本发明属于农业的蔬菜育种与分子检测技术领域，具体涉及一种基于snp标记的紫龙三号茄子纯度鉴定的引物smemboi-2及应用。
背景技术：
种子纯度是种子质量检测最为重要的环节之一，植物新品种特异性(distinctness)、一致性(uniformity)和稳定性(stability)的测试(简称dsu测试)是农业部植物新品种保护办公室对申请品种授予新品种权进行实质审查最重要的工作内容。传统的种子纯度鉴定方法是以播种后植株的田间形态观察为依据，观察杂交一代的农艺学性状来判断是否为假杂种，其鉴定周期长、工作量大、成本高，且易受环境、气候因素影响，易导致结果鉴定结果存在误差。目前，每年因种子纯度问题给农户造成大幅减产减收的事件时有发生，严重影响了农业生产和农民增收。因此，开发快速、准确的杂交种纯度鉴定方法已成为种子科研单位和企业最为关注的方向之一。
随着现代分子生物学技术的发展，出现了以dna分子标记技术为基础的新型杂交种纯度鉴定方法，它具有简便、快速、准确等特点。常用的分子标记技术包括aflp、rflp、srap、scar、ssr和snp等标记技术。snp(singlenucleotidepolymorphisms)是指在基因组上单个核苷酸的变异，主要包括转换、颠换等形成的遗传标记，其数量很多、分布广泛，且具有共显性和高多态性等特征。目前，普遍认为snp标记是继rflp和ssr之后最有前途的第三代分子标记。
茄子是茄科属草本作物，原产非洲，现已在亚洲、非洲、欧洲和近东等地区广为栽培，联合国农业组织(fao)将茄子列为第四大世界性蔬菜作物。我国是茄子种植大国，其茄子类型和栽培方式多样，已成为我国南菜北调和北菜南运的主要蔬菜品种之一。由于在茄子杂交制种过程中，人工去雄不彻底和机械因素等原因，常会出现假杂交种，导致种子遗传纯度下降，给农业生产造成巨大的经济损失。
商品种‘紫龙三号’(原审定名称为‘鄂茄二号’)是武汉市农业科学院蔬菜研究所育成的紫色长茄品种，2007年通过湖北省农业厅的农作物新品种审定，目前为湖北地区夏秋主栽品种。本发明提供了两对基于snp标记开发出来的caps引物，其实验操作简单，只需要最基本的分子实验配套仪器和条件，不需要进行有毒的聚丙酰胺凝胶电泳和硝酸银显色，检测结果准确、高效，可有效区分茄子‘紫龙三号’杂交种制种过程中母本、父本种子掺杂。迄今为止，尚未见到利用snp标记鉴定茄子杂交种纯度的报道，本发明属于首次采用。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种基于snp标记的‘紫龙三号’茄子纯度鉴定的引物smemboi-2，所述的引物为：smemboi-2-f：5’-ttttgggaacgcaaagagtt-3’和smemboi-2-r：5’-tctacttcagaacctccgcc-3’。
本发明还有一个目的在于提供了一种基于snp标记的‘紫龙三号’茄子纯度鉴定的引物smemboi-2在‘紫龙三号’茄子纯度鉴定或育种中的应用。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
申请人从ncbi公共数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中下载茄子est序列，使用samtools工具(http://samtools.sourceforge.net)将上述est序列比对到茄子基因组(http://eggplant.kazusa.or.jp/)序列并进行snp位点查询，使用snpscaps程序进行酶切位点转换和caps引物设计，挑选的引物经过pcr和酶切多态性筛选，最终得到两对多态性的引物，即smemboi-1和smemboi-2，两对引物的检测限制性内切酶均为mboi；
其中引物smemboi-2：
smemboi-2-f：5’-ttttgggaacgcaaagagtt-3’
smemboi-2-r：5’-tctacttcagaacctccgcc-3’
‘紫龙三号’的dna经引物smemboi-2pcr扩增和酶切后产生265bp、153bp和112bp的特异性带。
一种基于snp标记的‘紫龙三号’茄子纯度鉴定的引物smemboi-2在‘紫龙三号’茄子纯度鉴定或育种中的应用，包括利用本发明提供的引物smemboi-2直接对‘紫龙三号’茄子纯度进行鉴定，或是用于‘紫龙三号’茄子的育种；或是制备成‘紫龙三号’茄子纯度鉴定试剂盒或是‘紫龙三号’茄子的育种试剂盒。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明提供的引物及其检测方法可有效地将茄子‘紫龙三号’杂交种与其母本、父本精准区分开来，具有快速、准确、稳定和操作简便等优点，无需进行毒性较强的操作，能够替代传统茄子杂交种田间纯度鉴定的方法，具有较强的应用价值。
附图说明
