本发明涉及动物生物技术领域，具体涉及一种基于获取特定供体细胞的提高哺乳动物克隆效率的方法。
背景技术：
哺乳动物的体细胞核移植(克隆)技术在畜牧业、人类医学、药学及生命科学等领域都有重要的应用价值，但目前该技术的效率仍然很低。这严重限制了该技术的应用。以猪的克隆技术为例，该技术效率低下主要体现在猪克隆胚胎的发育出生效率只有约0.5％(出生克隆猪数/移植至代孕母猪的卵裂期克隆胚胎数)，远低于猪体内受精胚胎的发育出生效率，其约为75％。已有研究显示，导致哺乳动物克隆胚胎的发育出生效率远低于体内受精胚胎的其中一个主要原因是相对于体内受精胚胎，克隆胚胎中的xist基因(调控x染色体失活的主效基因)的表达模式是异常的。且已有研究通过基因敲除或rna干扰等方法纠正哺乳动物克隆胚胎中错误的xist基因表达模式从而显著提高哺乳动物克隆胚胎的发育出生效率。xist基因属于印记基因，其表达模式一般与其差异性甲基化区域(differentiallymethylatedregion，dmr)的dna甲基化水平相关。已有研究显示，哺乳动物克隆胚胎在囊胚期的xist-dmr的dna甲基化水平显著高于体内受精胚胎，并且这可能是导致哺乳动物克隆胚胎发育出生效率低于体内受精胚胎的其中一个主要原因。因此，如果能够降低哺乳动物克隆胚胎在囊胚期的xist-dmr的dna甲基化水平，将可能提高猪以及其它哺乳动物克隆胚胎的发育出生效率。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种基于获取特定供体细胞的提高哺乳动物克隆效率的方法。
根据本发明的一个方面，提供了一种基于获取特定供体细胞的提高哺乳动物克隆效率的方法，该方法通过筛选出xist–dmr具有低水平dna甲基化的供体细胞克隆团用于核移植实验，进而提高哺乳动物克隆效率。
优选地，该方法应用于提高猪的克隆效率。
进一步地，筛选出用于核移植实验的为xist–dmr具有低水平dna甲基化的猪供体细胞克隆团。
进一步地，供体细胞克隆团的xist-dmrdna甲基化水平采用亚硫酸盐转化方法准确测定。
进一步地，供体细胞克隆团通过单细胞接种公猪成纤维细胞获得。
进一步地，方法通过以下步骤实现：
1)单细胞接种公猪成纤维细胞获得一批供体细胞克隆团，每个克隆团中取部分细胞用于高分辨率溶解曲线(hrm)法检测；
2)用高分辨率熔解曲线法快速测定所述供体细胞克隆团相对的xist-dmrdna甲基化水平，对供体细胞进行初步筛选；
3)选取xist-dmrdna甲基化水平相对较低的所述供体细胞克隆团采用亚硫酸盐转化(bsp)方法准确测定其xist-dmr的dna甲基化水平；
4)选取xist-dmrdna甲基化水平较低的所述供体细胞克隆团作为供体细胞进行核移植，激活重构胚，将所述重构胚移植至代孕母猪子宫内，待克隆小猪出生。
采用以上技术方案的基于获取特定供体细胞的提高哺乳动物克隆效率的方法产生的克隆胚胎的囊胚期xist-dmr的dna甲基化水平更低，从而使克隆胚胎的出生率显著提高。
附图说明
图1为xist-dmr片段标准品甲基化串珠图。
图2为xist-dmr片段标准品归一化熔解曲线。
图3为xist-dmr片段标准品线性回归图。
图4为hrm法检测的不同供体细胞克隆团的xist-dmrdna甲基化水平图。
图5为进一步用bsp法检测的供体细胞克隆团和对照组的xist-dmrdna甲基化水平图。
图6为低甲基化组和对照组的囊胚期克隆胚胎的xist-dmrdna甲基化水平比较图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
