本发明涉及生物技术
技术领域：
，特别涉及一种检测塞尼卡谷病毒的rt-lamp引物组、试剂盒及应用。
背景技术：
：猪塞尼卡谷病毒(senecavalleyvires，svv)是一种新出现的可感染仔猪及母猪并导致仔猪死亡的病毒。病毒粒子为直径约27nm的二十面体无囊膜的单股、正链、不分节段的rna病毒，为小rna病毒科(picornaviridae)塞尼卡病毒属(seneeavirus)的唯一成员。病毒基因组含有7280个核苷酸。猪塞尼卡谷病毒病的临诊症状具体表现为病畜鼻吻部、蹄部冠状带出现明显水泡，同时伴有跋行、厌食、嗜睡和发烧等症状。该病传染性强，发病率高，1～3日龄新生仔猪病死率可达30～70％。到目前为止，该病对养猪产业造成巨大的经济损失。自2015年下半年后，猪塞尼卡谷病毒病在巴西、美国、加拿大、中国、哥伦比亚等多国相继发生了svv感染猪的疫情，而且呈蔓延之势。针对该病的不断扩散，急需提出和制定有效的诊断与防控策略及措施。而目前，我国关于猪塞尼卡谷病毒研究进展的报道仍然很少，当前的检测方法主要是分子生物学检测方法和血清学检测方法。针对目前该病的不断扩散，急需提出和制定快速的诊断方法与有效的防控策略。技术实现要素：为了克服现有技术中检测塞尼卡谷病毒困难、耗时长和仪器昂贵等缺点和不足，本发明的首要目的在于提供一种检测塞尼卡谷病毒的rt-lamp引物组，该引物组能快速、方便、高效地检测鉴定塞尼卡谷病毒，特异性好，灵敏度高。本发明的另一目的在于提供一种检测塞尼卡谷病毒的试剂盒，该试剂盒包括上述引物组，该试剂盒可简便、快捷准确地检测塞内加谷病毒。本发明的再一目的在于提供上述检测塞尼卡谷病毒的rt-lamp引物组和试剂盒的应用。本发明的目的通过下述技术方案实现：一种检测塞尼卡谷病毒的rt-lamp引物组，包含正向内引物svv-fip、反向内引物svv-bip、正向外引物svv-f3、反向外引物svv-b3、正向环引物svv-lf和反向环引物svv-lb，其核苷酸序列如下所示：svv-fip：5′-ctgtgttcagcaggctggtcg-cgtcgcatcaagattaccgg-3′；svv-bip：5′-ggactgctctggcattgacct-caaccagaaggtcgtcacc-3′；svv-f3：5′-agatccctggctgtctcg-3′；svv-b3：5′-gccacctcattgaagtcca-3′；svv-lf：5′-ggcacaaccagagggga-3′；svv-lb：5′-tgacatggttgatatcatcgcc-3′；所述的检测塞尼卡谷病毒的rt-lamp引物组在检测塞尼卡谷病毒领域中的应用；所述的检测塞尼卡谷病毒的rt-lamp引物组在检测塞尼卡谷病毒领域中的应用，不包含疾病的诊断目的；一种检测塞尼卡谷病毒的试剂盒，包含上述检测塞尼卡谷病毒的rt-lamp引物组；所述的检测塞尼卡谷病毒的试剂盒还包含10×thermopolbuffer、dntp、calcain、mncl2、mgso4、bstdnapolymerase、amv；所述的检测塞尼卡谷病毒的试剂盒进一步优选包含10×thermopolbuffer、浓度为2.5mm的dntp、浓度为250μmol/l的calcain、浓度为25mm的mncl2、浓度为10μmol/l的svv-fip+svv-bip、浓度为10μmol/l的svv-lf+svv-lb、浓度为10μmol/l的svv-f3+svv-b3、浓度为100mm的mgso4、浓度为8u/μl的bstdnapolymerase、浓度为5u/μl的amv；所述的检测塞尼卡谷病毒的试剂盒在检测塞尼卡谷病毒领域中的应用；所述的检测塞尼卡谷病毒的rt-lamp引物组在检测塞尼卡谷病毒领域中的应用，包含如下步骤：(1)配制rt-lamp反应体系，具体反应体系如下所示：(2)反应：将步骤(1)配制好的反应体系进行rt-lamp反应；(3)结果判读；所述的反应的具体条件优选为：61℃反应50min；所述的结果判读的具体方式优选为：在白光或紫外光下根据反应前后反应溶液颜色变化即进行结果判定；其中，白光下，绿色为阳性样品，橘黄色为阴性样品；紫外光下，荧光绿色为阳性样品，无荧光为阴性样品；所述的检测塞尼卡谷病毒的试剂盒在检测塞尼卡谷病毒领域中的应用不包含疾病的诊断目的；本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：(1)本发明提供的检测塞尼卡谷病毒的rt-lamp引物组特异性好，灵敏度高，重复性与稳定性好，适用于现场检测塞尼卡谷病毒的快速检测。