图1为引物smemboi-1和引物smemboi-2在‘紫龙三号’母本、父本中的多态性检测图；
图中m为dl2000marker，m条带从上至下大小依次是2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp，dna经引物smemboi-1pcr扩增和酶切后在‘紫龙三号’母本中产生160bp和95bp的两条特异性带，在父本中产生一条255bp的特异性带；dna经引物smemboi-2pcr扩增和酶切后在‘紫龙三号’母本中产生的一条265bp的特异性带、在父本中为153bp和112bp两条特异性条带。
图2引物smemboi-1在待测‘紫龙三号’中的检测图；
图中m为dl2000marker，m条带从上至下大小依次是2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp，m代表母本，f代表父本，f1代表‘紫龙三号’，1-44号泳道代表‘紫龙三号’单株，其中11号和27号泳道带型表现为母本带型，其余泳道均表现为双亲互补带型。
图3引物smemboi-2在待测‘紫龙三号’中的检测图；
图中m为dl2000marker，条带从上至下大小依次是2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp，m代表母本，f代表父本，f1代表‘紫龙三号’，1-44号泳道代表‘紫龙三号’单株，其中11号和27号泳道带型表现为母本带型，其余泳道均表现为双亲互补带型。
具体实施方式
下面结合附图和具体实示例进一步对本发明进行详细说明。本发明所述技术方案，如未特别说明，属于本发明的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
实施例1：
茄子‘紫龙三号’种子纯度检鉴定的snp分子标记引物的获得：
从ncbi公共数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中下载茄子est序列，使用samtools工具(http://samtools.sourceforge.net)将上述est序列比对到茄子基因组(http://eggplant.kazusa.or.jp/)序列并进行snp位点查询，使用snpscaps程序进行酶切位点转换和caps引物设计，挑选的引物经过pcr和酶切多态性筛选，最终得到两对多态性的引物，即smemboi-1和smemboi-2，两对引物的检测限制性内切酶均为mboi。
经引物smemboi-1pcr扩增和酶切后在‘紫龙三号’的母本中产生160bp和95bp的两条特异性带，在’紫龙三号’的父本中产生一条255bp的特异性带。
经引物smemboi-2pcr扩增和酶切后在‘紫龙三号’的母本中产生的一条265bp的特异性带、在‘紫龙三号’的父本中为153bp和112bp两条特异性条带。
引物smemboi-1：
smemboi-1-f：5’-caatgagaggacgattaatgaca-3’；
smemboi-1-r：5’-ggaagacaagaataatagtgtacatgc-3’。
引物smemboi-2：
smemboi-2-f：5’-ttttgggaacgcaaagagtt-3’
smemboi-2-r：5’-tctacttcagaacctccgcc-3’
两对引物的检测带型清晰、重复性好。
‘紫龙三号’的dna经引物smemboi-1pcr扩增和酶切后产生160bp、95bp和255bp的特异性带。
‘紫龙三号’的dna经引物smemboi-2pcr扩增和酶切后产生265bp、153bp和112bp的特异性带。
因此，可将引物smemboi-1或引物smemboi-2单独用于鉴定‘紫龙三号’，或是将smemboi-1和smemboi-2结合一起来用于鉴定‘紫龙三号’。
实施例2：
利用引物smemboi-1和/或smemboi-2对茄子‘紫龙三号’茄子纯度鉴定的方法，步骤包括：
(1)待测茄子的dna提取：采用ctab法提取茄子子叶基因组dna，子叶经液氮研磨或者钢珠打碎、2×ctab裂解液裂解、氯仿抽提、异丙醇沉淀和70％乙醇洗涤等过程，最终dna沉淀溶解于20μlte溶液。
(2)pcr扩增：采用引物smemboi-1或者引物smemboi-2对‘紫龙三号’及其亲本基因组dna进行pcr扩增，pcr反应体系为：6μl2×taqpcrmastermix、4μlddh2o2灭菌水、0.5μl正向引物(浓度为2.5nm)、0.5μl反向引物(浓度为2.5nm)、和1μl上述提取的待检测茄子基因dna；
引物smemboi-1：
smemboi-1-f：5’-caatgagaggacgattaatgaca-3’；
smemboi-1-r：5’-ggaagacaagaataatagtgtacatgc-3’。
