本发明涉及他克莫司纳米晶及其人工泪液复合物与制备方法；具体涉及一种他克莫司纳米晶及其制备方法与应用和他克莫司纳米晶人工泪液复合物及其制备方法与应用，属于药物剂型及复合药物制备领域。
背景技术：
随着电视、电脑和手机的普及以及雾霾等严重的环境污染，干眼(dryeye，de)的发病率逐年升高，已经成为眼科最常见的疾病之一，严重影响民众眼部健康及生活质量(zeevms,millerdd,latkanyr.clinicalophthalmology,2014,8,581)。目前，临床上治疗干眼的药物有很多种，人工泪液由于其具有润滑和保湿眼表的作用，因而常用于改善和缓解干眼症状。然而，近些年有研究表明非感染性的免疫性炎症在干眼的致病过程中起到决定性作用(stevensonw,chauhansk,danar.archophthalmol,2012,130,90)，因而选择免疫抑制药物用于治疗干眼的免疫炎症受到广泛的关注。他克莫司(tacrolimus，fk506)是一种新型的免疫抑制药物。研究表明，生理状态下他克莫司能够阻止t细胞核脱磷酸。这一作用从根本上抑制了淋巴细胞因子的生成，从而阻止炎症因子的释放，起到调节免疫的作用(zhaij,guj,yuanj,etal.biodrugsclinicalimmunotherapeuticsbiopharmaceuticals&genetherapy,2011,25,89)。临床上治疗干眼症的主要的给药途径是局部滴药。但是，他克莫司属于疏水性药物，并且随着泪液不断稀释滴入结膜囊的药液快速经鼻泪管流失，药物的生物利用度较低。虽然通过乳液技术可以获得均匀分散的聚合物微球或纳米粒子类载药系统，然而包封率低、原药浪费、药物晶型改变以及辅料生物安全性的问题仍有待解决。
近年来，药物纳米晶在药物靶向递送研究中受到重视。lee等应用阳极氧化铝模板成功的合成了小于100nm的纳米纯药，大大提高了产率，为后续多药联合和实际应用提供了基础(zhang,j.,etal.nanolett,2015,15,313)。yang等报道了棒状的洛伐他汀纳米晶比传统的球状纳米晶显现出更好的溶解性，并提高了洛伐他汀的体内生物利用度(guo,m.,etal.colloidssurfbbiointerfaces,2015,128,410)。但上述药物均存在稳定性和生物利用度差，并且药效低和患者顺从性不高。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种他克莫司纳米晶及其人工泪液复合物与制备方法；具体提供一种他克莫司纳米晶及其制备方法与应用和他克莫司纳米晶人工泪液复合物及其制备方法与应用，本发明他克莫司纳米晶具有亲水性、生物利用度高、低毒安全的优良特性，他克莫司纳米晶人工泪液复合物具有延长药物释放时间、角膜滞留时间，减小高浓度药物直接刺激作用，发挥免疫调节性抗炎和润滑协同作用；能用于制备治疗眼部疾病药物中。
本发明提供的一种他克莫司，它为纳米晶。
上述的他克莫司中，所述纳米晶的晶型为针状和/或规则六边形；
所述纳米晶的厚度可为33.32～947nm；和/或，
所述纳米晶的长度可为710nm～5.4μm。
本发明中，所述纳米晶的长具体可为3.4μm±1.9、3.2μm±2.6；所述纳米晶的厚度具体可为0.03μm±0.02、0.5μm±0.2、0.7μm±0.15。
本发明还提供了上述的他克莫司纳米晶的制备方法，包括如下步骤：将所述他克莫司采用重结晶方法制备，即得到所述他克莫司纳米晶。