(2)本发明提供的检测塞尼卡谷病毒的rt-lamp引物组和试剂盒采用反转录环介导等温扩增技术，依赖于能够识别靶序列上6个特异区域的引物和一种具解旋功能且使靶序列呈环介导等温扩增的bstdna聚合酶，在等温条件下可高效、快速、特异地扩增靶序列。(3)本发明提供的检测塞尼卡谷病毒的试剂盒采用lamp扩增方式为环介导等温扩增，扩增效率高且特异性强。(4)本发明提供的检测塞尼卡谷病毒的试剂盒只需在60～65℃进行恒温扩增，整个过程只需水浴锅即可，也不需要特殊的仪器，因此非常简便、成本低；且由于lamp是恒温扩增，不需要反转录步骤及pcr仪升降温的时间，所以扩增时间短。(5)发明提供的检测塞尼卡谷病毒的试剂盒用于检测塞尼卡谷病毒，加染料物质后，合成大量的dna，在白光和紫外光下根据反应前后溶液夜色变化即可进行结果判定。(6)发明提供的检测塞尼卡谷病毒的试剂盒非常适用于出口检疫、食品卫生以及畜牧养殖场的现场检测，易于大范围推广应用。附图说明图1是rt-lamp反应温度优化结果图，其中，泳道m为dnamarkerdl2000，泳道1～9分别代表反应温度为58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃的反应产物。图2是rt-lamp反应时间优化结果图，其中，泳道m为dnamarkerdl2000，泳道1～8分别代表反应时间为30min、35min、40min、45min、50min、55min、60min、65min的反应产物。图3是rt-lamp反应mg2+浓度优化结果图，其中，泳道m为dnamarkerdl2000，泳道1～6分别代表mg2+浓度为0mm、2mm、4mm、6mm、8mm、10mm的反应产物。图4是rt-lamp反应dntp浓度优化结果图，其中，泳道m为dnamarkerdl2000，泳道1～8分别代表dntp浓度为0.2mm、0.25mm、0.3mm、0.35mm、0.4mm、0.45mm、0.5mm、0.55mm的反应产物。图5是rt-lamp反应bstdnapolymerase浓度优化结果图，其中，泳道m为dnamarkerdl2000，泳道1～6分别代表bstdnapolymerase浓度为0.08u/μl、0.16u/μl、0.24u/μl、0.32u/μl、0.4u/μl、0.48u/μl的反应产物。图6是rt-lamp反应amv浓度优化结果图，其中，泳道m为dnamarkerdl2000，泳道1～6分别代表amv浓度为0.02u/μl、0.04u/μl、0.06u/μl、0.08u/μl、0.1u/μl、0.12u/μl的反应产物。图7是rt-lamp反应rt-lamp内引物与外引物比例优化结果图，其中，泳道m为dnamarkerdl2000，泳道1～8分别代表不同rt-lamp内引物与外引物比例的反应产物。图8是rt-lamp反应rt-lamp环引物与外引物比例优化结果图，其中，泳道m为dnamarkerdl2000，泳道1～7分别代表不同rt-lamp环引物与外引物比例的反应产物。图9是rt-lamp反应敏感性结果分析图，其中，泳道m为dnamarkerdl2000，泳道1～8分别代表初始核酸浓度、10倍倍比核酸稀释浓度、102倍倍比核酸稀释浓度、103倍倍比核酸稀释浓度、104倍倍比核酸稀释浓度、105倍倍比核酸稀释浓度、106倍倍比核酸稀释浓度、107倍倍比核酸稀释浓度的反应产物。图10是rt-lamp特异性结果分析图，其中，泳道m为dnamarkerdl2000，泳道1～8分别代表svv、fmdv、pdcov、pedv、tgev、prrsv、hcv和阴性对照水。图11是rt-lamp反应的产物在白光下的可视化检测图，其中，绿色为阳性扩增，橘黄色为阴性扩增。图12是rt-lamp反应的产物在紫外光下的可视化检测图，其中，荧光绿色为阳性扩增，无荧光为阴性扩增。具体实施方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例中：(1)塞尼卡谷病毒(svv)hn16株(即塞内加谷病毒svvhn16株)已在文献“贺东生,罗天霞,苏丹萍,等.规模化猪场暴发塞内加谷病及svvhn16株的分离鉴定[j].猪业科学,2017,34(10).”中公开；(2)猪丁型冠状病毒(pdcov)ch-a株已在文献“贺东生,陈小芬,王飞,等.我国集约化猪场新发猪丁型冠状病毒病的诊断[j].猪业科学,2015,32(10):76-77.”中公开；(3)猪流行性腹泻病毒(pedv)ch/gdgz/2012株已在文献“张海明,田野,王艳丽,等.猪流行性腹泻病毒ch/gdgz/2012株免疫原性和动物攻毒实验[j].