本发明所涉及的xist-dmr片段序列来源于genbank：kc149530.1。
1供体细胞克隆团培养
1.1细胞复苏
将存有杜洛克公猪510d细胞的冻存管置入37℃恒温水浴锅中，快速晃动至细胞冻存液完全溶解。用酒精棉仔细擦拭冻存管，将细胞悬液转移至15ml离心管中，800rpm离心5min，去除上清液，加入2ml10％fbs细胞培养基重悬细胞。将细胞悬液转移至10cm细胞培养板，再加入8ml10％fbs细胞培养基，轻轻摇晃培养板以铺匀细胞后置于37℃，5％co2细胞培养箱内培养。待细胞贴壁(8-12h)后为细胞换液。
1.2细胞传代
待细胞长满培养板后为细胞进行传代。轻轻吸去细胞培养基后延培养板板壁加入dpbs缓冲液洗两遍，清除残留培养基。加入2ml0.25％胰酶，置于37℃消化1min。在显微镜下观察到细胞形态不再伸展，缩为圆形时，立即加入2ml完全培养基(即含10～15％血清的培养基)终止消化。轻轻吹吸细胞悬液，将仍贴附于板低的细胞吹打下来。将细胞悬液转移至15ml离心管中，800rpm离心5min，去除上清液。加入dpbs缓冲液重悬细胞，800rpm离心5min，去除上清液。加入培养基重悬细胞，并接种至新的培养板上，置于37℃，5％co2细胞培养箱内培养。
1.3细胞冻存
培养至f1代且状态良好的细胞需进行冻存以备后续需要。消化收集细胞方法同上，细胞经过两次dpbs缓冲液重悬去除残余胰酶。冻存液按dmem:fbs:dmso＝5：4：1的比例配成，冻存液注意避光。向细胞加入1ml冻存液，转移至1ml冻存管中，拧紧管盖，标记好细胞类型、名称、代数、时间，将冻存管放入冻存盒中，将冻存盒放入-80℃冰箱，24h后转入液氮中长期保存。
1.4单细胞培养
单细胞挑取方法采用显微操作。将玻璃吸管在酒精灯上灼烧，趁热拉出内径约20μm的微吸针。将汇合度到90％的细胞消化下来后制成细胞悬液，取少量置于培养皿内放在体视显微镜下观察。首先在显微镜下找到微吸针针尖，寻找状态良好的细胞，利用微吸针挑选细胞转至96孔板中，每个孔内预先加入100ul细胞培养基(15％fbs、0.6％双抗的dmem)。单细胞挑取24h后，为细胞进行第一次更换培养基，之后每7天换一次培养基，根据细胞生长状况慢慢降低双抗浓度。待细胞长满96孔后消化传代至48孔。单细胞养至长满48孔，将细胞消化下来，一部分用于细胞冻存，另一部分用dpbs缓冲液重悬，-80℃冻存用于抽提dna。
2高分辨率熔解曲线法快速测定xist-dmrdna甲基化水平
2.1标准品制备
随机选用母猪dna利用亚硫酸盐测序(bisulfitegenomicsequence，bsp)法获得xist-dmr片段的测序结果，并根据测序的甲基化串珠图挑选xist-dmr全甲基化/零甲基化的单克隆菌液。取100ul菌液加入50ml离心管中，另加入30-45mlla培养基，在37℃、250rpm的摇床培养12-16h。按照omegaplasmidmidikit试剂盒说明书抽提质粒，测定浓度，-20℃冰箱保存。
将获得的标准品质粒定量到1ng/ul，以全甲基化质粒为100％标准品。以零甲基化质粒为0％标准品，按100％标准品与0％标准品9：1的比例配成90％的标准品，并依次配齐80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％的标准品。
使用ecostudy定量pcr仪进行pcr扩增和高分辨率溶解曲线(high-resolutionmelting，hrm)检测，采用hrmanalysiskit(evagreen)内的饱和荧光染料进行分析。10ulpcr反应体系见表1，甲基化pcr引物序列见表2。每个标准品进行3个重复，pcr参数为:95℃变性2min；pcr循环45轮(95℃10s+60℃30s)；溶解曲线分析每0.1℃收集一次荧光。
