本发明涉及一种检测食品中产气荚膜梭菌和etx基因的引物，本发明还涉及一种包含上述引物用于检测食品中产气荚膜梭菌及etx基因的双重微滴式数字pcr(ddpcr)检测试剂盒，本发明还涉及一种采用上述试剂盒检测食食品中产气荚膜梭菌及etx基因的方法。
背景技术：
产气荚膜梭菌(clostridiumperfringens)是一种属于梭菌属的革兰氏阳性菌，具有荚膜，可产生芽孢，不具有运动性。c.perfringens是引起人畜共患病的主要病原菌之一，该菌的致病因子是其所产生的外毒素。根据所产毒素的不同，c.perfringens可分为5种类型。在美国和一些发展中国家，由a型c.perfringens菌引起的食物中毒是最常见报道的食物中毒之一。由c.perfringens导致的食物中毒多与水、肉和禽肉制品相关。调查美国1998―2010年由c.perfringens引起食物中毒的结果显示，肉类食品占食物总量的92％，其中牛肉制品占46％，禽肉制品占30％，猪肉制品占16％。据报道，生鲜牛肉、猪肉、火鸡肉和鸡肉及各种肉制品中c.perfringens检出率均超过10％，部分日本鸡肉中检出率甚至高达84％。
16srna基因具有高度保守和存在的普遍性，以及核酸序列本身的稳定性，序列分析的重现性极高，进化速度十分缓慢，被称为细菌的“活化石”，以往检测细菌数量较多使用都是16srna。但是，然而随着研究的深入，16srna基因也表现出了不容忽视的缺点：高保守性使其不能很好的区分亲缘关系较近的物种；在基因组内的多拷贝性使确定其序列的准确性降低。因此在进行更精确地分类鉴定和以及计算细菌某个毒力基因拷贝数时就很难确定。
为弥补16srrna基因的缺点，人们开始尝试使用其他不同的看家基因(如reca基因等)进行放线菌的分子生物学分析。reca是原核生物同源重组的中心分子,为单拷贝基因，在dna重组和dna损伤应急修复(sos)过程中是一个关键的基因,常用于做细菌分型。本发明将其作为产气荚膜梭菌的看家基因作为其分子鉴定基因，同时开展双重数字pcr检测其他毒力基因，从而不仅有效确定菌肿，而且还可以对毒力基因含量进行一个评估。
ε毒素(epsilontoxin,etx)是d型产气荚膜梭菌最主要的毒素，具有强毒力。etx属于以七聚体形式存在的β样成孔毒素，它能够形成由14个β折叠片组成的“β‐桶状”结构，这个“β‐桶状”结构可以插入真核细胞的质膜形成穿孔，在细胞水平，etx能够迅速使细胞膜肿胀、多种细胞器破坏，最终导致靶细胞的坏死.毒素通过气溶胶形式传播，也可通过细菌芽胞随食物传播，进入体内后，在肠道内大量繁殖，造成肠道菌群紊乱，释放的ε毒素被肠黏膜吸收，并随着血液循环到各个器官，导致个体血压升高，体腔积水，肺部及肾脏等局部器官出现水肿等。
由于产气荚膜梭菌属于厌氧菌，其培养要求较高,需要特殊的厌氧培养条件和设备,加上还需要采取特殊采样方式、应用相应培养基、鉴定试剂等,一般的实验室难以开展对该菌的研究,故长期以来国内对厌氧菌及其在食物中毒中的作用也缺少认识。在政府和民众重视食品安全的今天,对食品中厌氧菌的危险性应该进行评估。
常规pcr方法需要pcr扩增后进行电泳，不仅操作繁琐，而且不可能实现定量检测。目前，southernblot和实时荧光定量pcr是常用的两种外源基因拷贝数分析技术，已广泛用于外源基因拷贝数分析。但这两种方法也存在一定缺陷。例如，southernblot方法分析时工作量大、周期长、操作要求高、准确性较差，特别是对于多拷贝基因的分析，结果容易偏小。荧光定量pcr(qrt-pcr)在分析外源基因拷贝数时必须依赖于标准曲线和已知拷贝数的基因，只是一种相对定量方法，且标准曲线的质量易受到dna纯度、引物和探针的浓度、反应抑制因子等诸多因素影响。
微滴数字pcr(dropletdigitalpcr,ddpcr)是近年来兴起的一种新的绝对定量技术，它基于单分子pcr方法来进行计数的核酸定量，是一种绝对定量的方法。通过将大量稀释后的核酸溶液分散至芯片的微反应器或微滴中，每个反应器的核酸模板数少于或者等于1个。这样经过pcr循环之后，有一个核酸分子模板的反应器就会给出荧光信号，没有模板的反应器就没有荧光信号。根据相对比例和反应器的体积，就可以推算出原始溶液的基因拷贝数。
针对产气荚膜梭菌reca及etx基因的检测未见报道。本发明基于微滴式ddpcr平台，建立了产气荚膜梭菌看家基因reca及etx基因拷贝数分析方法，研究结果为产气荚膜梭菌定量检测提供了新方法。
技术实现要素：
本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种引物且组分和配比合理，使用方便，检测快捷，准确，适用于双重ddpcr检测食品中产气荚膜梭菌及etx基因的试剂盒；
本发明另一个目的是提供一种采用上述试剂盒检测食品中产气荚膜梭菌及etx的方法，该方法操作简便、快速，检测结果准确。
为了达到上述目的，本发明采用以下方案：
一种食品中产气荚膜梭菌及etx基因的引物，其特征在于该引物的序列和探针序列分别为：
上游引物recaf:tgggagattctcacgttggtc
