本发明属于医药化工技术领域，具体涉及一种3-o-氨基甲酰甘露糖供体衍生物、博来霉素二糖及其前体的制备方法。
背景技术
博来霉素(bleomycins，blm)为临床上一线治疗肿瘤的糖肽类抗肿瘤抗生素药物，主要用来治疗鳞癌、霍奇金氏恶性淋巴瘤、宫颈癌和睾丸癌等，来源于一种轮枝链霉菌(streptomycesverticillus)。blm结构由三部分组成：1)5个氨基酸组成嘧啶-咪唑结构；2)1个含有二噻唑氨基的侧链；3)1个特有二糖结构。大量研究表明，嘧啶-咪唑结构是blm抗肿瘤作用关键部位，能选择性氧化裂解dna中的5’-gc-3’和5’-gt-3’序列,进而发挥抗肿瘤活性；二噻唑平面结构可插入到dna碱基对之间，形成夹层络合物，是结合dna的必须片段；二糖部分不直接参与blm与dna直接作用，对blm的抗肿瘤作用机制尚不确切，shen等开发了含有6-去氧-l-古洛糖-α-1,2-[3-o-氨甲酰基-d-甘露糖]片段的博来霉素二糖类似物，其裂解dna的活性能力明显增强，表明blm二糖结构细微变化对博来霉素与dna的直接作用产生潜在影响(具有明显提高dna裂解活性的博来霉素设计，美国化学协会杂志，2012，134，13501-13509)。最近发现，blm二糖能选择性区分肿瘤细胞与正常细胞，增加blm的细胞渗透性，提高肿瘤细胞对blm的摄取，具有明显的肿瘤靶向性(博来霉素二糖促进肿瘤细胞摄取，美国化学协会杂志，2014，136，13641-13656)，这可能是临床上blm化疗时，不产生骨髓抑制作用，不引起白细胞减少，不抑制机体免疫功能的重要原因之一。
blm二糖是一种结构独特稀有的天然二聚糖，由3-o-氨甲酰基-d-甘露糖和l-古洛糖组成，之间由α-1,2-糖苷键链接。hecht与其同事报道博来霉素二糖对某些肿瘤细胞具有较强的亲和力，具有作为肿瘤识别显影剂或者靶向给药的结构片段与载体的潜质(博来霉素二糖修的饰能改善靶向肿瘤特异性，生物化学，2014,53,6800-6810)，为了进一步理解blm二糖构效关系及具体生物学作用机制，开发特异性识别肿瘤的显影剂和基于blm二糖靶向抗肿瘤药或递送系统，用化学合成法制备blm二糖及其前体受到越来越多的关注。
blm二糖及其前体模块的合成分为三步，第一步合成2-位羟基裸露l-古洛糖衍生物作为受体，第二步合成3-o-氨甲酰甘露糖衍生物作为供体，最后立体选择性地构建具有α型糖苷的blm二糖前体，按需求安装到目标分子上，或脱去保护基团制备blm二糖。尽管最近吕伟课题组报道山梨醇头尾翻转能克级制备blm，但路线中乙醛保护的山梨醇选择性差，最理想的产率仅为17％，且纯化困难，影响其更大规模的制备(二种抗生素抗肿瘤博来霉素二糖合成，四面体，2017,73,6172-6180)。
综上所述，在过去三十多年已有多个研究组报道博来霉素二糖合成方法改进，但进展缓慢，其合成规模几乎均处于毫克级水平，而且这些方法路线长，产率偏低、反应可操作性与重复性差，不宜工业化等不足。
技术实现要素：
基于此，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供3-o-氨基甲酰甘露糖供体衍生物的制备方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种3-o-氨基甲酰甘露糖供体衍生物的制备方法，包括以下步骤：
(1)将甘露糖甲醇溶液在酸催化下成醚得到甲基-α-甘露糖(m-2)；
(2)在二丁基氧化锡与弱碱的作用下，甲基-α-甘露糖(m-2)与溴苄在乙腈与dmf的混合溶剂中，专一选择性地反应得到甲基-3-o-苄基-α-d-吡喃甘露糖苷(m-3)；
(3)将甲基-3-o-苄基-α-d-吡喃甘露糖苷(m-3)与醋酸酐在浓硫酸乙酸酐溶液催化下乙酰化所有剩余羟基得到1,2,4,6-四-o-乙酰基-3-o-苄基α-d-吡喃甘露糖苷(m-4)；
(4)在氢气环境下，将1,2,4,6-四-o-乙酰基-3-o-苄基α-d-吡喃甘露糖苷(m-4)溶入乙酸乙酯中，用pd催化剂定量脱苄基得到1,2,4,6-o-四-乙酰基-3-羟基-α-d-吡喃甘露糖苷(m-5)；
(5)将1,2,4,6-o-四-乙酰基-3-羟基-α-d-吡喃甘露糖苷(m-5)与对硝基苯氧甲酰氯在弱碱和4-n,n-二甲基吡啶催化下酰化得到1,2,4,6-四-o-乙酰基-3-o-对硝基苯氧甲酰基-α-d-吡喃甘露糖苷(m-6)；
