本发明属于农作物分子生物学技术领域，具体地说，涉及一组适用于毛细管电泳检测技术的玉米ssr分子标记及其应用。
背景技术：
近十年来我国的玉米播种面积一直稳居所有粮食作物之首。据国家统计局2015年统计，全国玉米播种面积3.81×107公顷，总产量是2.25×108t，播种面积和总产量分别占粮食作物的33.63％和36.14％，均位于粮食作物首位。我国既是玉米生产大国，也是玉米种子的需求大国。但目前玉米种子市场品种繁多，鱼龙混杂，这给玉米的种植及品种鉴定带来一定影响。因此，玉米纯度鉴定及品种区分是玉米种子质量控制体系中的关键环节。
另外随着大量玉米新品种的不断涌现，也给我国杂交种鉴定工作带来新的考验，从1972年到2013间，国家和各省共审定玉米品种就达6291个，加之玉米亲本自交系种质基础日渐狭窄，杂交种的亲缘关系也越来越近，那些传统的玉米杂交种鉴定方法已不能满足我国目前生产需求。分子标记鉴定成为玉米品种鉴定的主要手段。
分子标记有多种，其中，ssr标记由于具有数量丰富、多态性高、遗传上呈共显性、扩增稳定、引物序列易于交流等特点受到广泛重视。利用简单重复序列(simplesequencerepeats,ssr)标记技术进行品种鉴定的关键之一是扩增片段检测技术。现有研究多利用较为复杂的聚丙烯酰胺凝胶电泳结合银染进行检测。但该技术由于分辨率低，难以明确区分扩增片段间几个碱基的差异，且对仪器设备和人员技能要求相对较高，不利于普及。而基于毛细管电泳检测技术的ssr分子标记技术则可以得到定量的dna片段分析数据。与常规的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测方法相比，其结果更为精确、灵敏、高效，更适用于大批量品种的检测分析。
技术实现要素：
本发明的目的是提供适用于毛细管电泳检测技术的一组玉米ssr分子标记。
为了实现本发明目的，本发明通过收集来源广泛、表型和基因型丰富、代表性强的玉米材料，对相应材料的玉米基因组进行测序并比较。本发明提供了一组适用于毛细管电泳检测技术的玉米ssr分子标记，所述分子标记为以下15个ssr分子标记的一个或多个，15个ssr分子标记分别为umc2187，umc1231，phi083，umc1196，bmc1065，umc1545，umc2027，phi065，umc1311，umc2224，umc2163，umc2281，phi102228，bmc1957，dupssr34。
所述15个ssr分子标记分别依次通过以下引物扩增得到：seqidno.1-2，seqidno.3-4，seqidno.5-6，seqidno.7-8，seqidno.9-10，seqidno.11-12，seqidno.13-14，seqidno.15-16，seqidno.17-18，seqidno.19-20，seqidno.21-22，seqidno.23-24，seqidno.25-26，seqidno.27-28，seqidno.29-30。
进一步，本发明提供了用于扩增上述ssr分子标记的特异性引物对，其为以下任一对：seqidno.1-2，seqidno.3-4，seqidno.5-6，seqidno.7-8，seqidno.9-10，seqidno.11-12，seqidno.13-14，seqidno.15-16，seqidno.17-18，seqidno.19-20，seqidno.21-22，seqidno.23-24，seqidno.25-26，seqidno.27-28，seqidno.29-30。
本发明提供了上述玉米ssr分子标记在构建玉米品种dna指纹数据库中的应用。
本发明提供了上述玉米ssr分子标记在玉米种质资源遗传多样性分析中的应用。
本发明提供了上述玉米ssr分子标记在玉米鉴定中的应用。
本发明提供了上述玉米ssr分子标记在玉米分子标记辅助育种中的应用。
本发明提供了上述玉米ssr分子标记在制备玉米基因组芯片中的应用。
本发明提供了含有上述玉米ssr分子标记的玉米基因组芯片。
本发明提供了上述玉米ssr分子标记在区分玉米嫩单16和绥玉26品种中的应用。