上述的制备方法中，所述重结晶方法的步骤具体如下：将他克莫司的无水乙醇溶液滴加到水或聚乙烯醇水溶液中，同时高速搅拌得到混悬液；将所述混悬液继续搅拌，挥发溶液中的无水乙醇，将所得溶液多次离心除去上层清液，即得到所述他克莫司纳米晶。
上述的制备方法中，所述他克莫司的无水乙醇溶液的浓度为4～16mg/ml，具体可为4mg/ml或4～10mg/m；所述聚乙烯醇水溶液的质量体积浓度为1～10g/l，具体可为1g/l、10g/l；
所述他克莫司的无水乙醇溶液与所述水或所述聚乙烯醇水溶液的体积可为1：1～20，具体可为1：10；所述滴加的速率为0.5～2ml/min，具体可为0.5ml/min、1ml/min、2ml/min；所述高速搅拌的速率为3600～20000rpm，具体可为3600rpm、7200rpm、20000rpm；所述继续搅拌的速率为600～800rpm，具体可为800rpm，所述继续搅拌挥发的时间可为8～12h，具体可为8h、12h。
本发明所述他克莫司应用于制备治疗眼部疾病药物中。
本发明中，所述眼部疾病具体为眼干。
本发明还提供了一种人工泪液修饰的他克莫司纳米晶复合物，它由所述他克莫司的纳米晶为核心和包覆所述核心的壳层组成；
所述壳层包括多个双层，每个双层由内至外依次为羧甲基纤维素钠层和阳离子聚合物层组成；
所述阳离子聚合物为聚烯丙基胺盐酸盐、聚赖氨酸和聚乙烯亚胺中的至少一种。
本发明中，所述壳层具体可包括3个、4个、2～4个或2～6个双层。
本发明进一步提供了上述他克莫司纳米晶人工泪液复合物的制备方法，包括如下步骤：
1)将所述他克莫司纳米晶与阳离子聚合物的溶液混合并相互作用，得到混合溶液1；然后将所述混合溶液1离心除去上清液，得到阳离子聚合物的纳米微粒a；
2)将所述修饰阳离子聚合物的他克莫司纳米晶与羧甲基纤维素钠的溶液混合并相互作用，得到混合溶液2；然后将所述混合溶液2离心除去上清液，得到进一步修饰聚烯丙基胺盐酸盐的纳米微粒b；
3)将所述纳米微粒b重复进行上述步骤1)-2)多次，然后进行终止交联反应，即得到所述他克莫司纳米晶人工泪液复合物。
本发明中，所述他克莫司纳米晶人工泪液复合物的制备方法采用层层自组装的方法。
上述的制备方法中，所述阳离子聚合物的溶液为以浓度可为0.5m的nacl水溶液为溶剂配制，浓度可为1～4mg/ml，具体可为2mg/ml、4mg/ml或2～4mg/ml；
步骤1)中，经混合后使所述他克莫司纳米晶的浓度为1～10mg/ml，具体可为2mg/ml、10mg/ml或2～10mg/ml；所述相互作用的时间可为20～30min，具体可25min；
所述羧甲基纤维素钠的溶液为以浓度可为0.5m的nacl水溶液为溶剂配制，浓度0.5～4mg/ml，具体可为2mg/ml、4mg/ml或2～4mg/ml；
步骤2)中，经混合后使所述修饰阳离子聚合物的他克莫司纳米晶的浓度为1～10mg/ml，具体可为2mg/ml、10mg/ml或2～10mg/ml；所述相互作用的时间可为20～30min，具体可25min；
步骤3)中，重复步骤1)-2)的次数为1～3次；所述终止交联反应的具体步骤如下：将反应体系中加入戊二醛溶液，反应40min～60min；然后加入30mm硼氢化钠水溶液反应20～40min；然后离心除去上清液。所述终止交联反应中还包括在离心除去上清液之后洗涤的步骤，使用水清洗多次。具体实施例中，所述戊二醛溶液的体积浓度为2％，加入所述戊二醛溶液后体系中纳米微粒的浓度为2mg/ml，反应具体时间可为60min，30mm的硼氢化钠水溶液，终止交联反应具体时间可为30min。