(6)将1,2,4,6-四-o-乙酰基-3-o-对硝基苯氧甲酰基-α-d-吡喃甘露糖苷(m-6)与氨气甲醇溶液反应，同时氨基取代3-位对硝基苯氧基和脱去1-位乙酰基得到2,4,6-三-o-乙酰基-3-o-氨基甲酰基-α-d-吡喃甘露糖苷(m-7)；
(7)将2,4,6-三-o-乙酰基-3-o-氨基甲酰基-α-d-吡喃甘露糖苷(m-7)与卤代磷酸酯在强碱作用下发生酯化取代，活化1-羟基，即得所述3-o-氨基甲酰甘露糖供体衍生物(m-8)。
优选地，所述步骤(1)中酸选自对甲苯磺酸、乙酰氯、浓硫酸或h型阳离子树脂。
优选地，所述h型阳离子树脂为amberliteir-120。
优选地，所述步骤(2)中乙腈与dmf的混合溶剂中乙腈与dmf的体积比为10:1～1:1；所述二丁基氧化锡与甲基-α-甘露糖(m-2)的摩尔比为(0.1～0.5)：1；所述反应温度为60～100℃。
优选地，所述步骤(3)中浓硫酸乙酸酐的体积百分比为1～10％。
优选地，所述步骤(4)中pd催化剂选自pd/c、pd(oh)2、pdo或鈀黑；所述pd催化剂与1,2,4.6-四-o-乙酰基甘露糖的质量比为10～50％。
优选地，所述步骤(6)中氨气甲醇溶液与1,2,4,6-四-o-乙酰基-3-o-对硝基苯氧甲酰基-α-d-吡喃甘露糖苷(m-6)的摩尔比为(4～8)：1；所述反应时间为3～6h，反应温度为-5～5℃。
优选地，所述步骤(7)中卤代磷酸酯选自氯代二苯基磷酸酯或溴代二乙基磷酸酯；所述强碱选自钠氢、正丁基锂或甲醇钠。
本发明所述3-o-氨基甲酰甘露糖供体衍生物(m-8)的化学名为二苯磷酸基-2,4,6-三-o-乙酰基-3-o-氨甲酰基-α-d-吡喃甘露糖苷，合成路线如下：
本发明还提供了一种博来霉素二糖前体的制备方法，包括以下步骤：
(1)根据所述制备方法制备得到所述3-o-氨基甲酰甘露糖供体衍生物；
(2)将步骤(1)获得的3-o-氨基甲酰甘露糖供体衍生物与2-羟基古洛糖受体衍生物在耦合试剂催化下立体选择性反应制备得到苄基-3-o-乙酰基-4,6-o-苄叉基-2-o-(2,4,6-三-o-乙酰基-3-o-氨基甲酰基-α-d-吡喃甘露糖基)-β-l-吡喃古洛糖苷(d-1)；
(3)在浓硫酸醋酸酐溶液作用下，苄基-3-o-乙酰基-4,6-o-苄叉基-2-o-(2,4,6-三-o-乙酰基-3-o-氨基甲酰基-α-d-吡喃甘露糖基)-β-l-吡喃古洛糖苷(d-1)先后经脱苄叉基、羟基全乙酰化得到苄基-3,4,6-三-o-乙酰基-2-o-(2,4,6-三-o-乙酰基-3-o-氨甲酰基-α-d-吡喃甘露糖基)-β-l-吡喃古洛糖苷(d-2)；
(4)在氢气环境中，将苄基-3,4,6-三-o-乙酰基-2-o-(2,4,6-三-o-乙酰基-3-o-氨甲酰基-α-d-吡喃甘露糖基)-β-l-吡喃古洛糖苷(d-2)用pd催化剂催化脱苄基，即得所述博来霉素二糖前体(d-3)。
优选地，所述步骤(2)中耦合试剂选自三氟甲磺酸三甲基硅酯或三氟甲磺酸盐；所述耦合试剂与3-o-氨基甲酰甘露糖供体衍生物的摩尔比为(1.0～2.5)：1；所述反应温度为-5～0℃。
优选地，所述步骤(3)中浓硫酸醋酸酐溶液的体积百分比为1～10％。
优选地，所述步骤(4)中pd催化剂选自pd/c、pd(oh)2、pdo或鈀黑；所述pd催化剂与苄基-3,4,6-三-o-乙酰基-2-o-(2,4,6-三-o-乙酰基-3-o-氨甲酰基-α-d-吡喃甘露糖基)-β-l-吡喃古洛糖苷(d-2)的质量比为10～60％。
优选地，所述步骤(2)中2-羟基古洛糖受体衍生物的制备方法，包括以下步骤：
(1)将半乳糖(g-1)与苯甲醇在酸催化下醚化得到苄基-β-d-半乳糖苷(g-2)；将苄基-β-d-半乳糖苷(g-2)与苯甲醛或苯甲醛二甲缩醛在高沸点溶剂中减压反应得到苄基-2,3-二羟基-4,6-o-苯甲叉基-β-d-吡喃半乳糖苷(g-3)；所述酸选自对甲苯磺酸、樟脑磺酸或h型阳离子树脂；所述高沸点溶剂选自n,n-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、二乙醇二甲醚或二乙醇单甲醚；所述反应温度为40～80℃；
(2)将苄基-2,3-二羟基-4,6-o-苯甲叉基-β-d-吡喃半乳糖苷(g-3)与三氟甲磺酸酐在吡啶催化下选择性酰化半乳糖3-羟基，随后加入乙酰氯酰化2-羟基得苄基-2-o-乙酰基-3-三氟甲磺酰基-4,6-o-苯甲叉基-β-d-吡喃半乳糖苷(g-4)；所述三氟甲磺酸酐与苄基-2,3-二羟基-4,6-o-苯甲叉基-β-d-吡喃半乳糖苷(g-3)的摩尔比为(0.9～1.5):1；所述乙酰氯与苄基-2,3-二羟基-4,6-o-苯甲叉基-β-d-吡喃半乳糖苷(g-3)的摩尔比为(1.2～2.5):1；