猪业科学,2014(1):98-99.”中公开；(4)猪传染性胃肠炎病毒(tgev)cn12株已在文献“尤刘阳.长期传代的tgevcn12株全基因组遗传变异及qpcr检测方法的研究[d].华南农业大学,2016.”中公开；(5)猪蓝耳病病毒(prrsv)ya株已在文献“贺东生,王福广,苏丹萍,等.高致病性猪蓝耳病病毒ya株的分离鉴定及动物回归试验[c]//中国畜牧兽医学会动物传染病学分会教学专业委员会第12次学术研讨会.2008.”中公开；口蹄疫病毒(fmdv)疫苗株、猪瘟病毒(hcv)标准阳性血清购自北京世纪元亨动物防疫技术有限公司；amv反转录酶购自takara生物科技有限公司，货号lmp204；bstdnapolymerase购自纽英伦生物科技(北京)有限公司，货号m0275m；病毒基因组dna/rna提取试剂盒，购自康宁生命科学(吴江)有限公司，货号08317kc5。实施例1一、引物设计根据参考与比对genbank中塞尼卡谷病毒基因序列(acessionno.mf893200、accession:nc-011349.1、accession:kc667560.1、accession:dq641257.1、accession:kt321458.1、accession:ky419132.1、accession:ky038016.1、accession:kx377924.1、accession:mg428685.1、accession:mg428684.1、accession:mg428683.1、accession:kx857728.1、accession:kx173339.1、accession:ky747512.1、accession:ky747510.1、accession:ku954090.1、accession:ku954089.1、accession:kt757282.1、accession:kt757281.1、accession:kr063109.1、accession:kr063108.1等)，利用megalign软件进行序列比对，确定保守核甘酸序列作为扩增区域，利用rt-lamp法引物辅助设计软件primerexplorerv5(http://primerexplorer.jp/e/)软件根据确定的保守核甘酸序列设计出了三套检测塞尼卡谷病毒基因的rt-lamp引物组：每一套检测塞尼卡谷病毒的rt-lamp引物组合物，包括由正向内引物svv-fip、反向内引物svv-bip、正向外引物svv-f3、反向外引物svv-b3、正向环引物svv-lf和反向环引物svv-lb组成；所述引物序列如表1所示：表1检测塞尼卡谷病毒基因的rt-lamp引物组塞尼卡谷病毒基因序列保守序列如下所示：agaaagaacacgtatgacgtggactacagtgcctttgactcttcacacggcactggctccttcgaggctctcatctctcactttttcaccgtggacaatggttttagccctgcgctgggaccgtatctcagatccctggctgtctcggtgcacgcctacggcgagcgtcgcatcaagattaccggaggcctcccctctggttgtgccgcgaccagcctgctgaacacagtgctcaacaatgtgatcatcaggactgctctggcattgacctacaaagaatttgaatatgacatggttgatatcatcgcctacggtgacgaccttctggttggtacggattacgatctggacttcaatgaggtggcgcggcgcgctgccaaactggggtataagatgactcctgccaacaagggttctgtcttccctccgacttcctctctctccgatgctgtttttctaaaacgcaaattcgtccaaaacaatgacggcttatataaaccagttatggatttaaagaatttggaagccatgctctcctacttcaaaccaggaacactactcgagaagctgcaatctgtttctatgttggctcaacattctggaaaagaagaatatgatagattgatgcaccccttcgctgactacggtgccgtaccgagtcacgagtacctgcaggcaagatggagggccttgttcgactgacc二、引物初筛经过初步筛选，表1中第一套引物反应时间最短、特异性最好。