本发明涉及发酵工程技术领域，特别涉及一种提高桦褐孔菌发酵生产三萜产量的方法。
背景技术：
桦褐孔菌,别名白桦茸,是一种生长于白桦树上的药用真菌,具有多种药效物质成分、较强的生物活性和广泛的药理作用。莫斯科医科院曾将桦褐孔菌认定为抗癌物质；美国将其归属为“特殊的天然物质”；日本将其作为一种治疗剂治疗艾滋病、肝癌和0-157大肠杆菌中毒。日本北方的阿伊努人饮用桦褐孔菌菌核的热水提取物来治疗胃痛和一些炎症；在俄罗斯北部和中部,桦褐孔菌提取物常用来降低病人的动脉和静脉血压,用来治疗牙周炎、湿疹、牛皮藓和皮炎,桦褐孔菌粉末用来治疗化脓性伤口且在治疗期间未发现毒性和药物使用的禁忌。此外，国外研究学者发现,桦褐孔菌在用于研制抗逆转录病毒药物中具有独特的功效且在临床测试中表明桦褐孔菌是一种安全、有效的疾病预防药物。因此，以其为原料开发新药将显示出巨大的发展潜力及经济效益！
随着中国经济的迅速发展，人类生活水平的不断提高，健康问题也越来越受到关注。据报道,截至2030年,全球将有2100万人患有癌症,其死亡人数达到1300万。近几年有研究表明，桦褐孔菌可以预防肿瘤细胞转移和复发,其代谢产物三萜类化合物能在体外抑制癌细胞的生长并诱导癌细胞的凋亡。目前桦褐孔菌三萜的抗癌研究正逐日升温,有关桦褐孔菌三萜抗卵巢癌、肺癌和间质瘤的研究报道尚不多见。研究开发新的抗癌药物已成为当前中医药界研究的热点,因此进一步研究开发桦褐孔菌三萜类化合物的抗肿瘤活性具有重大意义。
由于桦褐孔菌三萜类化合物提取效率低、产量较低和纯度不高等因素影响,导致桦褐孔菌三萜的药用价值开发利用严重不足。虽然通过液体发酵生产三萜类化合物可以大大缩短其生产周期,但其产量低是目前桦褐孔菌三萜研究与实际应用的限制性因素。有研究报道显示,通过改变培养基中碳源、氮源、无机盐、ph和发酵温度以及添加诱导剂对桦褐孔菌次级代谢产物的产量有较大影响。如果能够有效地提高三萜在液体深层发酵中的产量，那么，桦褐孔菌作为一种提取获得三萜的原料，就可以为人类造福，同时也降低了三萜类药物的获取成本，具有重要的战略意义。关于利用杜仲提高桦褐孔菌三萜类化合物产量的研究尚未见报道,众所周知,杜仲是我国特有的药用植物,资源丰富,杜仲皮是药用价值极高的中药，但杜仲翅果壳的药用价值不高，杜仲翅果壳提取天然橡胶的技术尚不成熟，导致杜仲翅果壳的利用率极低,从而造成了资源浪费的现象。因此本发明在基础培养基中添加杜仲翅果壳或杜仲皮，探索其对液体发酵桦褐孔菌三萜类化合物产生的促进作用。因而,本发明以杜仲翅果壳或杜仲皮粉末为发酵底物,不仅能提高桦褐孔菌三萜类化合物的产量，同时达到杜仲资源更好利用的目的。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种提高桦褐孔菌发酵生产三萜产量的方法，设备投资少，后处理简单，基本无污染，成本低，资源利用率高，能够明显提高桦褐孔菌液体深层发酵三萜的产量。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种提高桦褐孔菌发酵生产三萜产量的方法，以桦褐孔菌为发酵菌，通过在液体发酵基础培养基中添加三萜产量促进物形成发酵培养基，三萜产量促进物的添加量为10-60g/l，经液体深层发酵，从而提高三萜产量。