引物smemboi-2：
smemboi-2-f：5’-ttttgggaacgcaaagagtt-3’
smemboi-2-r：5’-tctacttcagaacctccgcc-3’；
pcr扩增程序为：94℃预变性5min；扩增循环：94℃变性30sec、58℃退火30sec、72℃30sec，32个循环；最后72℃延伸5min；最后4℃保存。
(3)酶切反应：直接向上述12μlpcr反应体系中加入2.5μl2×cutsmart缓冲液、0.1μlmboi限制酶和15.5μlddh2o2灭菌水。37℃恒温箱中孵育8-12h。
(4)琼脂糖凝胶电泳和成像：琼脂浓度为1.5％(每20ml琼脂糖加入1μlgenered核酸染液)，电泳缓冲液为0.5×tbe，电泳仪电压200v，电泳时间18min，琼脂糖凝胶用紫外或者蓝光电泳检测仪进行拍照、观察和记录。
(5)电泳结果分析。
待测dna经引物smemboi-1pcr扩增和酶切后产生160bp、95bp和255bp的特异性带的为‘紫龙三号’；
待测dna经引物smemboi-2pcr扩增和酶切后产生265bp、153bp和112bp的特异性带的为‘紫龙三号’。
实施例3：
引物smemboi-1和/或smemboi-2在茄子‘紫龙三号’茄子纯度鉴定中的应用：
待测样本：
‘紫龙三号’的父本5个单株混合样本、‘紫龙三号’的母本5个单株混合样本；待测‘紫龙三号’120个单株；同时‘紫龙三号’及其亲本4-5片真叶时定植于实验大棚，并依次进行编号(实验编号和田间编号一致)，于商品果期观察各单株农艺性状。
用实施例2所述的方法对上述样本的dna进行检测。
引物smemboi-1的实验结果如图2所示：图中仅显示1-44号检测结果。
经引物smemboi-1pcr扩增和酶切后在‘紫龙三号’的母本中产生160bp和95bp的两条特异性带，在‘紫龙三号’的父本中产生一条255bp的特异性带；其中11号和27号泳道带型表现为母本带型，只出现了两条带；而其他样本(包括45-120号样本)均为三条特异性带；因此判定11号和27号泳道的样品为假‘紫龙三号’，计算得到120个样本中，紫龙三号纯度为98.3％。
引物smemboi-2的实验结果如图3所示：图中仅显示44份检测结果。
经引物smemboi-2pcr扩增和酶切后在‘紫龙三号’的母本中产生的一条265bp的特异性带、在‘紫龙三号’的父本中为153bp和112bp两条特异性条带。其中11号和27号泳道带型表现为母本带型，只出现了一条带；而其他样本(包括45-120号样本)均为三条特异性带；因此判定11号和27号泳道的样品为假‘紫龙三号’，计算得到120个样本中，紫龙三号纯度为98.3％。
通过上述引物smemboi-1和引物smemboi-2的鉴定结果可知，本发明提供的引物无论是单独还是结合起来鉴定，其结果一致。
于商品果期观察各单株农艺性状，经鉴定120个紫龙三号单株中11和27号与其他杂交种株系在株高、果皮色、生长势方面存在明显差异，与母本株系较为相似，疑似为母本污染。田间鉴定紫龙三号纯度为紫龙三号纯度为98.3％，与分子纯度鉴定试验结果一致。
综上，利用引物组合smemboi-1和/或引物组合smemboi-2均能从‘紫龙三号’中找出相同的假杂种，并且与田间纯度鉴定结果一致。这说明本发明的引物及其检测方法可将茄子杂交种与其父、母本进行有效区分，具有快速、准确、稳定和操作简便等优点。
上述的具体实施例只是用于证实所述引物及方法，而不是用于对本发明的保护范围进行限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的基础上进行的任何修改都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。
序列表
<110>武汉市农业科学院
<120>一种基于snp标记的紫龙三号茄子纯度鉴定的引物smemboi-2及应用
<160>4
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>23
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
caatgagaggacgattaatgaca23
<210>2
<211>27
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
ggaagacaagaataatagtgtacatgc27
<210>3
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
ttttgggaacgcaaagagtt20
<210>4
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>4
tctacttcagaacctccgcc20