实施例2(1)病毒基因组rna提取使用病毒基因组dna/rna提取试剂盒(康宁生命科学(吴江)有限公司，货号08317kc5)提取塞尼卡谷病毒(塞内加谷病毒svvhn16株)病毒rna，以及对照病毒(塞尼卡谷病毒(svv)hn16株、口蹄疫病毒(fmdv)疫苗株、猪丁型冠状病毒(pdcov)ch-a株、猪流行性腹泻病毒(pedv)ch/gdgz/2012株、猪传染性胃肠炎病毒(tgev)cn12株、猪蓝耳病病毒(prrsv)ya株以及猪瘟病毒标准阳性血清)的基因组rna。(2)rt-lamp反应体系建立及体系优化构建25μlrt-lamp反应体系(表2)，依次对反应温度、反应时间、mg2+、dntp、bstdnapolymerase浓度、amv浓度、rt-lamp内引物与外引物比例进行优化，得到的结果进行琼脂糖凝胶(质量体积比1.2％)电泳检测，具体如下：表2初始反应体系体系成分含量(体积/μl)10xthermopolbuffer2.52.5mmdntp4.0250μmol/lcalcain3.025mmmncl20.510μmol/lfip+bip4.010μmol/llf+lb1.510μmol/lf3+b30.5100mmmgso40.58u/μlbstdnapolymerase1.05u/μlamv0.3模板rna3.0rna-freewater4.2total25①反应温度优化设置58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃共9个温度梯度进行rt-lamp反应，反应体系见表2，反应时间为1h，反应结束后采用质量体积比1.2％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果表明：rt-lamp最佳反应温度为61℃(图1)。②反应时间优化设置30min、35min、40min、45min、50min、55min、60min、65min共8个时间梯度进行rt-lamp反应，反应体系见表2，反应温度为61℃，反应结束后采用质量体积比1.2％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果表明：rt-lamp最佳反应时间为50min(图2)。③mg2+浓度优化设置0mm、2mm、4mm、6mm、8mm、10mm共6个mg2+梯度进行rt-lamp反应，其他成分的用量如表2所示，61℃反应50min，反应结束后采用质量体积比1.2％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果表明：rt-lamp最佳mg2+浓度为6mm(图3)。④dntp浓度优化设置0.2mm、0.25mm、0.3mm、0.35mm、0.4mm、0.45mm、0.5mm、0.55mm共8个dntp梯度进行rt-lamp反应，其他成分的用量如表2所示，61℃反应50min，反应结束后采用质量体积比1.2％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果表明：rt-lamp最佳dntp浓度为0.5mm(图4)。⑤bstdnapolymerase浓度优化设置0.08u/μl、0.16u/μl、0.24u/μl、0.32u/μl、0.4u/μl、0.48u/μl共6个bstdnapolymerase梯度进行rt-lamp反应，其他成分的用量如表2所示，61℃反应50min，反应结束后采用质量体积比1.2％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果表明：rt-lamp最佳bstdnapolymerase浓度为0.32u/μl(图5)。⑥amv浓度优化设置0.02u/μl、0.04u/μl、0.06u/μl、0.08u/μl、0.1u/μl、0.12u/μl共6个amv梯度进行rt-lamp反应，其他成分的用量如表2所示，61℃反应50min，反应结束后采用质量体积比1.2％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果表明：rt-lamp最佳amv浓度为0.06u/μl(图6)。⑦rt-lamp内引物与外引物比例优化设置不同rt-lamp内引物与外引物比例，见表3，其他成分的用量如表2所示，61℃反应50min，反应结束后采用质量体积比1.2％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果表明：rt-lamp最佳内引物与外引物比例比例为5.0μl：0.5μl(图7)。