本发明所述他克莫司纳米晶人工泪液复合物的制备方法中，在步骤1)中离心除去上清之后还包括洗涤的步骤；具体可用0.5m的nacl水溶液洗涤多次，所述洗涤的次数具体可为1～6次或3次；
在步骤2)中离心除去上清之后还包括洗涤的步骤；具体可用0.5m的nacl水溶液洗涤多次，所述洗涤的次数具体可为1～6次或3次。
本发明还提供了上述的制备方法制备得到的所述他克莫司纳米晶人工泪液复合物。
本发明所述他克莫司纳米晶人工泪液复合物应用于制备治疗眼部疾病药物中。本发明，所述眼部疾病具体为眼干。
本发明具有以下优点：
本发明他克莫司纳米晶的尺寸为纳米级别，药物晶体的表面积增大，药物溶解度增加，进而提高药物的生物利用度；本发明人工泪液修饰的他克莫司纳米晶无毒性，运用羧甲基纤维素钠对他克莫司表面进行改性，既能改变他克莫司的疏水性，减小高浓度药物直接刺激作用，发挥免疫调节性抗炎和润滑联合用药的作用，在眼科及药物递送领域具有良好的应用前景。本发明的方法工艺成熟、重现性好，所用材料具有良好的生物相容性。
附图说明
图1(a)为本发明实施例1制备的他克莫司纳米晶的电镜图，图1(b)为本发明实施例2制备的他克莫司纳米晶的电镜图。
图2(a)为本发明实施例3制备的他克莫司纳米晶的电镜图，图2(b)为本发明实施例4制备的他克莫司纳米晶的电镜图。
图3为对本发明实施例8中x射线衍射(xrd)图谱。
图4为对本发明实施例11制备的他克莫司纳米晶人工泪液复合物的的细胞毒性结果图。
图5为人角膜上皮细胞(hces)对实施例12制备的他克莫司纳米晶人工泪液复合物的吞噬结果图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、他克莫司纳米晶的制备
他克莫司纳米晶的制备方法，具体包括如下步骤：
将他克莫司药物晶体与无水乙醇溶液混合，使浓度为4mg/ml，得到他克莫司无水乙醇溶液。将上述溶液以2ml/min的滴加速率加入到水溶液(他克莫司无水乙醇溶液与水溶液的体积比为1:10)中，以7200rpm的速率高速搅拌得到混悬液。将所述混悬液以800rpm的速率继续搅拌12h，挥发溶液中的无水乙醇，得到最终溶液。将最终溶液多次离心除去上层清液，即得到他克莫司纳米晶。
其电镜图如图1(a)所示，由图1(a)可知，他克莫司纳米晶的晶型为针形，纳米晶的长约3.2μm±2.6。
实施例2、他克莫司纳米晶的制备
他克莫司纳米晶的制备方法，具体包括如下步骤：
将他克莫司药物晶体与无水乙醇溶液混合，使浓度为4mg/ml，得到他克莫司无水乙醇溶液。将上述溶液以2ml/min的滴加速率加入到质量体积浓度为1g/l的聚乙烯醇(简称pvc)水溶液(他克莫司无水乙醇溶液与pvc水溶液的体积比为1:10)中，以7200rpm的速率高速搅拌得到混悬液。将所述混悬液以800rpm的速率继续搅拌12h，挥发溶液中的无水乙醇，得到最终溶液。将最终溶液多次离心除去上层清液，即得到他克莫司纳米晶。
其电镜图如图1(b)所示，由图1(b)可知，他克莫司纳米晶的晶型为规则六边形，纳米晶的长约3.4μm±1.9、厚度为0.5μm±0.2。
实施例3、他克莫司纳米晶的制备
他克莫司纳米晶的制备方法，具体包括如下步骤：
将他克莫司药物晶体与无水乙醇溶液混合，使浓度为4mg/ml，得到他克莫司无水乙醇溶液。将上述溶液以2ml/min的滴加速率加入到质量体积浓度为1g/l的聚乙烯醇水溶液(他克莫司无水乙醇溶液与pvc水溶液的体积比为1:10)中，以11200rpm的速率高速搅拌得到混悬液。将所述混悬液以800rpm的速率继续搅拌12h，挥发溶液中的无水乙醇，得到最终溶液。将最终溶液多次离心除去上层清液，即得到他克莫司纳米晶。
