本发明属于分子生物学领域，涉及一种分子标记，特别是涉及一种与谷子叶片颜色基因紧密连锁的分子标记。本发明还涉及扩增该分子标记的引物、该分子标记和引物在谷子叶片颜色基因定位或谷子遗传育种中的用途。
背景技术：
我国是谷子(setariaitalical.beauv.)的原产国，是世界上谷子的集中种植国，谷子在我国的国民经济和社会生产中占有重要的地位，对旱作生态农业建设有重要意义。因此，加速谷子的育种进程尤为重要。由于谷子只是区域重要性作物，因此当前有关谷子的研究手段和方法相对较落后，如何应用先进科学的研究手段搞好谷子育种是一个严峻的问题。随着分子生物学的发展，分子标记技术的出现，为谷子的遗传研究及育种开辟了新的思路和手段。开发具有我国特色的重要性状基因的分子标记并进行辅助选择育种研究，将对提高我国谷子育种水平起到促进作用。
植物叶色是叶绿体中各种色素的综合表现，正常叶片中叶绿素占优势，通常表现为绿色。叶色变异是高等植物中突变频率较高且易于鉴定的突变性状。迄今为止，在水稻、小麦、大麦、玉米、大豆、棉花、烟草、玉米、向日葵、番茄、黄瓜、马铃薯、桑树等几乎所有高等植物中都发现了叶色突变体。其突变基因直接或间接影响光合色素，特别是叶绿素的合成和降解，导致各种色素的含量和比例改变，从而引起植物叶色变异。近年来，叶色突变体的利用价值越来越受到关注，现已成为研究植物光合作用机制、叶绿素生物合成途径、叶绿体的发育和遗传控制机理的特殊材料，同时叶色突变体在高光效育种和标记性状的利用上也具有重要的应用价值。一些叶色变异被作为标记性状用于良种繁育和杂交种生产。随着拟南芥、水稻等模式植物基因组测序的完成，叶色突变体在功能基因组学上的研究价值受到越来越多的关注，它们已成为研究光合系统结构、基因功能及其调控机制的理想材料。据不完全统计，目前报道的水稻叶色突变的相关基因已经超过80个，这些突变体大致可分为白化型、黄化型、条纹型、转绿型、斑马叶等5大类。但对于谷子叶色基因以及与之紧密连锁的分子标记的研究基本没有文献报道。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种与谷子叶片颜色基因紧密连锁的分子标记。
本发明的另一目的是提供一种可用于pcr扩增与谷子叶片颜色基因紧密连锁的分子标记的引物对，以及由该引物对扩增获得的分子标记。
本发明的再一目的是提供上述分子标记在谷子叶片颜色基因定位、检测以及谷子辅助育种中的用途以及上述分子标记的检测方法。
本发明的目的还提供一种包括使用上述分子标记的谷子叶片颜色基因的定位方法，和使用所述分子标记的谷子辅助育种方法。
为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
本发明公开了一种与谷子叶片颜色基因紧密连锁的分子标记，所述分子标记含有seqidno.1所示序列；优选的所述分子标记具有seqidno.1所示序列。其中加下划线部分为引物设计区段：
gcatatcctcttggagtgttcatgggatcacccatcctccaggcgttgagacgagggtcatagatctcaatgctagaaaccatcttgtccccatcataccctcccatagcatatctgagaaatatgtcagcactgcagctaagtttcttgccaagatgtaaggacaaggttatcttagttatttcatgaagagatctctagtataagagaaagttactgacaggacgtctcccaggacagttaaggcgtggcatcctctcctagtactcatactcggaagccgaacccagaagccctcccttggatcatacctttccgctgatctgtatagagtgtg(seqidno:1)
本发明还公开了一种扩增与谷子叶片颜色基因紧密连锁的分子标记的引物对，所述引物对的引物1含有seqidno.2所示序列，引物2含有seqidno.3所示序列；优选的所述引物1具有seqidno.2所示序列，引物2具有seqidno.3所示序列；
seqidno.2：5’-cacactctatacagatcagc-3’；
seqidno.3：5’-gcatatcctcttggagtgttc-3’。
本发明还公开了一种与谷子叶片颜色基因紧密连锁的分子标记，所述分子标记是由上述的引物对以叶片绿色的谷子基因组dna为模板经pcr扩增得到的。
在本发明的一个实施方案中，所述分子标记(含有seqidno.1所示核苷酸序列的dna片段)为谷子基因组中seqidno.1所示核苷酸序列的dna片段，即所包含的seqidno.1的5’端和/或3’端以外的核苷酸序列也是谷子基因组中的序列，优选的，为谷子基因组中seqidno.1的5’端和/或3’端的上下游序列。本领域技术人员可以理解，只要扩增或者检测叶片绿色的谷子基因组dna中的该分子标记，必然能够检测或扩增得到含有seqidno.1所示的序列。seqidno.1的5’端和/或3’端的上下游序列的长度为适当长度，并不特别限定，例如，满足分子标记的长度小于10,000bp、小于5,000bp、小于2,000bp、小于1,500bp、小于1,200bp、小于1,000bp、或者小于800bp。