表3rt-lamp内引物与外引物比例⑧rt-lamp环引物与外引物比例优化设置不同rt-lamp环引物与外引物比例见表4，其他成分的用量如表2所示，61℃反应50min，反应结束后采用质量体积比1.2％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果表明：rt-lamp最佳环引物与外引物比例为1.0μl：0.5μl(图8)。表4rt-lamp环引物与外引物比例根据所得的实验结果，最终确定优化的检测体系(25μl)如表5所示。表5优化后的反应体系体系成分含量(体积/μl)10×thermopolbuffer2.52.5mmdntp5.0250μmol/lcalcain3.025mmmncl20.510μmol/lfip+bip5.010μmol/llf+lb1.510μmol/lf3+b30.5100mmmgso41.58u/μlbstdnapolymerase1.05u/μlamv0.3模板rna3.0rna-freewater3.7total25.0(3)rt-lamp检测方法的敏感性结果利用病毒基因组dna/rna提取试剂盒提取阳性塞尼卡谷病毒核酸，测定其浓度为3.35ng/μl，用rna-freewater连续10倍倍比稀释成9个稀释度，以各rna稀释度作为模板，利用优化后的反应体系(表5)进行rt-lamp扩增，61℃反应50min，反应结束后采用质量体积比1.2％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果表明：rt-lamp检测方法的敏感性为3.35x10-7ng/μl(图9)。(4)rt-lamp检测方法的特异性结果利用病毒基因组dna/rna提取试剂盒提取阳性svv、fmdv、pdcov、pedv、tgev、prrsv、hcv共7种病毒(塞尼卡谷病毒(svv)hn16株、口蹄疫病毒(fmdv)疫苗株、猪丁型冠状病毒(pdcov)ch-a株、猪流行性腹泻病毒(pedv)ch/gdgz/2012株、猪传染性胃肠炎病毒(tgev)cn12株、猪蓝耳病病毒(prrsv)ya株以及猪瘟病毒标准阳性血清)的核酸，以各rna和水作为模板，利用优化后的反应体系(表5)进行rt-lamp扩增，61℃反应50min，反应结束后采用质量体积比1.2％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果表明：阳性svv出现特异性梯状条带，对照病毒和水均为阴性(图10)。(5)rt-lamp的可视化检测由于上述优化后的反应体系中加入了钙黄绿素和mncl2，在白光和紫外光下根据反应前后反应溶液颜色变化即可进行结果判定(图11和图12)：白光下，绿色为阳性扩增，橘黄色为阴性扩增；紫外光下，荧光绿色为阳性扩增，无荧光为阴性扩增。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。sequencelisting<110>华南农业大学<120>检测塞尼卡谷病毒的rt-lamp引物组、试剂盒及应用<130>1<160>19<170>patentinversion3.5<210>1<211>41<212>dna<213>artificialsequence<220><223>引物svv-fip-1<400>1ctgtgttcagcaggctggtcgcgtcgcatcaagattaccgg41<210>2<211>40<212>dna<213>artificialsequence<220><223>引物svv-bip-2<400>2ggactgctctggcattgacctcaaccagaaggtcgtcacc40<210>3<211>18<212>dna<213>artificialsequence<220><223>引物svv-f3-1<400>3agatccctggctgtctcg18<210>4<211>19<212>dna<213>artificialsequence<220><223>引物svv-b3-1<400>4gccacctcattgaagtcca19<210>5<211>17<212>dna<213>artificialsequence<220><223>引物svv-lf-1<400>5ggcacaaccagagggga17<210>6<211>22<212>dna<213>artificialsequence<220><223>引物svv-lb-1<400>6tgacatggttgatatcatcgcc22<210>7<211>39<212>dna<213>artificialsequence<220