以上所述的应用，包括以下步骤：
1)提取待测玉米样品的dna；
2)以步骤1)提取的dna为模板，利用上述ssr分子标记，进行pcr扩增；
3)采用毛细管电泳系统检测pcr产物。
上述应用的步骤2)中，pcr扩增采用20μl的反应体积，含dntp0.25mm，正向引物、反向引物各0.4μm，taqdna聚合酶1.0单位，1×pcr缓冲液(不含mg2+)，mgcl21.5mm，样品dna10-40ng。反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性45s，60℃退火45s，72℃延伸45s，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
进一步地，本发明提供了用于区分玉米嫩单16和绥玉26品种的试剂盒，其含有针对本发明的15个玉米ssr分子标记的特异性引物组合。优选地，所述特异性引物组合的核苷酸序列分别如seqidno.1-30所示。
本发明提供的上述15对ssr引物可以在荧光毛细管电泳平台上实现基因分型数据的获得。具体方案为，每对引物的其中一条的5′端标记荧光基团；配制pcr反应体系加入dna、引物、dntp、mgcl2、taq酶、buffer；运行反应程序；扩增产物在荧光毛细管电泳系统上检测；利用毛细管电泳系统配套软件收集原始数据，导入基因型软件分析原始数据获得片段长度格式的基因型数据。
优选地，将本发明的15对特异性ssr引物进行荧光染料标记，共选用了pet、ned、vic、fam四种荧光染料。将荧光标记的pcr产物用超纯水稀释30倍；分别取等体积的上述4种稀释后溶液混合形成混合液，从混合液中吸取1μl加入0.5μllz500分子量内标和8.5μl去离子甲酰胺加入到dna分析仪专用深孔板中；然后将其在pcr仪上95℃变性5min，取出，立即置于冰上，冷却10min以上；瞬时离心10s后置放到dna分析仪上进行毛细管电泳检测。用genemapper软件对收集的原始数据进行分析。软件系统将根据目标峰的位置与同一泳道中的内标lz500进行比较，直接给出目标dna片段的准确大小。
在本发明的实施例的一个较佳实施方案中，fam荧光标记组的ssr分子标记为umc2187，umc1231，phi083，umc1196，bmc1065；vic荧光标记组的ssr分子标记为umc1545，umc2027，phi065，umc1311；ned荧光标记组的ssr分子标记为umc2224，umc2163，umc2281；pet荧光标记组的ssr分子标记为phi102228，bmc1957，dupssr34。以玉米嫩单16dna为模板，分别用fam、vic、ned、pet荧光标记的四组引物进行四次毛细管电泳，得到四个电泳图结果；再以嫩单16的dna为模板，用fam、vic、ned、pet荧光标记的全部引物混合物进行毛细管电泳得到总电泳图结果。将总电泳图结果分别与fam、vic、ned、pet四组荧光标记引物电泳的结果进行比较(图1)，可以看到，在fam、vic、ned、pet单独电泳图上出现的目的峰均能在总电泳图上分辨出来，且每个颜色的峰互不干扰，即说明本发明提供的引物组合(共15对引物)可用于一次毛细管电泳，目的条带互不干扰，易于判断结果。以玉米绥玉26dna为模板进行相同的实验，可得到相同的结论(图2)。
实施例中分别以嫩单16和绥玉26dna为模板，用fam、vic、ned、pet荧光标记引物组合进行一次性毛细管电泳，分别得到嫩单16和绥玉26的毛细管电泳图并进行比较。从图3中可以看出，嫩单16在83bp、107bp和132bp出现fam蓝色峰，绥玉26在78bp、110bp和127bp处出现fam蓝色峰；嫩单16在80bp和131bp出现vic绿色峰，绥玉26在77bp和129bp出现vic绿色峰；嫩单16在79bp和101bp出现ned黄色峰，绥玉26在85bp和110bp出现ned黄色峰；嫩单16在148bp和156bp出现pet红色峰，绥玉26在150bp和171bp出现pet红色峰。嫩单16及绥玉26的每个荧光标记出现的峰均不重叠，清晰可辨。因此，用本发明专利提供的荧光标记引物组合可在一次毛细管电泳中区分玉米嫩单16和绥玉26。