其电镜图如图2(a)所示，由图2(a)可知，他克莫司纳米晶的晶型为规则六边形，纳米晶的厚度为0.7μm±0.15。
实施例4、他克莫司纳米晶的制备
他克莫司纳米晶的制备方法，具体包括如下步骤：
将他克莫司药物晶体与无水乙醇溶液混合，使浓度为4mg/ml，得到他克莫司无水乙醇溶液。将上述溶液以1ml/min的滴加速率加入到质量体积浓度为1g/l的聚乙烯醇水溶液(他克莫司无水乙醇溶液与pvc水溶液的体积比为1:10)中，以3600rpm的速率高速搅拌得到混悬液。将所述混悬液以800rpm的速率继续搅拌12h，挥发溶液中的无水乙醇，得到最终溶液。将最终溶液多次离心除去上层清液，即得到他克莫司纳米晶。
其电镜图如图2(b)所示，由图2(b)可知，他克莫司纳米晶的晶型为规则六边形，纳米晶的厚度约为0.03μm±0.02。
实施例5、他克莫司纳米晶的制备
他克莫司纳米晶的制备方法，具体包括如下步骤：
将他克莫司药物晶体与无水乙醇溶液混合，使浓度为16mg/ml，得到他克莫司无水乙醇溶液。将上述溶液以0.5ml/min的滴加速率加入到质量体积浓度为10g/l的聚乙烯醇水溶液(他克莫司无水乙醇溶液与pvc水溶液的体积比为1:10)中，以3600rpm的速率高速搅拌得到混悬液。将所述混悬液以600rpm的速率继续搅拌8h，挥发溶液中的无水乙醇，得到最终溶液。将最终溶液多次离心除去上层清液，即得到他克莫司纳米晶。
实施例6、他克莫司纳米晶的制备
他克莫司纳米晶的制备方法，具体包括如下步骤：
将他克莫司药物晶体与无水乙醇溶液混合，使浓度为4mg/ml，得到他克莫司无水乙醇溶液。将上述溶液以1ml/min的滴加速率加入到质量体积浓度为1g/l的聚乙烯醇水溶液(他克莫司无水乙醇溶液与pvc水溶液的体积比为1:10)中，以11200rpm的速率高速搅拌得到混悬液。将所述混悬液以800rpm的速率继续搅拌12h，挥发溶液中的无水乙醇，得到最终溶液。将最终溶液多次离心除去上层清液，即得到他克莫司纳米晶。
实施例7、他克莫司纳米晶的制备
他克莫司纳米晶的制备方法，具体包括如下步骤：
将他克莫司药物晶体与无水乙醇溶液混合，使浓度为4mg/ml，得到他克莫司无水乙醇溶液。将上述溶液以0.5ml/min的滴加速率加入到质量体积浓度为1g/l的聚乙烯醇水溶液(他克莫司无水乙醇溶液与pvc水溶液的体积比为1:10)中，以20000rpm的速率高速搅拌得到混悬液。将所述混悬液以800rpm的速率继续搅拌12h，挥发溶液中的无水乙醇，得到最终溶液。将最终溶液多次离心除去上层清液，即得到他克莫司纳米晶。
实施例8、他克莫司纳米晶的x射线衍射分析
本发明对他克莫司三种结果进行了x-射线粉末衍射的测定。将原料药物粉末充分研磨，放入x射线衍射仪检测器中进行扫描，获得xrd图谱，如图3所示。测定条件为常温，石墨单色器，扫描速度6°/min-2θ，扫描范围3°～60°，扫描间隔0.02°电压40kv，电流200ma，
实施例9、他克莫司纳米晶人工泪液复合物的制备
他克莫司纳米晶人工泪液复合物的制备方法，具体包括如下步骤：
1)将本发明实施例1制备的他克莫司纳米晶与浓度为2mg/ml的聚烯丙基胺盐酸盐溶液(以0.5m的nacl水溶液为溶剂配制)混合，使药物微粒浓度为2mg/ml，并相互作用25min，得混合液一，离心，除去上清液，用0.5m的nacl水溶液洗涤3次，得到第一种微粒；