表1hrm-pcr反应体系
表2pcr引物序列
2.2样品检测
按照亚硫酸盐转化试剂盒ezdnamethylation-directtmkit说明书对上述细胞样品进行亚硫酸氧盐修饰，取12ul细胞样放置于pcr管中，向pcr管中加1ulproteinasek和13ulm-digestionbuffer(2x)，混匀后50℃孵育20min。随后取20ul加入130ul已配制好的ctconversionreagent，98℃变性8min，64℃避光反应3.5h，4℃暂时保存或者立即对dna进行纯化回收。
dna样品的pcr扩增及hrm分析均在ecostudy定量pcr仪上进行，按照hrmanalysiskit(evagreen)试剂盒操作，方法同上。
3亚硫酸盐转化测序方法准确测定xist-dmrdna甲基化水平
由于bsp法操作繁杂，不适用于大批量的样品检测，因此本方法先使用hrm方法对供体细胞克隆团进行快速的初步筛选。根据hrm检测结果，从中选取甲基化水平较高和较低的供体细胞克隆团各4个，并选取同一来源未经过筛选的供体细胞作为对照组，按照亚硫酸盐转化试剂盒(ezdnamethylation-directtmkit)方法对挑选的克隆团细胞样品进行亚硫酸盐转化及纯化，以亚硫酸盐修饰后dna样品为模板，对目的基因片段xist-dmr进行巢氏pcr扩增。第一轮反应体系见表3，pcr参数为：95℃变性10min；pcr循环30轮(94℃30s+55℃30s+72℃30s)：72℃延伸7min。第一步所得pcr产物按照dna纯化回收试剂盒(
第二轮pcr反应体系见表4，pcr参数为：94℃变性2min；pcr循环35轮(94℃30s+59℃30s+72℃30s)：72℃延伸5min。
表3第一轮pcr反应体系
表4第二轮pcr反应体系
扩增后所得pcr产物通过琼脂糖凝胶电泳进行特异性鉴定。鉴定后纯化回收pcr产物，步骤同上，并用核酸浓度仪测定、记录浓度。
根据instaclonepcrcloningkit(thermoscientific)试剂盒，将产物连接至ptz57r/t载体上，连接体系见表5，于22℃反应1h。
表5ptz57r/t连接体系
利用trans5α感受态转化连接产物。将感受态置于冰上解冻，加入1ul连接产物，轻轻混匀后在冰里孵育30min。将离心管放入42℃的水浴锅中热激45s，马上取出在冰上孵育2-3min。向离心管中加入500ullb培养基。将离心管放置在37℃、250rpm/min的恒温空气摇床上培养1h。取20ul混合物均匀涂抹在la固体培养板上，在37℃培养箱培养12-16h。在la固体培养板长出菌落后，挑取单克隆于1.5ml离心管中，离心管中加入1mlla培养基。将离心管放置在37℃、250rpm/min的恒温空气摇床上培养2-4h。取1ul培养基进行菌液pcr鉴定，菌液pcr体系见表6，pcr参数为：94℃变性2min；pcr循环40轮(94℃30s+59℃30s+72℃30s)：72℃延伸5min。
表6菌液pcr反应体系
经鉴定为阳性菌液后，送公司测序，每个细胞样品至少获得10个有效结果。测序结果使用biqanalyzer软件分析，并利用该软件制作甲基化串珠图。
4不同供体细胞克隆团的xist-dmrdna甲基化水平比较
4.1hrm法检测结果
4.1.1标准品制备结果