(3)将所述苄基-2-o-乙酰基-3-三氟甲磺酰基-4,6-o-苯甲叉基-β-d-吡喃半乳糖苷(g-4)与乙酰氧化四丁基铵发生3-位选择性取代构型翻转得到苄基-2,3-o-乙酰基-4,6-o-苯甲叉基-β-l-吡喃古洛糖糖苷(g-5)；所述苄基-2-o-乙酰基-3-三氟甲磺酰基-4,6-o-苯甲叉基-β-d-吡喃半乳糖苷(g-4)与乙酰氧化四丁基铵发生3-位选择性取代构型翻转的温度为25～50℃；所述乙酰氧化四丁基铵与苄基-2-o-乙酰基-3-三氟甲磺酰基-4,6-o-苯甲叉基-β-d-吡喃半乳糖苷(g-4)摩尔比为(1.5～2.5):1；
(4)将所述苄基-2,3-o-乙酰基-4,6-o-苯甲叉基-β-l-吡喃古洛糖糖苷(g-5)与甲醇钠室温下混合于无水甲醇中，定量快速地脱去乙酰基得到苄基-4,6-o-苯甲叉基-β-l-吡喃古洛糖糖苷(g-6)；
(5)将所述苄基-4,6-o-苯甲叉基-β-l-吡喃古洛糖糖苷(g-6)与醋酸酐在原乙酸三乙酯或二丁基氧化锡催化下专一选择性地乙酰化古洛糖3-羟基，即得所述2-羟基古洛糖受体衍生物(g-7)；所述原乙酸三乙酯与苄基-4,6-o-苯甲叉基-β-l-吡喃古洛糖糖苷(g-6)的摩尔比为(1.0～1.8)：1；二丁基氧化锡与苄基-4,6-o-苯甲叉基-β-l-吡喃古洛糖糖苷(g-6)的摩尔比为(0.1～1.0)：1。
所述2-羟基古洛糖受体衍生物的化学名为苄基-3-o-乙酰基-4,6-o-苯甲叉基-β-l-吡喃古洛糖糖苷。
本发明所述博来霉素二糖前体的化学名为3,4,6-三-o-乙酰基-2-o-(2,4,6-三-o-乙酰基-3-o-氨基甲酰基-α-d-吡喃甘露糖基)-β-l-吡喃古洛糖苷，合成路线如下：
本发明还提供了一种博来霉素二糖的制备方法，包括以下步骤：
(1)根据所述制备方法制备得到博来霉素二糖前体；
(2a)将所述博来霉素二糖前体用甲醇钠甲醇溶液脱去乙酰基，然后经h型阳离子树脂处理，即得所述博来霉素二糖；
或(2b)选择性活化所述博来霉素二糖前体还原端的羟基，用于目标修饰分子博来霉素二糖引入，即得所述博来霉素二糖。
优选地，所述步骤(2a)中甲醇钠与博来霉素二糖前体的摩尔比为(0.1～0.5)：1。
优选地，所述步骤(2b)中活化所述博来霉素二糖前体还原端羟基的反应试剂选自卤素、n-卤代丁二酰亚胺、三氯乙腈或卤代磷酸酯。
本发明所述博来霉素二糖1化学名为2-o-(3-o-氨基甲酰基-α-d-吡喃甘露糖基)-αβ-l-吡喃古洛糖苷；所述博来霉素二糖2化学名为二苯磷酸基-3,4,6-三-o-乙酰基-2-o-(2,4,6-三-o-乙酰基-3-o-氨基甲酰基-α-d-吡喃甘露糖基)-β-l-吡喃古洛糖苷，合成路线如所示：
相对于现有技术，本发明的有益效果为：(1)本发明3-o-氨基甲酰甘露糖供体衍生物的制备方法具有保护与去保护选择性高、路线短、产率高的优势；(2)本发明解决了博来霉素二糖及其前体产率偏低、反应可操作性与重复性差，不宜工业化等不足等难题；(3)本发明具有原料廉价易得、产率高、可操作性强、条件易控、可工业化放大和高效低成本等优点。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
本发明3-o-氨基甲酰甘露糖供体衍生物(m-8)制备方法的一种实施例，包括以下步骤：
(1)甲基α-d-吡喃甘露糖苷(m-2)的制备
所述m-2的结构式为：
在氮气保护下，将100克甘露糖(m-1)(257.7mmol)溶于干燥250ml甲醇中，加入1.0ml乙酰氯，回流6小时后，当甘露糖全部溶解后，减压蒸去甲醇得粗品，无水乙醇洗涤过滤得188.2克甲基α-d-吡喃甘露糖苷白色固体，产率为97％。
1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.39-7.27(m,5h),4.72(s,1h),4.68-4.65(d,j＝12.0hz,1h),4.59-4.56(dd,j＝12.0hz,1h),4.03(t,j＝9.6hz,1h),3.91(s,1h),3.81(d,j＝8.0hz,1h),3.72(d,j＝12.8hz,1h),3.66(d,j＝9.2hz,1h),3.53(d,j＝8.0hz,1h),3.30(s,3h)。