本发明还公开了本发明的分子标记的制备方法，包括下述步骤：使用叶片颜色绿色的谷子的基因组dna作为模板，以上述引物对进行pcr扩增，得到的337bp扩增产物即含有所述分子标记；优选地，还包括将pcr扩增产物进行纯化的步骤。
对本领域技术人员而言，可以理解，也可以dna化学合成的方法得到本发明的分子标记。
本发明还公开了所述分子标记的检测方法，包括步骤：
(1)根据本发明的分子标记的核苷酸序列设计引物；
(2)以被检测谷子的基因组dna作为模板进行扩增；
(3)判断扩增产物中是否存在该分子标记。
例如，可以以被检测谷子的基因组dna为模板，以上述引物(seqidno.2和seqidno.3)进行pcr扩增，得到扩增产物。可以将得到的扩增产物进行测序或者凝胶电泳。
本发明还公开了所述的分子标记在谷子叶片颜色基因定位或检测中的用途。
本发明还公开了一种谷子叶片颜色基因定位的方法，所述方法包括使用本发明的分子标记的步骤。
本发明还公开了所述的分子标记在谷子辅助育种中的用途。
本发明还公开了一种谷子辅助育种方法，所述方法包括检测本发明的分子标记或分子标记引物对的步骤。
本发明的分子标记可用于今后的分子标记辅助育种中，本领域技术人员可以理解，比如通过检测是否存在本发明的分子标记来筛选谷子叶片是否含有控制叶片颜色绿色的谷子。检测出具有本发明的分子标记的谷子叶片为绿色，不具有该分子标记的谷子叶片为黄色。所述检测可以是pcr检测的方法，具体地，可以使用上述的本发明的分子标记的引物对。所述检测还可以通过测序方法进行。该谷子辅助育种方法具有简便、快速、高通量的优点。
在本发明中，具体地，所述谷子可以为张谷1号、谷子a2不育系、张杂谷3号、或张杂谷3号自交产生的f2代。其中，谷子a2不育系、张杂谷3号自交产生的部分f2代为叶片黄色型；张杂谷1号、张杂谷3号、或张杂谷3号自交产生的部分f2代为叶片绿色型。由于采用以上技术方案，使本发明具备的有益效果在于：
本发明提供了与谷子叶片颜色基因紧密连锁的分子标记，该分子标记将基因组dna序列与谷子叶片颜色基因联系起来，有利于谷子分子标记辅助育种体系的建立；所述分子标记与谷子叶片颜色基因的遗传紧密连锁距离为1.5cm。本发明的分子标记及分子标记扩增引物可以简便、快速、高通量地应用于谷子育种实践和资源及品种鉴定。
附图说明
图1：分子标记引物(seqidno.2和seqidno.3)对f2代480个单株扩增的部分结果。其中：
泳道3、5、6、8、9、10、11、12、13、15、16、19、20、21、23代表15株叶片绿色型的单株pcr扩增产物，泳道1、2、4、7、14、17、18、22、24代表9株叶片黄色型的单株pcr扩增产物。泳道m为marker，其为100bpdnaladder；其分子量包括：、1500bp、1000bp、900bp、800bp、700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp以及100bp。
具体实施方式
本发明公开了一种引物对以及与谷子叶片颜色基因紧密连锁的分子标记sisv0704。利用本发明的引物对，以谷子基因组dna为模板进行pcr，可以得到与谷子叶片颜色基因紧密连锁的分子标记，该分子标记在本发明中命名为分子标记sisv0704。需要指出的是，本领域技术人员可以理解，除了通过上述pcr扩增获得本发明的分子标记外，还可以通过化学合成获得本发明的分子标记。
本发明的引物对分别含有序列表seqidno.2和seqidno.3所示序列，
seqidno.2：5’-ctcttccaagtctggtttgc-3’；
seqidno.3：5’-gcagacatcacatgtgacgt-3’。
本领域技术人员熟知，在上述seqidno.2和seqidno.3所示序列中，可在其5’端或3’端分别增加1～10个碱基，所增加的碱基类型可根据谷子基因组dna上与seqidno.2和seqidno.3相匹配区域的碱基类型并依据碱基配对原则来确定，由此得到的引物对与seqidno.2和seqidno.3的扩增产物基本相同(上游和下游引物之间的dna序列相同)。因此，上述在seqidno.2和seqidno.3的5’端或3’端分别增加1～10个碱基并能扩增得到基本相同dna片段的引物对，均包括在本发明的引物对中。在本发明具体的实施方式中，本发明的引物对优选为seqidno.2和seqidno.3所示序列。本发明将父本叶片绿色型和母本叶片黄色型的纯合子杂交，获得f1代(张杂谷3号)，再以f1代自交产生f2代群体，共480个单株。