为了获得全甲基化和零甲基化的xist-dmr片段，利用杜洛克母猪dna通过bsp法获得甲基化串珠图，结果如图1。图1中a测序样品的质粒为0％甲基化水平的标准品，b测序样品的质粒为100％甲基化水平的标准品。
图1的甲基化串珠图每一行表示一个测序结果，每个圆表示一个cpg位点；白色圆圈表示该cpg位点未发生甲基化，黑色圆圈表示该cpg位点发生甲基化。
在图1中，a表示该xist-dmr片段没有cpg位点发生dna甲基化，b表示该xist-dmr片段的所有cpg位点均发生dna甲基化。
将两单克隆菌液扩增抽取质粒，并按比例配成各百分比标准品，使用各标准品进行高分辨率溶解曲线分析，归一化熔解曲线结果如图2。结果的分析采用使用标准品解链曲线的曲线下面积(areaunderthecurve，auc)与已知的标准品甲基化水平进行归一化分析，获得auc-甲基化水平的线性回归图，如图3，可以看出，标准品的线性回归模型具有良好的拟合程度(r2＝0.9947)。
4.1.2样品检测结果
本研究采用hrm法对获得的34个克隆团进行检测，测定获得样品的归一化溶解曲线，采用origin9软件取样品的归一化溶解曲线的auc，并采用标准品线性模型计算克隆团甲基化水平。hrm检测结果见图4。
4.2bsp法检测结果
bsp检测结果见图5。根据hrm结果选取的xist-dmrdna甲基化水平较高的克隆团(g5、g16、g64、g66)的bsp检测结果处于90-100％,而根据hrm结果选取的xist-dmrdna甲基化水平较低的克隆团(g8、g10、g56、g65)的bsp检测结果处于70-80％，对照组甲基化水平为91.31％。
5选取xist-dmrdna甲基化水平较低的克隆团进行核移植
选取g10克隆团细胞(xist-dmrdna甲基化水平为76.45％)作为低甲基化组，选取同一来源未经过筛选的供体细胞(xist-dmrdna甲基化水平为91.31％)作为对照组。将预备做核移植的供体细胞复苏培养至两个96孔板中。将细胞养至接触抑制2-5d后消化，将一部分细胞用显微操作液重悬，用于进行体细胞核移植实验；另一部分细胞用于冻存于-80℃备用。待胚胎发育至囊胚期采用bsp法检测胚胎xist-dmrdna甲基化水平。
6供体细胞的xist-dmrdna甲基化水平对其克隆胚胎在囊胚期的xist-dmrdna甲基化水平的影响
低甲基化组和对照组供体细胞来源的克隆胚胎在囊胚期的xist-dmrdna甲基化水平见图6。结果显示，低甲基化组供体细胞来源的克隆胚胎在囊胚期的xist-dmrdna甲基化水平(平均甲基化水平35.18±8.82％)显著低于对照组供体细胞来源的克隆胚胎(62.67±8.83％)(p＜0.05)。
图6中，散点图上方数字表示该组囊胚平均甲基化水平±标准误，括号中数字表示检测囊胚个数；不同字母上标表示差异显著，相同字母上标表示差异不显著。
7选取xist-dmrdna甲基化水平较低的克隆团进行胚胎移植
另取上述两组细胞作为供体细胞进行核移植，待重构胚生长至二细胞期时将胚胎移入受体母猪子宫内。克隆胚胎体内发育效率见表7。表格中不同字母上标表示差异显著，相同字母上标表示差异不显著。
表7克隆胚胎体内发育效率统计
以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，例如用定点表观遗传修饰技术人为制备在xist-dmr具有低dna甲基化的细胞作为克隆的供体细胞来提高克隆胚胎的发育出生效率，这些都属于本发明的保护范围。此外，以上所述的本发明的实施方式不但可用于提高猪克隆胚胎的发育出生效率，还可以用于提高其它哺乳动物，例如马、牛、羊、狗和猫等的克隆胚胎的发育出生效率，这些也都属于本发明的保护范围。