(2)甲基-3-o-苄基-α-d-吡喃甘露糖苷(m-3)的制备
所述m-3的结构式为：
在氮气保护下，将50克m-2(257.7mmol)和6.4克二丁基氧化锡(25.8mmol)溶于干燥250ml甲苯中，回流1小时后，减压蒸去甲苯得粗品，真空干燥2小时，加入330ml乙腈与dmf混合溶剂(乙腈/dmf＝10:1,v/v)将其溶解，然后先后加入53.3克无水碳酸钾(306.6mmol)和8.3克溴化四丁基铵，充分搅拌，61.2ml溴苄(515.5mmol)慢慢加入，升温至80℃，反应3小时，tlc监控反应进程，完毕，倾倒入1l乙酸乙酯和200ml蒸馏水中，有机层用400ml水洗涤2次和100ml饱和食盐水洗涤1次，无水硫酸钠干燥4小时，过滤，滤液减压浓缩，经柱层析得无色油状物57克(石油醚/乙酸乙酯＝2/3，v/v)，即为甲基-α-d-吡喃甘露糖苷(m-3)，产率78％。
1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ4.85(d,j＝4.2hz,1h),4.72(s,1h),4.76(dd,j＝8.0,8.0hz,2h),4.51(d,j＝3.2hz,1h),4.46(t,j＝7.2hz,1h),3.65(m,1h),3.47-3.31(m,2h),3.25(m,1h),3.22(s,3h),3.16(m,1h),3.05(m,1h)。
(3)1,2,4,6-四-o-乙酰基-3-o-苄基α-d-吡喃甘露糖苷(m-4)的制备
所述m-4的结构式为：
在氮气保护下，将7.1克m-3(25mmol)溶于25ml3％h2so4-ac2o中，室温搅拌3小时，tlc监控反应进程，完毕，倾倒入0.5l乙酸乙酯和100ml饱和碳酸氢钠中，有机层分别用300ml水洗涤2次、200ml洗涤1次和150ml饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥4小时，过滤并浓缩得无色油状物10.4克，即为1,2,4,6-四-o-乙酰基-3-o-苄基α-d-吡喃甘露糖苷(m-4)，产率94％。
rf＝0.28(pe:ea＝3:1)；1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.32-7.25(m,5h),6.10(d,j＝2.0hz,1h),5.36(dd,j＝2.4,2.0hz,1h),5.29(t,j＝10.0hz,1h),4.68(d,j＝12.4hz,1h),4.45(d,j＝12.4hz,1h),4.23(dd,j＝12.4,5.2hz,1h),4.09(dd,j＝12.3,2.4hz,1h),3.94(ddd,j＝10.2,5.2,2.4hz,1h),3.86(dd,j＝9.7,3.4hz,1h),2.17(s,3h),2.12(s,3h),2.08(s,3h),2.03(s,3h)；13cnmr(100mhz,cdcl3)δ170.77,170.02,169.55,168.09,137.41,128.45,127.97,127.78,91.06,74.12,71.54,70.80,67.05,20.91,20.87,20.81,20.76。
(4)1,2,4,6-o-四-乙酰基-3-羟基-α-d-吡喃甘露糖苷(m-5)的制备
所述m-5的结构式为
在氢气环境下，将10.0克m-4(22.8mmol)溶于70ml乙酸乙酯中，加入5gpd/c，室温搅拌过夜，tlc监控反应进程，完毕，用硅藻土过滤，浓缩得无色油状物7.8克，即为1,2,4,6-o-四-乙酰基-3-羟基-α-d-吡喃甘露糖苷(m-5)，产率99％。
rf＝0.18(pe:ea＝2:1)；1hnmr(400mhz,cdcl3)δ6.12(d,j＝2.0hz,1h),5.12(t,j＝5.2hz,1h),5.09(dd,j＝12.4,1.6hz,1h),4.30(ddd,j＝12.4,5.2,1.6hz,1h),4.14-4.07(m,2h),3.98(ddd,j＝10.0,4.8,2.4hz,1h),2.19(s,3h),2.13(d,j＝2.4hz,6h),2.08(s,3h)；13cnmr(100mhz,cdcl3)δ171.15,170.74,170.23,168.07,90.43,71.09,70.25,68.77,68.50,62.18,20.90,20.88,20.84,20.74.