下游引物recar:gcttgcttaaatggaggagca
探针recap:acaacaccaggtggtagagcgt
上游引物etxf：tgtgggaacttcgatacaagca
下游引物etxr：tggtgccttaatagaaagactcct
探针etxp：gtggaagtgaatggggagagatacct。
一种ddpcr检测食品中产气荚膜梭菌及etx基因的试剂盒，其特征在于该试剂盒中20.0μl反应体系包括以下组分：2×ddpcrsupermix10.0μl，上、下游引物各1.0μl、探针各1.0μl，dna模板4.0μl。
如上所述的试剂盒，其特征在于所述的上游引物recaf与上游引物etxf的含量比例为0.1-1:1。
如上所述的试剂盒，其特征在于所述的下游引物recar与下游引物etxr的含量比例为0.1-1:1。
一种ddpcr检测产气荚膜梭菌及etx基因的方法，其特征在于包括以下步骤：
a、提取样品dna；
b、将各反应组分加入上述20.0μl反应体系，然后加入70.0μl矿物油，混匀后转移到微滴发生器上自动产生微滴；
c、将产生的微滴细全部转移到96孔反应板pcr反应管中；再将96孔反应板在封膜仪上封膜，并置于普通pcr仪进行pcr反应。
d、打开微滴荧光检测器应用软件，将pcr反应结束后的96孔反应板直接插入设备，检测每pcr反应管中微滴的pcr反应情况,最后根据珀松分布定律算出待测基因的拷贝数。
如上所述检测产气荚膜梭菌及etx的方法，其特征在于步骤b中pcr扩增的反应程序按以下步骤进行：
(1)94℃预变性3min；
(2)94℃变性10s，59.0℃退火1min，共进行40个循环；
(3)98℃酶热失活10min；
(4)4℃停止反应。
如上所述检测产气荚膜梭菌及etx基因的方法，其特征在于步骤a中所述提取样品dna的具体步骤如下：
采用核酸纯化旋转离心柱分离法,适用于纯菌液及分泌物中细菌dna的提取。具体操作：挑取经可疑的单个菌落,加入200μl灭菌重蒸水中,制备产气荚膜梭菌菌悬液,将其置于干式恒温器上100℃加热20min,然后于12000r/min离心10min,取上清液分装eppendorf管,作为扩增反应的dna粗制模板，溶解于50μl的te溶液中。
本发明中敏感性和特异性试验：
采用测序等方法对阳性扩增产物进行测序验证，结果阳性扩增产物序列进行blast比较时，序列均与genbank目的序列高度同源。将10倍稀释的参考菌株基因组dna加入前述反应体系，重复试验显示检测样品过程中具有很好重复性。稀释模板浓度对数值和拷贝数值之间也呈良好的线性关系r2≥0.95。说明该方法具有较好的精确度和良好的稳定性。
本发明与现有技术相比，具有以下优点:
1)本发明试剂盒组分配比合理，使用方便，检测快捷，准确；
2)本发明检测方法简化了检测流程，而且无需制作标准曲线，缩短了检测周期，且无需厌氧装置；
3)本发明检测方法整个过程无需使用标准曲线，且与新一代测序无缝对接直接，对基因拷贝数可执行绝对定量分析。
4)数字pcr检测系统通过微滴化处理，可以大大减少背景和基质的干扰，灵敏度可以低至1个拷贝，因此，对低浓度基因浓度的细微变化进行准确及重复性佳的检测。
5)采用本发明检测方法在同一反应体系即可实现同时产气荚膜梭菌和etx进行精准检测。具有较好产业化前景。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明做进一步描述：
实施例1
本发明检测食品中产气荚膜梭菌及etx的引物，该引物的序列分别为：
上游引物recaf:tgggagattctcacgttggtc
下游引物recar:gcttgcttaaatggaggagca
探针recap:acaacaccaggtggtagagcgt
上游引物etxf：tgtgggaacttcgatacaagca
下游引物etxr：tggtgccttaatagaaagactcct
探针etxp：gtggaagtgaatggggagagatacct。
实施例2
本发明一种检测食品中产气荚膜梭菌及etx的试剂盒，其中20μl反应体系包括以下组分：
其中2×ddpcrsupermix10.0μl，产气荚膜梭菌和etx上、下游引物各1.0μl、探针各1.0μl，dna模板4.0μl。
其中引物序列如下:
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下游引物recar:gcttgcttaaatggaggagca
探针recap:acaacaccaggtggtagagcgt
上游引物etxf：tgtgggaacttcgatacaagca
下游引物etxr：tggtgccttaatagaaagactcct
探针etxp：gtggaagtgaatggggagagatacct。
实施例3
本发明一种检测食品中产气荚膜梭菌及etx的试剂盒，其中20μl反应体系包括以下组分：
其中2×ddpcrsupermix10.0μl，产气荚膜梭菌和etx上、下游引物各1.0μl、探针各1.0μl，dna模板4.0μl。