优选的采用sv分子标记开发方法，首先对父本进行denovo测序(60xcontign50：22k，scaffoldn50：320k；totalsize：400mb)，母本重测序(10x)；然后根据父母本测序数据，利用华大自主开发的soap软件比较父母本之间的序列差异，分别在父本差异序列的5’端和3’端外侧约50bp位置，随机选取20bp左右的长度设计差异序列扩增的引物，根据不同的差异序列设计了1105对引物。以父母本及f1的dna为模板进行扩增，从1105对引物中筛选出616对具有多态性和有效性的引物。采用开发出的616对引物，对f2群体的480个个体进行pcr检测，并进行数据统计分析，用mapmaker3.0软件进行遗传图谱绘制，得到本发明所述的与叶片颜色基因紧密连锁的分子标记，及其扩增引物。采用筛选出的引物对扩增得到的父本序列，即本发明中的分子标记sisv0704。对f2个体进行性状分析，并根据基因性状数据和表型性状数据将谷子叶片颜色基因定位在遗传图谱上。
下面通过具体实施例并结合附图对本发明作进一步详细说明。以下实施例仅仅对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的限制。
实施例1：谷子f2代分离群体的构建
父本为张谷1号：叶片绿色型，高株型，抗拿捕净(一种除草剂)，旗叶长而窄，刚毛红色，颖壳红色，可育。
母本为a2不育系：叶片黄色型，矮株型，不抗拿捕净，旗叶短而宽，刚毛绿色，颖壳绿色，部分不育。
父本和母本杂交得到f1(叶片绿色型)，f1自交共得到480个f2代单株。对480个f2单株进行叶片颜色性状分析，发现叶片绿色型453株，叶片黄色型27株。
实施例2：父母本以及f1代、f2代个体基因组dna的提取
用ctab法分别提取实施例1中的父母本、f1代、以及480个f2代个体的基因组dna，具体方法如下：
(1)称取1.0g新鲜叶片，剪碎放入研钵，用液氮研磨后加入3ml1.5×ctab，研磨成匀浆转入15ml的离心管中，然后往研钵中加入1ml1.5×ctab冲洗再转入离心管中。混匀后于65℃水浴30min，期间不时缓慢摇匀。
其中1.5×ctab配方如下(1l)：
加去离子水定容至1l，使用前加入终浓度为0.2％(2ml)的巯基乙醇。
(2)待冷却至室温，加入等体积氯仿/异戊醇(24：1)，轻轻混匀，至下层液变为深绿色。
(3)4200rpm离心10min，将上层水相移到新的15ml离心管，加2倍体积预冷的无水乙醇，混合静止5min。于-20℃放置30min沉淀dna。
(4)4200rpm离心10min，弃掉上清，加入1ml75％乙醇洗涤沉淀1次，倒置离心管干燥dna，加入200μlte溶解dna。
(5)用0.8％的琼脂糖凝胶检测基因组dna。
(6)将得到的父母本以及f1代、f2代个体的基因组dna存于-20℃备用。
实施例3：分子标记的制备
以实施例2中提取的父本、f1代、或f2代的基因组dna为模板，以分子标记扩增引物对(seqidno.2和seqidno.3)进行pcr扩增。
pcr反应体系如下：
pcr反应程序如下：
94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸40秒，运行35个循环；最后72℃延伸3分钟。pcr扩增产物可以在4℃保存。
经上述扩增过程得到分子标记，优选扩增后将扩增产物进行纯化操作。纯化后进行测序，结果如seqidno.1所示。
对本领域技术人员而言，可以理解，也可以通过dna化学合成的方法得到该分子标记。
实施例4：sv分子标记开发
父本：denovo测序，60xcontign50：22k，scaffoldn50：320k；totalsize：400mb；母本：重测序10x。
根据父母本测序数据，利用华大自主开发的soap软件(例如soap2.20，可以从http://soap.genomics.org.cn/下载，也可以使用其它的序列比对软件)比较父母本之间的序列差异，然后基于差异的序列，用primerpremier软件设计扩增差异序列的引物；基于不同的差异序列，一共设计了1105对引物。下面的表1中示出了其中的部分引物序列(seqidno.2-seqidno.41)
表11105对随机引物中的部分引物
分别以提取的父母本及f1代的基因组dna为模板，以设计的1105对引物进行pcr扩增。
pcr反应体系(25μl)：
pcr反应程序：94℃预变性5min；然后进入35个循环：94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s；循环结束后72℃延伸3min；4℃保存。
pcr产物电泳检测：1.2％的琼脂糖凝胶120v电泳25min，eb染色10min，照胶并记录。
