤饼放入真空干燥箱干燥，得到本发明神经节苷脂。
所述步骤B中三氯甲烷、甲醇和水的体积比为70∶40∶5。
本发明的有益效果为：本发明采用热提取的方法提取神经节苷脂，大大提高了提取效率，不仅通过酸水解将GM1含量提高一倍以上，而且利用高压系统进行硅胶纯化，大大缩短了纯化时间，同时提高了分离效率，既实现了GM1与杂质的快速有效分离，又可以实现在线检测，无需事后点板检测，使生产效率大幅提高，并且还通过阳离子树脂层析去除影响注射剂澄明度物质，使处理后不良反应发生率大大降低。
具体实施方式
本领域技术人员应理解，以下实施例中所公开的技术代表本发明人发现的在本发明的实践中发挥良好作用的技术。然而，在所公开的具体实施方案中可以做出许多改变，并仍然获得相同或相似的结果，而不脱离本发明的精神和范围。
实施例1：
本发明一种快速高效制备高纯度神经苷脂的方法的具体步骤为：
一种快速高效制备高纯度神经节苷脂的方法，所述方法包括以下步骤：
步骤A：猪脑提取物的提取；所述猪脑粗提物提取包括以下步骤：
A1：提取步骤：将绞碎后的鲜猪脑和提取液加入提取罐中，所述鲜猪脑和提取液的质量浓度比为1：3，搅拌20分钟，静置分层30分钟，然后压滤，压滤完成后收集上清液和滤液，所述提取液包括氯仿和甲醇，所述氯仿和甲醇的比例为1：2；
A2：分层步骤：将步骤A1收集到的滤液加入滤液体积20％的饮用水，搅拌5分钟后静置10小时，分层后收集上清液；
A3：皂化步骤：将步骤A1中的上清液和步骤A2中的上清液混合，得到混合物，加入混合物体积0.2％的氢氧化钠固体于分层水解罐中，控制温度在60℃之间，搅拌30分钟得到水解液；
A4：树脂层析步骤：将步骤A3所得的水解液通过大孔树脂，先用2倍柱体积的水冲洗树脂，再用2倍柱体积的50％甲醇溶液冲洗树脂，最后用甲醇洗脱，洗脱完成后收集洗脱液；
A5：酸水解步骤：将步骤A4中所得的洗脱液进行浓缩，得到浓缩液，然后将浓缩液和盐酸置于容器中调节PH值，使容器中浓缩液的PH值达到3.5，得到浓缩液A，再将浓缩液A加热至80℃后搅拌2小时，冷却至室温，得到浓缩液B，并向浓缩液B中加入饱和NaOH调节PH值，使容器中的浓缩液PH值达到7.0，获得浓缩液C；所述盐酸浓度为6mol/l；
A6：丙酮沉淀过滤、干燥：将步骤A5中所得的浓缩液C和丙酮置于容器内进行搅拌均匀，然后置于-10℃的温度条件下静置沉淀，沉淀时间为4小时，得到丙酮沉淀液，并对丙酮沉淀液进行真空抽滤，得到滤饼，然后将滤饼放入真空干燥箱进行干燥，获得猪脑粗提物；所述浓缩液C和丙酮质量浓度比为1：4；
步骤B：GM1硅胶层析纯化步骤：将100-200目硅胶装柱后压柱，取步骤A所得的猪脑粗提物用流动相溶解后上样，所述流动相包括三氯甲烷、甲醇和水，再用流动相高压洗脱，在线检测收集GM1洗脱液，将GM1洗脱液浓缩至无有机溶剂，得到GM1浓缩液；
步骤C：阳离子树脂纯化：将阳离子树脂用纯水清净，然后将阳离子树脂用盐酸溶液浸泡3h，浸泡完毕后用纯水将阳离子树脂清洗至中性，所述盐酸的浓度为4％，然后加入纯水浸泡，搅拌，装柱，避免气泡进入柱中，将步骤B中所得的GM1浓缩液进行上样，上样流速为5BV/h，然后用1BV的纯水洗脱，收集洗脱液，然后向洗脱液中加入饱和氢氧化钠溶液调节pH值，使洗脱液pH值达到5.0，用30k中空纤维超滤膜超滤，补加一倍体积纯水，超滤至截留溶液小于洗脱液的1/2后，加入10倍量的丙酮，置于-10℃的温度条件下静置沉淀，静置沉淀时间为10小时，得到沉淀液，将沉淀液真空抽滤，抽滤后得到的滤饼放入真空干燥箱干燥，得到本发明神经节苷脂。
