本发明属于熊果苷的提取方法技术领域，具体涉及一种梨树叶中熊果苷的提取与分离方法。
背景技术：
梨树叶是蔷薇科梨属植物梨树的叶子，民间用于治疗蛇咬伤、尿道炎、膀胱炎、尿道结石以及气管炎引起的咳、喘等。我国梨树种植面积很大，梨树叶作为水果梨生产中的副产物，每年有大量的梨树叶被燃烧或被废弃，如果能将梨树叶中的有效成分提取出来，实现其高附加值的利用，将变废为宝，为果农创造更多的收益。梨树叶中含有熊果苷，它是一种具有抗炎、抑菌、镇咳、祛痰、平喘作用的物质。熊果苷能够通过抑制体内酪氨酸酶的活性，阻止黑色素的生成，从而减少皮肤色素沉积，祛除色斑和雀斑，因此，熊果苷是目前国内外美白化妆品中的主要活性物质。
现有技术中，关于梨树叶中熊果苷的提取已有文献报道，主要采用传统的有机溶剂提取方法，如用乙醇多次回流提取熊果苷，该方法提取时间长，乙醇回收困难。此外，熊果苷的分离多采用两步或多步大孔树脂吸附或柱层析的方法，分离的效率低下，往往难以满足要求。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提高一种梨树叶中熊果苷的提取与分离方法，提高梨树叶的附加值，实现熊果苷的高效提取与分离。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
一种梨树叶中熊果苷的提取与分离方法，包括以下步骤：
(1)收集梨树叶，风干后破碎至粉末状；
(2)将粉末状的梨树叶与乙醇水溶液a按重量比1：(5～30)混合后加入到亚临界提取装置中，通入氮气排出氧气，然后加热至110～180℃，控制压力为0.5～5.0mpa，提取5～40min，接着迅速冷却，取出料液，离心后收集上清液，将上清液蒸发浓缩得到浓缩液；
(3)将步骤(2)中的浓缩液泵入装有金属有机骨架材料zif-8填料的层析柱中，采用2～6倍柱体积的乙醇水溶液b进行洗脱，将收集到的洗脱液蒸发浓缩、喷雾干燥得到熊果苷；
所述乙醇水溶液a中乙醇的体积分数为3～8％；所述乙醇水溶液b中乙醇的体积分数为60～90％。
作为优选的，步骤(2)中，粉末状梨树叶与乙醇水溶液a的质量比为1：15。
作为优选的，步骤(2)中，控制梨树叶在亚临界提取装置中的提取温度为140℃、压力为1.5mpa，提取时间为10min。
作为优选的，所述乙醇水溶液a中乙醇的体积分数为5％；所述乙醇水溶液b中乙醇的体积分数为75％。
作为优选的，步骤(3)中，所述乙醇水溶液b的用量为3倍柱体积。
本发明中，所述金属有机骨架材料zif-8填料的制备方法为：将5g2-甲基咪唑溶于40ml甲醇中配制成2-甲基咪唑溶液，2gzn(no3)2·6h2o溶于40ml甲醇和20ml水的混合液中配制成zn(no3)2·6h2o溶液；将上述2-甲基咪唑溶液加入所述的zn(no3)2·6h2o溶液中，在20～60℃的温度下搅拌反应24h以上，得到白色zif-8分散液，经高速离心收集得到纳米级zif-8粒子，然后用甲醇溶液洗涤3次，再在真空度为0.45mpa，温度为45℃的真空条件下烘干得到固体粉末状zif-8。
与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：
1、本发明中，以含有少量乙醇的水溶液作为溶剂，采用亚临界提取技术实现梨树叶中熊果苷的高效提取；该提取工艺耗用的有机溶剂少，不易造成环境污染，且提取得率高，提取时间短；
2、本发明中，采用金属有机骨架材料zif-8进行熊果苷的吸附分离，分离的步骤少，操作简单，得到的熊果苷的纯度高。
附图说明
图1为温度对熊果苷提取率的影响；
图2为提取时间对熊果苷提取率的影响；
图3为液固比对熊果苷提取率的影响；
图4为提取压力对熊果苷提取率的影响。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。
为了提高梨树叶的附加值，避免梨树叶被燃烧或被废弃造成的环境污染，本发明提供了一种梨树叶中熊果苷的提取与分离方法，规避了现有技术中提取熊果苷时需要用到大量有机溶剂的弊端，减轻了环境的污染，节约了资源的消耗。
所述的提取与分离方法包括以下步骤：
(1)收集梨树叶，风干后破碎至粉末状；
(2)将粉末状的梨树叶与乙醇水溶液a按重量比1：(5～30)混合后加入到亚临界提取装置中，通入氮气排出氧气，然后加热至110～180℃，控制压力为0.5～5.0mpa，提取5～40min，接着采用冷却水迅速冷却至室温，取出料液，离心后收集上清液，将上清液蒸发浓缩得到浓缩液；