其中引物序列如下:
上游引物recaf:tgggagattctcacgttggtc
下游引物recar:gcttgcttaaatggaggagca
探针recap:acaacaccaggtggtagagcgt
上游引物etxf：tgtgggaacttcgatacaagca
下游引物etxr：tggtgccttaatagaaagactcct
探针etxp：gtggaagtgaatggggagagatacct。
所述的上游引物recaf与上游引物etxf的含量比例为0.1:1。所述的下游引物recar与下游引物etxr的含量比例为0.1:1。
实施例4
本发明一种检测食品中产气荚膜梭菌及etx的试剂盒，其中20μl反应体系包括以下组分：
其中2×ddpcrsupermix10.0μl，产气荚膜梭菌和etx上、下游引物各1.0μl、探针各1.0μl，dna模板4.0μl。
其中引物序列如下:
上游引物recaf:tgggagattctcacgttggtc
下游引物recar:gcttgcttaaatggaggagca
探针recap:acaacaccaggtggtagagcgt
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下游引物etxr：tggtgccttaatagaaagactcct
探针etxp：gtggaagtgaatggggagagatacct。
所述的上游引物recaf与上游引物etxf的含量比例为0.5:1。所述的下游引物recar与下游引物etxr的含量比例为0.5:1。
实施例5
本发明一种检测食品中产气荚膜梭菌及etx的试剂盒，其中20μl反应体系包括以下组分：
其中2×ddpcrsupermix10.0μl，产气荚膜梭菌和etx上、下游引物各1.0μl、探针各1.0μl，dna模板4.0μl。
其中引物序列如下:
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探针recap:acaacaccaggtggtagagcgt
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所述的上游引物recaf与上游引物etxf的含量比例为0.5:1。所述的下游引物recar与下游引物etxr的含量比例为0.1:1。
实施例6
本发明一种检测食品中产气荚膜梭菌及etx的试剂盒，其中20μl反应体系包括以下组分：
其中2×ddpcrsupermix10.0μl，产气荚膜梭菌和etx上、下游引物各1.0μl、探针各1.0μl，dna模板4.0μl。
其中引物序列如下:
上游引物recaf:tgggagattctcacgttggtc
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探针recap:acaacaccaggtggtagagcgt
上游引物etxf：tgtgggaacttcgatacaagca
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探针etxp：gtggaagtgaatggggagagatacct。
所述的上游引物recaf与上游引物etxf的含量比例为0.1:1。所述的下游引物recar与下游引物etxr的含量比例为0.5:1。
实施例7
本发明一种检测食品中产气荚膜梭菌及etx的试剂盒，其中20μl反应体系包括以下组分：
其中2×ddpcrsupermix10.0μl，产气荚膜梭菌和etx上、下游引物各1.0μl、探针各1.0μl，dna模板4.0μl。
其中引物序列如下:
上游引物recaf:tgggagattctcacgttggtc
下游引物recar:gcttgcttaaatggaggagca
探针recap:acaacaccaggtggtagagcgt
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探针etxp：gtggaagtgaatggggagagatacct。
所述的上游引物recaf与上游引物etxf的含量比例为1:1。所述的下游引物recar与下游引物etxr的含量比例为1:1。
实施例8
本发明一种检测食品中产气荚膜梭菌及etx的试剂盒，其中20μl反应体系包括以下组分：
其中2×ddpcrsupermix10.0μl，产气荚膜梭菌和etx上、下游引物各1.0μl、探针各1.0μl，dna模板4.0μl。
其中引物序列如下:
上游引物recaf:tgggagattctcacgttggtc
下游引物recar:gcttgcttaaatggaggagca
探针recap:acaacaccaggtggtagagcgt
上游引物etxf：tgtgggaacttcgatacaagca
下游引物etxr：tggtgccttaatagaaagactcct
探针etxp：gtggaagtgaatggggagagatacct。