2)将第一种微粒与浓度为2mg/ml的羧甲基纤维素钠溶液(以0.5m的nacl水溶液为溶剂配制)混合，使第一种微粒浓度为2mg/ml，并相互作用25min，得混合液二，离心，除去上清液，用0.5m的nacl水溶液洗涤3次，得到第二种微粒；
3)重复步骤1)和步骤2)2次；
4)将步骤3)中获得的微粒与体积浓度为2％的戊二醛水溶液混合使浓度为2mg/ml，反应60min；加入30mm的硼氢化钠水溶液，终止交联反应30min，离心，用水洗3次，得到他克莫司纳米晶人工泪液复合物，又称fk506-(pah/cmc)3药物。
实施例10、他克莫司纳米晶人工泪液复合物的制备
他克莫司纳米晶人工泪液复合物的制备方法，具体包括如下步骤：
1)将本发明实施例1制备的他克莫司纳米晶与浓度为4mg/ml的聚烯丙基胺盐酸盐溶液(以0.5m的nacl水溶液为溶剂配制)混合，使药物微粒浓度为10mg/ml，并相互作用25min，得混合液一，离心，除去上清液，得到第一种微粒；
2)将第一种微粒与浓度为4mg/ml的羧甲基纤维素钠溶液(以0.5m的nacl水溶液为溶剂配制)混合使第一种微粒浓度为10mg/ml，并相互作用25min，得混合液二，离心，除去上清液，得到第二种微粒；
3)重复步骤1)和步骤2)3次；
4)将步骤3)中获得的微粒与体积浓度为2％的戊二醛水溶液混合使浓度为10mg/ml，反应40min；加入30mm的硼氢化钠水溶液，终止交联反应20min，离心，水洗3次，得到他克莫司复合纳米晶人工泪液复合物，又称fk506-(pah/cmc)4药物。
实施例11、他克莫司纳米晶人工泪液复合物的细胞毒性实验
具体步骤如下：
当细胞贴壁后，取不同质量浓度(0.2、0.5、1、1.5、2mg/ml)的本发明实施例9中制备得到的他克莫司复合纳米晶fk506-(pah/cmc)3与细胞共孵育4h，将未作处理的人角膜上皮细胞的cck-8吸光度值设置为100％。图4所示，通过分析数据得出细胞存活率基本在92％～96％的范围内，与未放药物的对照组相比较无统计学意义(p＞0.05)，说明本发明fk506-(pah/cmc)3药物在实验设计的浓度范围内没有细胞毒性。
实施例12、角膜上皮细胞对他克莫司纳米晶人工泪液复合物(fk506-(pah/cmc)3)的吞噬实验
具体步骤如下：
1)细胞培养至对数生长期，胰酶消化后，1x106个细胞/孔进行铺板。孵育箱内孵育，静置4h细胞贴壁。
2)将fitc标记的pah包裹在第二层。
3)将fitc标记的本发明实施例9中制备得到的fk506-(pah/cmc)3纳米颗粒与细胞孵育24h。
4)用pbs缓冲液(ph7.2～7.4，nacl137mmol/l，kcl2.7mmol/l，na2hpo410mmol/l，kh2po42mmol/l)漂洗3次，以去除表面残留的培养基。
5)将细胞完全浸浴在4％多聚甲醛固定液内，室温固定30min。
6)pbs缓冲液漂洗浸泡3次，每次3min。
7)在培养皿内加入抗体液，常温条件下封闭1h，以防特异性染色(封闭液：300mg牛血清白蛋白bsa)。
8)在培养皿内加入鬼笔环肽工作液染细胞骨架，在37℃空气浴箱内孵育40min。
9)在培养皿内加入dapi工作液染细胞核。在37℃空气浴箱内孵育5min，后在常温下，用pbs漂洗3次。
10)在共聚焦显微镜下观察。
共聚焦显微镜图观察到的图像如图所示，本发明实施例9中制备得到的他克莫司复合纳米晶fk506-(pah/cmc)3能进入人角膜上皮细胞，说明本发明生物相容性好。