引物的有效性和多态性：在此有效性是指是否有扩增产物，多态性是指父母本间扩增产物的片段大小有差异。
按照如下的筛选标准进行引物的筛选：父母本及f1均有扩增产物，并且父母本扩增产物均只有一条明晰的带型且大小有差异，f1表现为有父母本带型的杂合带型，即有父本和母本带型的两条带。
筛选结果：根据上述筛选标准，从设计的1105对引物中筛选出616对引物。
实施例5：遗传图谱构建及基因定位
(1)遗传图谱构建
用开发的616对具有多态性的分子标记对f2群体的480个个体进行pcr检测，所用模板为制得的f2群体的480个个体的基因组dna，pcr体系的其它成分及pcr程序与上述相同。
对pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，其中分子标记引物(seqidno:2)和(seqidno:3)对480个个体扩增的部分结果如图1所示。
将全部电泳结果进行数据统计分析，具体方法如下：将f2群体单株扩增条带为父本型的记为a，扩增条带为母本型的记为b，扩增条带同时含有父本型和母本型的记为h，带型模糊或者缺失记为-，相当于数据缺失，最终得到f2群体480个个体的616对引物扩增的基因型数据。比如，用第一对引物得到的480个个体的数据是a，b，h，-，b,……共480个数据，用第二对引物得到的数据为b,a,h,a,-,……共480个数据，共616对引物分别统计，所得即为该f2群体的基因型数据。
用mapmaker3.0软件(constructinggeneticmapswithmapmaker/exp3.0，slincoln,mdaly,elander-cambridge,ma:whiteheadinstitute,1992)进行遗传连锁图谱绘制，得到遗传连锁图。从该得到的遗传连锁图上可确定616对引物的位置及与谷子叶片颜色基因的遗传距离。
(2)基因定位
根据480个个体的叶片颜色表型，与父本型性状相似的记为a(叶片绿色型)，与母本型性状相似的记为b(叶片黄色型)，性状居于父本和母本之间的记为h。得到480个个体的表型数据，将480个个体的表型数据与之前得到的480个个体的基因型数据进行比较，相似高则代表该标记与叶片颜色性状紧密连锁，并将叶片颜色基因定位在遗传连锁图谱上。
实施例6：与谷子叶片颜色基因紧密连锁的分子标记的验证
1.在实施例5制得的遗传连锁图谱的基础上，根据与谷子叶片颜色基因的遗传连锁距离，在与谷子叶片颜色基因的遗传紧密连锁距离为1.5cm的位置确定了分子标记引物(seqidno.2和seqidno.3)，并找到对应的父本序列位置，上下游引物之间的序列即为分子标记，其核苷酸序列如seqidno.1所示。
seqidno.2：5’-cacactctatacagatcagc-3’；
seqidno.3：5’-gcatatcctcttggagtgttc-3’。
2.另外，在实施例5中的对f2代的480个个体的pcr扩增产物的电泳中，对于分子标记引物(seqidno.2和seqidno.3)的扩增结果是：约453株叶片颜色绿色型的植株的扩增产物均有337bp大小的条带，约27株叶片颜色黄色型的植株的pcr扩增产物均有610bp的条带(部分扩增结果如图1所示)。并且经测序证明该337bp的片段的序列与seqidno.1相同。
可见，本发明的分子标记(seqidno.1)为与谷子叶片颜色基因紧密连锁的分子标记。
以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
序列表
<110>深圳华大小米产业股份有限公司
<120>一种与谷子叶片颜色基因紧密连锁的分子标记sisv0704
<130>p2017-1-0175.cn
<160>41
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>337
<212>dna
<213>谷子(setariaitalical.beauv.)
<400>1
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tagatctcaatgctagaaaccatcttgtccccatcataccctcccatagcatatctgaga120
aatatgtcagcactgcagctaagtttcttgccaagatgtaaggacaaggttatcttagtt180
atttcatgaagagatctctagtataagagaaagttactgacaggacgtctcccaggacag240
ttaaggcgtggcatcctctcctagtactcatactcggaagccgaacccagaagccctccc300
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