(5)1,2,4,6-四-o-乙酰基-3-o-对硝基苯氧甲酰基-α-d-吡喃甘露糖苷(m-6)的制备
所述m-6的结构式为：
在氮气保护下，将8.0克m-5(23.0mmol)溶于60ml无水四氢呋喃中，分别加入12.7ml三乙胺(92mmol)、0.56克dmap(4.6mmol)、11.5克对硝基苯氯甲酸酯(57.5mmol),在40℃条件下搅拌反应4小时，完毕，用0.5l乙酸乙酯稀释和50ml1n盐酸中和，同时，用100ml饱和碳酸氢钠中和过量盐酸，有机层用300ml水洗涤2次和150ml饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥4小时，过滤并浓缩得黄色固体，柱层析纯化得白色固体10.8克(石油醚/乙酸乙酯＝4/1)，即为1,2,4,6-四-o-乙酰基-3-o-对硝基苯氧甲酰基-α-d-吡喃甘露糖苷(m-6)，产率92％。
rf＝0.30(pe:ea＝3:1)；1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.32-8.17(m,2h),7.47-7.34(m,2h),6.16(d,j＝2.0hz,1h),5.48(dd,j＝3.2,1.6hz,1h),5.44(t,j＝10.0hz,1h),5.21(dd,j＝10.0,3.6hz,1h),4.32(dd,j＝12.4,4.8hz,1h),4.15(dd,j＝12.4,2.4hz,1h),4.12-4.06(m,1h),2.22(s,3h),2.18(s,3h),2.13(s,3h),2.12(s,3h)；13cnmr(100mhz,cdcl3)δ170.66,170.03,169.45,167.92,155.23,151.75,145.71,125.38,121.93,90.69,74.27,70.67,67.57,65.06,61.95,20.83,20.79,20.76,20.74.
(6)2,4,6-三-o-乙酰基-3-o-氨基甲酰基-α-d-吡喃甘露糖苷(m-7)的制备
所述m-7的结构式为：
在氮气保护下，将7.5克m-6(14.6mmol)溶于80ml无水四氢呋喃中，滴加13ml7n氨气(气体)甲醇溶液(90.8mmol)，在0℃下反应6小时，tlc检测反应进程，直接减压浓缩得黄色油状物，硅胶柱层析纯化得4.3克白色固体(石油醚/乙酸乙酯＝1/2,1％三乙胺)，即为2,4,6-三-o-乙酰基-3-o-氨基甲酰基-α-d-吡喃甘露糖苷(m-7)，产率86％。
rf＝0.10(pe:ea＝1:2)；1hnmr(400mhz,cdcl3)δ5.36-5.22(m,4h),4.73(s,br2h),4.29-4.22(m,2h),4.18-4.07(m,2h),2.16(s,3h),2.10(s,3h),2.07(s,3h)；13cnmr(100mhz,cdcl3)δ170.87,170.26,170.14,155.50,92.15,70.53,69.80,68.49,66.27,62.58,20.98,20.80.
(7)二苯磷酸基-2,4,6-三-o-乙酰基-3-o-氨甲酰基-α-d-吡喃甘露糖苷(m-8)的制备
所述m-8的结构式为：
在氮气保护下，将8.4克m-7(24.06mmol)溶于180ml含有
rf＝0.36(pe:ea＝2:1)；1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.40-7.13(m,10h),5.89(d,j＝6.4hz,1h),5.39-5.24(m,3h),4.92(s,br2h),4.20(dd,j＝12.4,4.8hz,1h),4.12-3.86(m,1h),3.92(d,j＝12.4hz,1h),2.15(s,3h),2.05(s,3h),1.98(s,3h)；13cnmr(100mhz,cdcl3)δ170.55,169.77,169.50,155.12,150.28,150.21,150.09,150.02,130.03,129.97,125.87,125.77,120.21,120.11,120.06,96.01.