本发明的不同荧光标记的扩增产物可在同一泳道中进行电泳，其信号清晰，扩增片段大小差异明显，可精确计算片段大小，每个dna样品电泳峰型各异，易于判断。具有灵敏度高、分辨力好，结果准确可靠、高效快速等优点。用本发明提供的引物组合，可方便快速地将玉米嫩单16和绥玉26品种区分开，实现了节约成本、提高效率、操作方便、结果准确的优势。本发明提供的该组引物可用于玉米指纹图谱构建、品种鉴定及遗传多样性分析等，应用前景十分广阔。
附图说明
图1a-图1d分别为玉米嫩单16ssr荧光标记毛细管电泳图，其中，图1a为嫩单16经fam、vic、ned及pet荧光标记引物组合电泳结果与只经fam标记引物电泳结果的比较。图1b为嫩单16经fam、vic、ned及pet荧光标记引物组合电泳结果与只经vic标记引物电泳结果的比较。图1c为嫩单16经fam、vic、ned及pet荧光标记引物组合电泳结果与只经ned标记引物电泳结果的比较。图1d为嫩单16经fam、vic、ned及pet荧光标记引物组合电泳结果与只经pet标记引物电泳结果的比较。各图比较结果分别说明，单色荧光标记引物的电泳图上出现的目的峰均能在四色荧光标记引物组合电泳图上分辨出来(箭头所指示为出现的目的峰)，且每个目的峰互不干扰，可清晰读出品种的dna指纹信息。即说明本发明提供的引物组合可用于一次毛细管电泳，目的条带互不干扰，易于判断结果的同时又节省了时间、实验试剂与耗材。
图2a-图2d为玉米绥玉26的ssr荧光标记毛细管电泳检测结果。其中，图2a为绥玉26经fam、vic、ned及pet荧光标记引物组合电泳结果与只经fam标记引物电泳结果的比较。图2b为绥玉26经fam、vic、ned及pet荧光标记引物组合电泳结果与只经vic标记引物电泳结果的比较。图2c为绥玉26经fam、vic、ned及pet荧光标记引物组合电泳结果与只经ned标记引物电泳结果的比较。图2d为绥玉26经fam、vic、ned及pet荧光标记引物组合电泳结果与只经pet标记引物电泳结果的比较。各图的比较结果分别说明，单色荧光标记引物的电泳图上出现的目的峰均能在四色荧光标记引物组合电泳图上分辨出来(箭头所指示为出现的目的峰)，且每个目的峰互不干扰，可清晰读出品种的dna指纹信息。即说明本发明提供的引物组合可用于一次毛细管电泳，目的条带互不干扰，易于判断结果的同时又节省了时间、实验试剂与耗材。图1a-图1d和图2a-图2d均为了说明同一个目的，两个品种(嫩单16和绥玉26)的实验结果更能说明本专利提供的引物组合的实用性与可靠性。
图3为用本申请提供的15个玉米ssr分子标记对玉米嫩单16和绥玉26进行毛细管电泳图，并对两者进行比较的结果。结果说明，嫩单16(上图)显示的fam目的峰(蓝色)与绥玉26(下图)显示的fam目的峰(均用箭头标出)清晰可辨，且目的峰分子量不同。同理，两个品种显示的vic、ned、pet目的峰分子量各异，并清晰可辨。说明用本专利提供的引物组合能够对玉米嫩单16及绥玉26进行品种区分。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件。本发明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。
若未特别说明，本发明实施例所用生化试剂均为市售，所用玉米材料均为本领域公知公用的玉米。
实施例1玉米ssr分子标记及引物的确定
取36个玉米品种进行ssr引物筛选。用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，从987对ssr引物(https://ftp.maizegdb.org/maizegdb/ftp/ssrs/)选出位点可扩增，带型清晰，多态性较高的引物作为可选引物。根据可选引物在36个品种中等位基因的分子量范围、pic值等，即每个组合由尽可能多的引物组成，组内所有引物等位基因范围不叠加的条件，组成四个引物组合并分别合成带fam、vic、ned、pet荧光基团的引物。见表1。本领域技术人员能够理解，本领域内还可选择包括fam、vic、ned、pet在内的其他荧光基团来修饰表1中的四组引物，只要每组内引物标记相同的荧光基团即可，不限于选择哪一种荧光基团。