(3)将步骤(2)中的浓缩液泵入装有金属有机骨架材料zif-8填料的层析柱中，采用2～6倍柱体积的乙醇水溶液b进行洗脱，将收集到的洗脱液蒸发浓缩、喷雾干燥得到熊果苷；
所述乙醇水溶液a中乙醇的体积分数为3～8％；所述乙醇水溶液b中乙醇的体积分数为60～90％。
本发明所述的梨树叶为梨树的叶子，在生产水果梨的过程中会得到大量的梨树叶，将其收集起来，剔除杂物，洗去异物，晾干即可；同时，为了确保提取的效率，将收集得到的梨树叶进行破碎处理，使其与用于提取熊果苷的有机溶剂进行充分的接触。
本发明中，采用含有少量乙醇的水作为梨树叶粉末的提取剂，在亚临界提取装置中，熊果苷能够快速的析出，并溶解于乙醇的水溶液中，将料液进行离心分离以便进一步滤除料液中的梨树叶碎渣，然后将得到的上清液进行蒸发浓缩，以便提高熊果苷的浓度。
本发明中，在分离阶段，采用装有金属有机骨架材料zif-8填料的层析柱中，所述的zif-8具有丰富的孔隙结构，能够对小分子的熊果苷进行吸附，从而确保熊果苷的有效分离。
进一步的，根据本发明，粉末状梨树叶与乙醇水溶液a的质量比应控制在合适的范围内，若粉末状梨树叶的比例过大，即在亚临界提取过程中固相过多，则难以实现充分的提取，而乙醇水溶液a的比例过大，则性价比较低，造成乙醇水溶液a的浪费以及后续分离的困难。本发明中，优选的，所述粉末状梨树叶与乙醇水溶液a的质量比为1：15。
本发明中，所述亚临界提取装置的工艺参数，即提取过程中的温度、压力及提取时间的设置可以在较宽的范围内选择，为了获得最佳的提取率，优选的，控制梨树叶在亚临界提取装置中的提取温度为140℃、压力为1.5mpa，提取时间为10min。
进一步的，根据本发明，所述乙醇水溶液a中的乙醇的体积分数可以在较宽的范围内选择，为了确保最佳的提取效率，所述乙醇水溶液a中乙醇的体积分数为5％。
进一步的，根据本发明，所述乙醇水溶液b中的乙醇的体积分数可以在较宽的范围内选择，为了确保最佳的洗脱效率，所述乙醇水溶液b中乙醇的体积分数为75％。
进一步的，所述乙醇水溶液b的用量为3倍柱体积。
本发明中所述的柱体积是指zif-8填料装入层析柱后，从柱的底板到zif-8填料沉积表面的体积。
本发明中，为了降低柱压力，所述的zif-8装入层析柱中的高度不宜过高，所述高度优选为3～5cm。
本发明所述的步骤(3)中，所述的喷雾干燥具体采用压力喷雾干燥法，压力控制为100～250kg/cm2，进风温度控制在130～180℃，出风温度控制在60～80℃。
本发明中所述蒸发浓缩的目的在于减少待处理液的体积，提高处理的效率，所述蒸发浓缩采用的均为本领域技术常规的技术手段，本发明在此不做赘述。
以下通过具体的实施例对本发明提供的梨树叶中熊果苷的提取与分离方法的优点做进一步的说明。
本发明中的熊果苷，采用高效液相色谱、质谱、红外光谱和核磁共振h谱和c谱进行确证。
实施例1
一种梨树叶中熊果苷的提取与分离方法：
(1)收集梨树叶，风干后破碎至粉末状；
(2)称取10g梨树叶粉，加入到150g体积分数为5％的乙醇水溶液a中，然后加入亚临界提取装置中，通入氮气排出氧气，加热，在140℃、1.5mpa下，提取10min后，接着采用冷却水迅速冷却至室温，取出料液，离心收集上清液、蒸发浓缩得到浓缩液；
(3)将步骤(2)中的浓缩液泵入装有金属有机骨架材料zif-8填料的层析柱中，然后采用3倍柱体积的体积分数为75％的乙醇水溶液b洗脱，收集洗脱液，进行蒸发浓缩、喷雾干燥，得到分离后的熊果苷。
计算熊果苷的提取率，所述提取率为提取所得熊果苷占原料中熊果苷总量的比例；测试分离得到的熊果苷的纯度，并将上述测试结果记录到表1中。
原料中熊果苷总量的测定方法为，采用同批次的梨树叶作为原料，以甲醇为溶剂，回流提取3h，对梨树叶重复提取3次，合并提取液，测定其中熊果苷的含量，以此计算出原料中熊果苷的总量。
实施例2
一种梨树叶中熊果苷的提取与分离方法：
(1)收集梨树叶，风干后破碎至粉末状；
(2)称取15g梨树叶粉，加入到450g体积分数为8％的乙醇水溶液a中，然后加入亚临界提取装置中，通入氮气排出氧气，加热，在180℃、5mpa下，提取40min后，接着采用冷却水迅速冷却至室温，取出料液，离心收集上清液、蒸发浓缩得到浓缩液；