实施例2
本发明3-o-氨基甲酰甘露糖供体衍生物(m-8)制备方法的一种实施例，包括以下步骤：
(1)甲基α-d-吡喃甘露糖苷(m-2)的制备
在氮气保护下，将100克甘露糖(m-1)(257.7mmol)溶于干燥250ml甲醇中，加入1.0ml乙酰氯，回流6小时后，当甘露糖全部溶解后，减压蒸去甲醇得粗品，无水乙醇洗涤过滤得188.2克甲基α-d-吡喃甘露糖苷白色固体，产率为97％。
(2)甲基-3-o-苄基-α-d-吡喃甘露糖苷(m-3)的制备
在氮气保护下，将50克m-2(257.7mmol)和32克二丁基氧化锡(129mmol)溶于干燥250ml甲苯中，回流1小时后，减压蒸去甲苯得粗品，真空干燥2小时，加入330ml乙腈与dmf混合溶剂(乙腈/dmf＝1:1,v/v)将其溶解，然后先后加入53.3克无水碳酸钾(306.6mmol)和8.3克溴化四丁基铵，充分搅拌，61.2ml溴苄(515.5mmol)慢慢加入，升温至60℃，反应3小时，tlc监控反应进程，完毕，倾倒入1l乙酸乙酯和200ml蒸馏水中，有机层用600ml水洗涤2次和100ml饱和食盐水洗涤1次，无水硫酸钠干燥4小时，过滤，滤液减压浓缩，经柱层析得无色油状物60克(石油醚/乙酸乙酯＝2/3，v/v)，即为甲基-3-o-苄基-α-d-吡喃甘露糖苷(m-3)。
(3)1,2,4,6-四-o-乙酰基-3-o-苄基α-d-吡喃甘露糖苷(m-4)的制备
在氮气保护下，将7.1克m-3(25mmol)溶于25ml10％h2so4-ac2o中，室温搅拌3小时，tlc监控反应进程，完毕，倾倒入0.5l乙酸乙酯和200ml饱和碳酸氢钠中，有机层分别用300ml水洗涤2次、200ml洗涤1次和150ml饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥4小时，过滤并浓缩得无色油状物10.6克，即为1,2,4,6-四-o-乙酰基-3-o-苄基α-d-吡喃甘露糖苷(m-4)。
(4)1,2,4,6-o-四-乙酰基-3-羟基-α-d-吡喃甘露糖苷(m-5)的制备
在氢气环境下，将10.0克m-4(22.8mmol)溶于70ml乙酸乙酯中，加入3gpdo，室温搅拌过夜，tlc监控反应进程，完毕，用硅藻土过滤，浓缩得无色油状物7.7克，即为1,2,4,6-o-四-乙酰基-3-羟基-α-d-吡喃甘露糖苷(m-5)。
(5)1,2,4,6-四-o-乙酰基-3-o-对硝基苯氧甲酰基-α-d-吡喃甘露糖苷(m-6)的制备
在氮气保护下，将8.0克m-5(23.0mmol)溶于60ml无水四氢呋喃中，分别加入12.7ml三乙胺(92mmol)、0.56克dmap(4.6mmol)、11.5克对硝基苯氯甲酸酯(57.5mmol),在40℃条件下搅拌反应4小时，完毕，用0.5l乙酸乙酯稀释和50ml1n盐酸中和，同时，用100ml饱和碳酸氢钠中和过量盐酸，有机层用300ml水洗涤2次和150ml饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥4小时，过滤并浓缩得黄色固体，柱层析纯化得白色固体10.8克(石油醚/乙酸乙酯＝4/1)，即为1,2,4,6-四-o-乙酰基-3-o-对硝基苯氧甲酰基-α-d-吡喃甘露糖苷(m-6)。
(6)2,4,6-三-o-乙酰基-3-o-氨基甲酰基-α-d-吡喃甘露糖苷(m-7)的制备
在氮气保护下，将7.5克m-6(14.6mmol)溶于80ml无水四氢呋喃中，滴加17ml7n氨气(气体)甲醇溶液(116.8mmol)，在-5℃下反应5小时，tlc检测反应进程，直接减压浓缩得黄色油状物，硅胶柱层析纯化得4.2克白色固体(石油醚/乙酸乙酯＝1/2,1％三乙胺)，即为2,4,6-三-o-乙酰基-3-o-氨基甲酰基-α-d-吡喃甘露糖苷(m-7)。
(7)二苯磷酸基-2,4,6-三-o-乙酰基-3-o-氨甲酰基-α-d-吡喃甘露糖苷(m-8)的制备
在氮气保护下，将8.4克m-7(24.06mmol)溶于180ml含有
实施例3
本发明3-o-氨基甲酰甘露糖(m-8)制备方法的一种实施例，包括以下步骤：
(1)甲基α-d-吡喃甘露糖苷(m-2)的制备
在氮气保护下，将100克甘露糖(m-1)(257.7mmol)溶于干燥250ml甲醇中，加入1.0ml乙酰氯，回流6小时后，当甘露糖全部溶解后，减压蒸去甲醇得粗品，无水乙醇洗涤过滤得188.2克甲基α-d-吡喃甘露糖苷白色固体，产率为97％。
(2)甲基-3-o-苄基-α-d-吡喃甘露糖苷(m-3)的制备
在氮气保护下，将50克m-2(257.7mmol)和12.8克二丁基氧化锡(51.6mmol)溶于干燥250ml甲苯中，回流1小时后，减压蒸去甲苯得粗品，真空干燥2小时，加入330ml乙腈与dmf混合溶剂(乙腈/dmf＝5:1,v/v)将其溶解，然后先后加入53.3克无水碳酸钾(306.6mmol)和8.3克溴化四丁基铵，充分搅拌，61.2ml溴苄(515.5mmol)慢慢加入，升温至100℃，反应3小时，tlc监控反应进程，完毕，倾倒入1l乙酸乙酯和200ml蒸馏水中，有机层用500ml水洗涤2次和100ml饱和食盐水洗涤1次，无水硫酸钠干燥4小时，过滤，滤液减压浓缩，经柱层析得无色油状物58克(石油醚/乙酸乙酯＝2/3，v/v)，即为甲基-3-o-苄基-α-d-吡喃甘露糖苷(m-3)。