><223>引物svv-fip-2<400>7ccagcgcagggctaaaaccagctccttcgaggctctcat39<210>8<211>38<212>dna<213>artificialsequence<220><223>引物svv-bip-1<400>8ggcgagcgtcgcatcaagatagcactgtgttcagcagg38<210>9<211>19<212>dna<213>artificialsequence<220><223>引物svv-f3-2<400>9tgactcttcacacggcact19<210>10<211>19<212>dna<213>artificialsequence<220><223>引物svv-b3-2<400>10tcaatgccagagcagtcct19<210>11<211>22<212>dna<213>artificialsequence<220><223>引物svv-lf-2<400>11gtccacggtgaaaaagtgagag22<210>12<211>17<212>dna<213>artificialsequence<220><223>引物svv-lb-2<400>12aggcctcccctctggtt17<210>13<211>42<212>dna<213>artificialsequence<220><223>引物svv-fip-3<400>13cgagacagccagggatctgagatcactttttcaccgtggaca42<210>14<211>38<212>dna<213>artificialsequence<220><223>引物svv-bip-3<400>14ggcgagcgtcgcatcaagatagcactgtgttcagcagg38<210>15<211>20<212>dna<213>artificialsequence<220><223>引物svv-f3-3<400>15ctccttcgaggctctcatct20<210>16<211>19<212>dna<213>artificialsequence<220><223>引物svv-b3-3<400>16gtcaatgccagagcagtcc19<210>17<211>18<212>dna<213>artificialsequence<220><223>引物svv-lf-3<400>17gcgcagggctaaaaccat18<210>18<211>17<212>dna<213>artificialsequence<220><223>引物svv-lb-3<400>18tggttgtgccgcgacca17<210>19<211>704<212>dna<213>artificialsequence<220><223>塞尼卡谷病毒基因序列保守序列<400>19agaaagaacacgtatgacgtggactacagtgcctttgactcttcacacggcactggctcc60ttcgaggctctcatctctcactttttcaccgtggacaatggttttagccctgcgctggga120ccgtatctcagatccctggctgtctcggtgcacgcctacggcgagcgtcgcatcaagatt180accggaggcctcccctctggttgtgccgcgaccagcctgctgaacacagtgctcaacaat240gtgatcatcaggactgctctggcattgacctacaaagaatttgaatatgacatggttgat300atcatcgcctacggtgacgaccttctggttggtacggattacgatctggacttcaatgag360gtggcgcggcgcgctgccaaactggggtataagatgactcctgccaacaagggttctgtc420ttccctccgacttcctctctctccgatgctgtttttctaaaacgcaaattcgtccaaaac480aatgacggcttatataaaccagttatggatttaaagaatttggaagccatgctctcctac540ttcaaaccaggaacactactcgagaagctgcaatctgtttctatgttggctcaacattct600ggaaaagaagaatatgatagattgatgcaccccttcgctgactacggtgccgtaccgagt660cacgagtacctgcaggcaagatggagggccttgttcgactgacc704当前第1页12