(3)将步骤(2)中的浓缩液泵入装有金属有机骨架材料zif-8填料的层析柱中，然后采用6倍柱体积的体积分数为90％的乙醇水溶液b洗脱，收集洗脱液，进行蒸发浓缩、喷雾干燥，得到分离后的熊果苷。
计算熊果苷的提取率及分离后得到的熊果苷的纯度，并将测试结果记录到表1中。
实施例3
一种梨树叶中熊果苷的提取与分离方法：
(1)收集梨树叶，风干后破碎至粉末状；
(2)称取20g梨树叶粉，加入到100g体积分数为3％的乙醇水溶液a中，然后加入亚临界提取装置中，通入氮气排出氧气，加热，在110℃、0.5mpa下，提取5min后，接着采用冷却水迅速冷却至室温，取出料液，离心收集上清液、蒸发浓缩得到浓缩液；
(3)将步骤(2)中的浓缩液泵入装有金属有机骨架材料zif-8填料的层析柱中，然后采用5倍柱体积的体积分数为60％的乙醇水溶液b洗脱，收集洗脱液，进行蒸发浓缩、喷雾干燥，得到分离后的熊果苷。
计算熊果苷的提取率及分离后得到的熊果苷的纯度，并将测试结果记录到表1中。
实施例4
一种梨树叶中熊果苷的提取与分离方法：
(1)收集梨树叶，风干后破碎至粉末状；
(2)称取40g梨树叶粉，加入到800g体积分数为7％的乙醇水溶液a中，然后加入亚临界提取装置中，通入氮气排出氧气，加热，在130℃、1.5mpa下，提取20min后，接着采用冷却水迅速冷却至室温，取出料液，离心收集上清液、蒸发浓缩得到浓缩液；
(3)将步骤(2)中的浓缩液泵入装有金属有机骨架材料zif-8填料的层析柱中，然后采用4倍柱体积的体积分数为70％的乙醇水溶液b洗脱，收集洗脱液，进行蒸发浓缩、喷雾干燥，得到分离后的熊果苷。
计算熊果苷的提取率及分离后得到的熊果苷的纯度，并将测试结果记录到表1中。
实施例5
一种梨树叶中熊果苷的提取与分离方法：
(1)收集梨树叶，风干后破碎至粉末状；
(2)称取25g梨树叶粉，加入到625g体积分数为4％的乙醇水溶液a中，然后加入亚临界提取装置中，通入氮气排出氧气，加热，在150℃、1.2mpa下，提取25min后，接着采用冷却水迅速冷却至室温，取出料液，离心收集上清液、蒸发浓缩得到浓缩液；
(3)将步骤(2)中的浓缩液泵入装有金属有机骨架材料zif-8填料的层析柱中，然后采用3.5倍柱体积的体积分数为80％的乙醇水溶液b洗脱，收集洗脱液，进行蒸发浓缩、喷雾干燥，得到分离后的熊果苷。
计算熊果苷的提取率及分离后得到的熊果苷的纯度，并将测试结果记录到表1中。
实施例6
一种梨树叶中熊果苷的提取与分离方法：
(1)收集梨树叶，风干后破碎至粉末状；
(2)称取50g梨树叶粉，加入到500g体积分数为5％的乙醇水溶液a中，然后加入亚临界提取装置中，通入氮气排出氧气，加热，在160℃、3.5mpa下，提取12min后，接着采用冷却水迅速冷却至室温，取出料液，离心收集上清液、蒸发浓缩得到浓缩液；
(3)将步骤(2)中的浓缩液泵入装有金属有机骨架材料zif-8填料的层析柱中，然后采用2.5倍柱体积的体积分数为85％的乙醇水溶液b洗脱，收集洗脱液，进行蒸发浓缩、喷雾干燥，得到分离后的熊果苷。
计算熊果苷的提取率及分离后得到的熊果苷的纯度，并将测试结果记录到表1中。
表1：
本发明提供的梨树叶中熊果苷的提取与分离方法，以5％乙醇水溶液为提取溶剂，在液固比为15:1，温度140℃、压力1.5mpa、提取时间10min的提取条件下得到的熊果苷的提取率最高，获得的熊果苷的纯度最高。
为进一步研究本发明提供的梨树叶中熊果苷的提取与分离方法，本发明通过实验对梨树叶中熊果苷的提取条件，包括提取时间、提取温度、提取压力以及液固比的优化，得到优化的提取条件，获得较佳的产率。
研究提取温度对梨树叶中熊果苷提取率的影响时，固定提取压力、时间和液固比，变化温度，进行提取实验，得到较佳提取温度；然后，在较佳提取温度下，固定提取压力和液固比，变化时间，进行提取实验，得到较佳的提取时间；在所得较佳提取温度、时间下，固定压力，变化液固比，进行提取实验，得到较佳的液固比；最后在获得的较佳温度、时间、液固比条件下，变化压力，进行提取实验，得到较佳提取压力，这样即可得到较佳提取条件。具体的实验结果如图1-4所示。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的特点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明的范围内。本发明要求保护的范围由所附的权利要求书及其等效物界定。