(3)1,2,4,6-四-o-乙酰基-3-o-苄基α-d-吡喃甘露糖苷(m-4)的制备
在氮气保护下，将7.1克m-3(25mmol)溶于25ml1％h2so4-ac2o中，室温搅拌3小时，tlc监控反应进程，完毕，倾倒入0.5l乙酸乙酯和100ml饱和碳酸氢钠中，有机层分别用300ml水洗涤2次、200ml洗涤1次和150ml饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥4小时，过滤并浓缩得无色油状物10.4克，即为1,2,4,6-四-o-乙酰基-3-o-苄基α-d-吡喃甘露糖苷(m-4)。
(4)1,2,4,6-o-四-乙酰基-3-羟基-α-d-吡喃甘露糖苷(m-5)的制备
在氢气环境下，将10.0克m-4(22.8mmol)溶于70ml乙酸乙酯中，加入1gpd(oh)2，室温搅拌过夜，tlc监控反应进程，完毕，用硅藻土过滤，浓缩得无色油状物7.8克，即为1,2,4,6-o-四-乙酰基-3-羟基-α-d-吡喃甘露糖苷(m-5)。
(5)1,2,4,6-四-o-乙酰基-3-o-对硝基苯氧甲酰基-α-d-吡喃甘露糖苷(m-6)的制备
在氮气保护下，将8.0克m-5(23.0mmol)溶于60ml无水四氢呋喃中，分别加入12.7ml三乙胺(92mmol)、0.56克dmap(4.6mmol)、11.5克对硝基苯氯甲酸酯(57.5mmol),在40℃条件下搅拌反应4小时，完毕，用0.5l乙酸乙酯稀释和50ml1n盐酸中和，同时，用100ml饱和碳酸氢钠中和过量盐酸，有机层用300ml水洗涤2次和150ml饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥4小时，过滤并浓缩得黄色固体，柱层析纯化得白色固体10.8克(石油醚/乙酸乙酯＝4/1)，即为1,2,4,6-四-o-乙酰基-3-o-对硝基苯氧甲酰基-α-d-吡喃甘露糖苷(m-6)。
(6)2,4,6-三-o-乙酰基-3-o-氨基甲酰基-α-d-吡喃甘露糖苷(m-7)的制备
在氮气保护下，将7.5克m-6(14.6mmol)溶于80ml无水四氢呋喃中，滴加8.5ml7n氨气(气体)甲醇溶液(58.4mmol)，5℃下反应3小时，tlc检测反应进程，直接减压浓缩得黄色油状物，硅胶柱层析纯化得4.5克白色固体(石油醚/乙酸乙酯＝1/2,1％三乙胺)，即为2,4,6-三-o-乙酰基-3-o-氨基甲酰基-α-d-吡喃甘露糖苷(m-7)。
(7)二苯磷酸基-2,4,6-三-o-乙酰基-3-o-氨甲酰基-α-d-吡喃甘露糖苷(m-8)的制备
在氮气保护下，将8.4克m-7(24.06mmol)溶于180ml含有
实施例4
本发明博来霉素二糖前体的制备方法的一种实施例，包括以下步骤：
(1)按实施例1所述方法制备得到3-o-氨基甲酰甘露糖供体衍生物(m-8)；
(2)2-羟基古洛糖受体衍生物(g-7)的制备
①苄基-β-d-吡喃半乳糖苷(g-2)的制备
所述g-2结构式为
在氮气保护下，将180gβ-d-吡喃半乳糖(1mol)溶入100ml苯甲醇中，同时加入1克对甲苯磺酸催化，150℃反应过夜，减压蒸出苯甲醇，用无水甲醇重结晶得235克苄基-β-d-吡喃半乳糖苷，产率为87.1％。
1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.50-7.20(m,5h),4.95(d,j＝12hz,1h),4.68(d,j＝12hz,1h),4.43(d,j＝8.0hz,1h),3.90-3.71(m,3h),3.68-3.40(m,3h).
②苄基-2,3-二羟基-4,6-o-苯甲叉基-β-d-吡喃半乳糖苷(g-3)的制备
所述g-3结构式为
在氮气保护下，将40.5gg-2(150mmol)和2.85g对甲苯磺酸(15mmol)的干燥n,n-二甲基甲酰胺dmf(250ml)溶液中，往其中滴加27.5ml苯甲醛二甲缩醛(180mmol)，反应混合物减压搅拌反应4h，反应温度为80℃；tlc监测反应进程，反应液倒入500ml二氯甲烷和150ml的饱和碳酸氢钠混合物中，搅拌分层，有机层用300ml水洗涤二次，再用饱和食盐水洗涤1次，减压浓缩得43.4克白色固体，即为苄基-2,3-二羟基-4,6-o-苯甲叉基-β-d-吡喃半乳糖苷(g-3)，产率81％。
rf＝0.30(dcm:meoh＝50:1)；1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.55-7.28(m,10h),5.56(s,1h),5.00(d,j＝11.6hz,1h),4.63(d,j＝11.6hz,1h),4.40-4.34(m,2h),4.20(t,j＝3.2hz,1h),4.10(d,j＝12.4hz,1h),3.82(t,j＝8.8hz,1h),3.69(dt,j＝12.8,6.8hz,1h),3.47(s,1h)；13cnmr(100mhz,cdcl3)δ137.49,137.07,129.28,128.53,128.28,128.23,128.03,126.42,101.65,101.48,75.33,72.69,71.83,70.92,69.18,66.78.