本发明在基础培养基中添加杜仲材料(杜仲翅果壳粉、杜仲皮粉)，探索其对液体发酵桦褐孔菌三萜类化合物产生的促进作用。经过研究发现，添加杜仲材料后能显著提高桦褐孔菌液体深层发酵三萜的产量。本发明以杜仲翅果壳或杜仲皮粉末为发酵底物,不仅能提高桦褐孔菌三萜类化合物的产量，同时达到杜仲资源更好利用的目的。
本发明主要可以获得白桦脂醇、木栓酸、桦褐孔菌醇、3β-hydroxy-lanosta-8,24-dien-21-al和羊毛甾醇等三萜类化合物。
作为优选，所述液体发酵基础培养基的组成为：玉米粉53g/l,蛋白胨3g/l,cocl20.02g/l,kh2po41g/l,mgso40.2g/l,znso40.01g/l,k2hpo40.5g/l,feso40.05g/l,cuso40.02g/l,mnso40.09g/l,ph自然。
作为优选，所述三萜产量促进物为杜仲翅果壳粉、杜仲皮粉或两者的混合物。杜仲翅果壳粉为杜仲翅果的壳的粉碎物，杜仲皮粉为杜仲皮的粉碎物。
作为优选，液体深层发酵的发酵条件为：发酵温度27-28℃,搅拌转速100-150转/分钟,起始ph和发酵过程ph均为自然,发酵周期为2-12天。
采用本发明提高桦褐孔菌发酵生产三萜产量的方法生产获得的三萜作为抗卵巢癌、肺癌和间质瘤药物原料的用途。本发明生产的三萜类化合物对肺癌细胞(a549和pc-9)和卵巢癌细胞(es-2和skov-3)表现出强烈的抑制作用,且能有效抑制间质瘤细胞(ms924)的增殖。
本发明的有益效果是：
1、液体深层发酵具有设备投资少，后处理简单，发酵效率高，基本无污染，成本低等优点。
2、通过液体发酵技术生产桦褐孔菌三萜具有生产周期短,三萜含量相对稳定的特点。
3、发酵原料杜仲翅果壳、杜仲皮为天然产物,来源丰富,价格廉价,故而本发明所生产制备出来的三萜类化合物成本低。
4、杜仲翅果壳利用率低,在工业上的应用价值不高,造成了资源浪费现象,因此,本发明以此为发酵原料,有利于拓展杜仲翅果壳的加工利用途径并提高了其附加价值。
附图说明
图1杜仲翅果壳对液体深层发酵桦褐孔菌生物量动态变化的影响。
图2杜仲翅果壳对液体深层发酵桦褐孔菌总三萜产量动态变化的影响。
图3杜仲皮对液体深层发酵桦褐孔菌生物量动态变化的影响。
图4杜仲皮对液体深层发酵桦褐孔菌总三萜产量动态变化的影响。
图5桦褐孔菌三萜类化合物对肺癌细胞(a549和pc-9)增殖的抑制作用。
图6桦褐孔菌三萜类化合物对卵巢癌细胞(skov-3和es-2)增殖的抑制作用。
图7桦褐孔菌三萜类化合物对间质瘤细胞(ms924)增殖的抑制作用。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
由于桦褐孔菌三萜类化合物提取效率低、产量较低和纯度不高等因素影响,导致桦褐孔菌三萜的药用价值开发利用严重不足。利用杜仲降解转化对提高桦褐孔菌三萜类化合物产量的研究尚未见报道,本发明在液体发酵桦褐孔菌基础培养基中添加杜仲翅果壳粉末或杜仲皮粉末,探索其对三萜类化合物产生的促进作用。
实施例1：
液体发酵培养基：玉米粉53g/l,蛋白胨3g/l,cocl20.02g/l,kh2po41g/l,mgso40.2g/l,znso40.01g/l,k2hpo40.5g/l,feso40.05g/l,cuso40.02g/l,mnso40.09g/l,杜仲皮粉40g/l，ph自然。
桦褐孔菌10％的接种量，于28℃、136转/分钟恒温摇床培养。
杜仲皮对桦褐孔菌菌丝体生物量的动态变化：每隔24h取样测定桦褐孔菌菌丝体总量。添加杜仲皮培养基中，桦褐孔菌菌丝体生物量在第八天达到最大值为7.1g/l，对最大生物量的影响不显著(图1)。