所述的上游引物recaf与上游引物etxf的含量比例为0.1:1。所述的下游引物recar与下游引物etxr的含量比例为1:1。
实施例9
本发明检测食品中产气荚膜梭菌及etx的方法，包括以下步骤：
a、提取样品dna；
b、将各反应组分加入实施例2-8任一所述20.0μl反应体系，然后加入70.0μl矿物油，混匀后转移到微滴发生器上自动产生微滴；
c、将产生的微滴仔细全部转移到96孔反应板pcr反应管中；再将96孔反应板在封膜仪上封膜，并置于普通pcr仪进行pcr反应。
d、打开微滴荧光检测器应用软件，将pcr反应结束后的96孔反应板直接插入设备，检测每pcr反应管中微滴的pcr反应情况,最后根据珀松分布定律算出待测基因的拷贝数。
其中引物序列如下:
上游引物recaf:tgggagattctcacgttggtc
下游引物recar:gcttgcttaaatggaggagca
探针recap:acaacaccaggtggtagagcgt
上游引物etxf：tgtgggaacttcgatacaagca
下游引物etxr：tggtgccttaatagaaagactcct
探针etxp：gtggaagtgaatggggagagatacct。
所述的荧光pcr扩增按以下步骤进行：
(1)(1)94℃预变性3min；
(2)94℃变性10s，59.0℃退火1min，共进行40个循环；
(3)98℃酶热失活10min；
(4)4℃停止反应。
实施例10
挑取经可疑的单个菌落,加入200μl灭菌重蒸水中,制备产气荚膜梭菌菌悬液,将其置于干式恒温器上100℃加热20min,然后于12000r/min离心10min,取上清液分装eppendorf管,作为扩增反应的dna粗制模板，溶解于50μl的te溶液中。然后取4.0μl提取物加入到以下反应体系：
其中2×ddpcrsupermix10.0μl，产气荚膜梭菌和etx上、下游引物各1.0μl、探针各1.0μl，dna模板4.0μl。其中引物序列如下:
上游引物recaf:tgggagattctcacgttggtc
下游引物recar:gcttgcttaaatggaggagca
探针recap:acaacaccaggtggtagagcgt
上游引物etxf：tgtgggaacttcgatacaagca
下游引物etxr：tggtgccttaatagaaagactcct
探针etxp：gtggaagtgaatggggagagatacct。
进行pcr扩增，按以下步骤进行：
(1)94℃预变性3min；
(2)94℃变性10s，59.0℃退火1min，共进行40个循环；
(3)98℃酶热失活10min；
(4)4℃停止反应。
结果分析
本发明研制过程中，同时采用培养基的传统培养方法，进行产气荚膜梭菌菌落数量测定的对照。实验重复三次，产气荚膜梭菌结果取平均值。结果显示，本发明采用数字pcr方法对食品中产气荚膜梭菌数量的测定结果，与传统培养方法检测出的菌落总数结果相关性高，这说明本方法具有很高准确度。另外，本发明数字pcr尽欢方法的单样本全程检测时间为4小时，远短于现有传统的平板培养计数方法，检测产气荚膜梭菌同时，还能对etx基因进行准确定量检测，能够准确快速评价食源性致病菌的传播风险。因此具有良好的技术优势和产业化发展前景。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征以及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
sequencelisting
<110>中山出入境检验检疫局检验检疫技术中心
<120>检测食品中产气荚膜梭菌和etx基因的引物、试剂盒和方法
<130>检测食品中产气荚膜梭菌和etx基因的引物、试剂盒和方法
<160>6
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>21
<212>dna
<213>clostridiumperfringens
<400>1
tgggagattctcacgttggtc21
<210>2
<211>21
<212>dna
<213>clostridiumperfringens
<400>2
gcttgcttaaatggaggagca21
<210>3
<211>22
<212>dna
<213>clostridiumperfringens
<400>3
acaacaccaggtggtagagcgt22
<210>4
<211>22
<212>dna
<213>clostridiumperfringens
<400>4
tgtgggaacttcgatacaagca22
<210>5
<211>24
<212>dna
<213>clostridiumperfringens
<400>5
tggtgccttaatagaaagactcct24
<210>6
<211>26
<212>dna
<213>clostridiumperfringens
<400>6
gtggaagtgaatggggagagatacct26