所述步骤B中三氯甲烷、甲醇和水的体积比为65∶30∶4。
实施例2
一种快速高效制备高纯度神经节苷脂的方法，所述方法包括以下步骤：
步骤A：猪脑提取物的提取；所述猪脑粗提物提取包括以下步骤：
A1：提取步骤：将绞碎后的鲜猪脑和提取液加入提取罐中，所述鲜猪脑和提取液的质量浓度比为1：5，搅拌30分钟，静置分层40分钟，然后压滤，压滤完成后收集上清液和滤液，所述提取液包括氯仿和甲醇，所述氯仿和甲醇的比例为1：3；
A2：分层步骤：将步骤A1收集到的滤液加入滤液体积30％的饮用水，搅拌15分钟后静置15小时，分层后收集上清液；
A3：皂化步骤：将步骤A1中的上清液和步骤A2中的上清液混合，得到混合物，加入混合物体积0.4％的氢氧化钠固体于分层水解罐中，控制温度在65℃之间，搅拌40分钟得到水解液；
A4：树脂层析步骤：将步骤A3所得的水解液通过大孔树脂，先用2倍柱体积的水冲洗树脂，再用2倍柱体积的50％甲醇溶液冲洗树脂，最后用甲醇洗脱，洗脱完成后收集洗脱液；
A5：酸水解步骤：将步骤A4中所得的洗脱液进行浓缩，得到浓缩液，然后将浓缩液和盐酸置于容器中调节PH值，使容器中浓缩液的PH值达到4.0，得到浓缩液A，再将浓缩液A加热至80℃后搅拌2小时，冷却至室温，得到浓缩液B，并向浓缩液B中加入饱和NaOH调节PH值，使容器中的浓缩液PH值达到9.0，获得浓缩液C；所述盐酸浓度为8mol/l；
A6：丙酮沉淀过滤、干燥：将步骤A5中所得的浓缩液C和丙酮置于容器内进行搅拌均匀，然后置于-15℃的温度条件下静置沉淀，沉淀时间为6小时，得到丙酮沉淀液，并对丙酮沉淀液进行真空抽滤，得到滤饼，然后将滤饼放入真空干燥箱进行干燥，获得猪脑粗提物；所述浓缩液C和丙酮质量浓度比为1：6；
步骤B：GM1硅胶层析纯化步骤：将100-200目硅胶装柱后压柱，取步骤A所得的猪脑粗提物用流动相溶解后上样，所述流动相包括三氯甲烷、甲醇和水，再用流动相高压洗脱，在线检测收集GM1洗脱液，将GM1洗脱液浓缩至无有机溶剂，得到GM1浓缩液；
步骤C：阳离子树脂纯化：将阳离子树脂用纯水清净，然后将阳离子树脂用盐酸溶液浸泡5h，浸泡完毕后用纯水将阳离子树脂清洗至中性，所述盐酸的浓度为6％，然后加入纯水浸泡，搅拌，装柱，避免气泡进入柱中，将步骤B中所得的GM1浓缩液进行上样，上样流速为5BV/h，然后用1BV的纯水洗脱，收集洗脱液，然后向洗脱液中加入饱和氢氧化钠溶液调节pH值，使洗脱液pH值达到7.0，用30k中空纤维超滤膜超滤，补加一倍体积纯水，超滤至截留溶液小于洗脱液的1/2后，加入10倍量的丙酮，置于-15℃的温度条件下静置沉淀，静置沉淀时间为20小时，得到沉淀液，将沉淀液真空抽滤，抽滤后得到的滤饼放入真空干燥箱干燥，得到本发明神经节苷脂。
所述步骤B中三氯甲烷、甲醇和水的体积比为70∶40∶5。
上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理和最佳实施例，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。