杜仲皮对桦褐孔菌三萜类化合物产生的动态变化：每隔24h取样测定桦褐孔菌菌丝体总三萜含量。添加杜仲皮培养基中，桦褐孔菌总三萜产量在在第四天达到最大值为0.96g/l，比对照组(液体发酵基础培养基)提高了80.2％。(图2)。
三萜的提取分离：发酵结束后，将干燥得到的菌丝体用粉碎机磨成粉末状，并过60目筛子。称量1g粉末，向其加入20ml异丙醇，置于超声破碎仪中破壁4min(间歇时间为3s)，向其加入60ml异丙醇，置于50℃水中提取1天。取出、离心，收集上清液，所有提取物4000r/min离心5min后，浓缩冷冻干燥保存。
实施例2：
液体发酵培养基：玉米粉53g/l,蛋白胨3g/l,cocl20.02g/l,kh2po41g/l,mgso40.2g/l,znso40.01g/l,k2hpo40.5g/l,feso40.05g/l,cuso40.02g/l,mnso40.09g/l,杜仲翅果壳粉40g/l，ph自然。
桦褐孔菌10％的接种量，于28℃、136转/分钟恒温摇床培养。
杜仲翅果壳对桦褐孔菌菌丝体生物量的动态变化：每隔24h取样测定桦褐孔菌菌丝体总量。添加杜仲翅果壳培养基中，桦褐孔菌菌丝体生物量在第四天达到最大值为14.5g/l，比对照组(液体发酵基础培养基)提高了101.4％(图3)。
杜仲翅果壳对桦褐孔菌三萜类化合物产生的动态变化：每隔24h取样测定桦褐孔菌菌丝体总三萜含量。添加杜仲翅果壳培养基中，桦褐孔菌总三萜产量在第七天达到最大值约为1g/l，比对照组(液体发酵基础培养基)提高了87.6％(图4)。
三萜的提取分离：发酵结束后，将干燥得到的菌丝体用粉碎机磨成粉末状，并过60目筛子。称量1g粉末，向其加入20ml异丙醇，置于超声破碎仪中破壁4min(间歇时间为3s)，向其加入60ml异丙醇，置于50℃水中提取1天。取出、离心，收集上清液，所有提取物4000r/min离心5min后，浓缩冷冻干燥保存。
此外，液体发酵培养基：玉米粉53g/l,蛋白胨3g/l,cocl20.02g/l,kh2po41g/l,mgso40.2g/l,znso40.01g/l,k2hpo40.5g/l,feso40.05g/l,cuso40.02g/l,mnso40.09g/l,杜仲皮粉或杜仲翅果壳粉或杜仲皮粉与杜仲翅果壳粉的混合物10-60g/l，ph自然。发酵温度27-28℃,搅拌转速100-150转/分钟,发酵周期为2-12天。以上范围均是可以实施的。
本发明生产的三萜的抗癌活性：以每孔5000个的密度将处于对数生长期的癌细胞铺于96孔板中培养过夜。液体发酵桦褐孔菌三萜提取物(2、4、8、16、32、64μg/ml)分别处理肺癌细胞(a549,pc-9)、卵巢癌细胞(es2，skov-3)、间质瘤细胞(ms924)至3天,达预设时相后，加入用pbs稀释的终浓度为0.5mg/ml的mtt工作液孵育4h，每孔加入150μl二甲基亚砜(dmso),置摇床上低速振荡10min，在酶标仪490nm波长处读取吸光度od(490)值,计算其ic50。桦褐孔菌三萜类化合物对肺癌细胞(a549和pc-9)(图5)和卵巢癌细胞(skov-3和es-2)(图6)均表现出强烈的抑制活性，对间质瘤细胞(ms924)产生较好的抗癌效果(图7)。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。