表1玉米ssr毛细管电泳引物及引物组合
实施例2利用本发明提供的ssr分子标记区分玉米品种
(1)dna快速提取
采用碱煮法对玉米种子进行dna提取。此方法操作快速简便，无有毒有害试剂，适用于植物分子生物学领域的dna制备，而且对大幅度缩短种子纯度检验、转基因检测时间，提高检测效率，降低检测成本具有重要意义。具体操作步骤为：取玉米种子若干粒，置于1.5ml离心管中；在离心管中加入400μlnaoh(1m)，确保将种子完全浸泡，沸水浴5min；在离心管中加入200μltris-hcl(1m，ph8.0)，沸水浴1min；加入200μlte缓冲液(ph8.0)，充分溶解后备用。
(2)dna样品的质量和数量
在紫外分光光度仪上检测dna样品260nm和280nm的od值，选择od260/280值为1.8-1.9的样品用于检测。
(3)核心引物选择
通过分析引物在染色体上的分布、多态性水平、pcr扩增稳定性和扩增产物带型，选择实施例1确定的能够满足毛细管荧光检测技术的引物，具体见表1。
(4)毛细管电泳检测
将筛选出的特异性ssr引物进行荧光染料标记，共选用pet、ned、vic、fam四种荧光染料。将荧光标记的pcr产物用超纯水稀释30倍；分别取等体积上述4种稀释后溶液混合形成混合液，从混合液中吸取1μl加入0.5μllz500分子量内标和8.5μl去离子甲酰胺加入到dna分析仪专用深孔板中；然后将其在pcr仪上95℃变性5min，取出，立即置于冰上，冷却10min以上；瞬时离心10s后置放到dna分析仪上进行毛细管电泳检测。用genemapper软件对收集的原始数据进行分析。软件系统根据目标峰的位置与同一泳道中的内标lz500进行比较，直接给出目标dna片段的准确大小。表1中各组引物扩增玉米嫩单16和绥玉26所得的扩增产物的目的条带大小见表2。
表2玉米嫩单16及绥玉26的差异峰条带及大小
(5)引物组合的判定
以玉米嫩单16dna为模板，分别用fam、vic、ned、pet荧光标记的四组引物进行四次毛细管电泳，得到四个电泳图结果；再以嫩单16dna为模板，用fam、vic、ned、pet荧光标记的全部引物混合物进行毛细管电泳得到总电泳图结果。将总电泳图结果分别与fam、vic、ned、pet四组荧光标记引物电泳的结果进行比较(图1a-图1d)，可以看到，在fam、vic、ned、pet单独电泳图上出现的目的峰均能在总电泳图上分辨出来，且每个颜色的峰互不干扰，即说明本发明提供的引物混合物可用于一次毛细管电泳，目的条带互不干扰，易于判断结果。以玉米绥玉26dna为模板进行相同的实验，可得到相同的结论(图2a-图2d)。
(6)嫩单16和绥玉26品种的区分
实施例中分别以嫩单16和绥玉26dna为模板，用fam、vic、ned、pet荧光标记引物组合(见表1)进行一次性毛细管电泳，分别得到嫩单16和绥玉26的毛细管电泳图并进行比较。从图3中可以看出，嫩单16在83bp、107bp和132bp出现fam蓝色峰，绥玉26在78bp、110bp和127bp处出现fam蓝色峰；嫩单16在80bp和131bp出现vic绿色峰，绥玉26在77bp和129bp出现vic绿色峰；嫩单16在79bp和101bp出现ned黄色峰，绥玉26在85bp和110bp出现ned黄色峰；嫩单16在148bp和156bp出现pet红色峰，绥玉26在150bp和171bp出现pet红色峰。嫩单16及绥玉26的每个荧光标记出现的峰均不重叠，清晰可辨。因此，用本发明专利提供的荧光标记引物组合(表1)可在一次毛细管电泳中区分玉米嫩单16和绥玉26。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110>黑龙江省农业科学院农产品质量安全研究所
<120>一组适用于毛细管电泳检测技术的玉米ssr分子标记及其应用
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