③苄基-2-o-乙酰基-3-三氟甲磺酰基-4,6-o-苯甲叉基-β-d-吡喃半乳糖苷(g-4)的制备
所述g-4结构式为
在氮气保护下，将46.0gg-3(129mmol)和20ml干燥吡啶溶于600ml二氯甲烷中，降温至-10℃，往其中滴加25ml三氟甲磺酸酐(147.7mmol),搅拌30分钟后，再滴加18ml乙酰氯，反应1小时后，tlc监测反应进程，完毕，倾倒入300ml乙酸乙酯和200ml水中，搅拌分层，有机层用400ml水洗涤2次和100ml饱和食盐水洗涤1次，无水硫酸钠干燥5小时，过滤，滤液减压浓缩得黄色油状物，经柱层析的65.1g白色固体(石油醚/乙酸乙酯＝4/1,v/v),即为苄基-2-o-乙酰基-3-三氟甲磺酰基-4,6-o-苯甲叉基-β-d-吡喃半乳糖苷(g-4)，产率95％。
rf＝0.34(pe:ea＝3:1)；1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.55-7.27(m,10h),5.60(s,1h),5.54(t,j＝8.8hz,1h),4.97-4.92(m,1h),4.89(dd,j＝10.0,3.6hz,1h),4.65(d,j＝12.4hz,1h),4.55(d,j＝7.8hz,1h),4.46(d,j＝3.6hz,1h),4.43(d,j＝12.4hz,1h),4.16-4.09(m,1h),3.51(s,1h),2.07(d,j＝1.6hz,3h).13cnmr(100mhz,cdcl3)δ168.80,136.75,129.25,128.49,128.27,128.03,127.81,126.14,101.00,99.16,83.73,74.10,70.32,68.59,67.68,65.76,20.49.
④苄基-2,3-o-乙酰基-4,6-o-苯甲叉基-β-l-吡喃古洛糖糖苷(g-5)的制备
所述g-5结构式为：
在氮气保护下，将8.8克g-4(16.5mmol)和10克乙酰氧化四丁基铵溶于200ml干燥dmf中，升温至50℃，反应6小时后，tlc监测g-4消耗进度，完毕，倾倒入300ml乙酸乙酯和200ml水中，充分搅拌分层，有机层用300ml水洗涤2次和100ml饱和食盐水洗涤1次，无水硫酸钠干燥5小时，过滤并浓缩得红色油状物，经柱层析的6.3g白色固体(石油醚/乙酸乙酯＝3/1,v/v),即为苄基-2,3-o-乙酰基-4,6-o-苯甲叉基-β-l-吡喃古洛糖糖苷(g-5)，产率86％。
rf＝0.40(pe:ea＝2:1)；1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.53-7.14(m,10h),5.51-5.39(m,2h),5.22-5.16(m,1h),4.92-4.84(m,2h),4.58(d,j＝12.4hz,1h),4.29(d,j＝12.4hz,1h),4.04-3.91(m,2h),3.68(s,1h),2.03(s,3h),1.93(s,3h)；13hnmr(100mhz,chloroform-d)δ169.33,137.48,137.28,129.13,128.29,128.19,127.60,127.47,126.27,101.21,97.44,83.73,74.29,70.11,69.43,69.01,68.00,66.02,20.80.
⑤苄基-4,6-o-苯甲叉基-β-l-吡喃古洛糖糖苷(g-6)的制备
所述g-6结构式为：
在氮气保护下，将9克g-5(20.04mmol)和110毫克甲醇钠溶于干燥的100ml甲醇中，室温反应1小时，tlc监测g-5消耗进度，完毕，加入1gdowex-50，共孵15分钟，过滤，滤液减压浓缩得白色固体7.23克，即为苄基-4,6-o-苯甲叉基-β-l-吡喃古洛糖糖苷(g-6)，产率99％。
rf＝0.34(pe:ea＝1:1)；1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.55-7.28(m,10h),5.55(t,j＝3.9hz,1h),5.01(dt,j＝11.8,3.6hz,1h),4.79(dd,j＝7.8,3.2hz,1h),4.59(dd,j＝11.8,3.2hz,1h),4.38(dd,j＝13.2,4.8hz,1h),4.18(d,j＝3.2hz,1h),4.14-4.04(m,2h),3.88(q,j＝7.8,3.6,3.2hz,1h),3.80(d,j＝6.8hz,1h)；13cnmr(100mhz,cdcl3)δ137.69,137.25,129.11,128.53,128.23,128.02,126.27,101.25,99.25,99.23,75.90,70.91,69.87,69.36,68.88,65.96.
⑥苄基-3-o-乙酰基-4,6-o-苯甲叉基-β-l-吡喃古洛糖糖苷(g-7)的制备
所述g-7结构式为：
在氮气保护下，将7.6克g-6(21.5mmol)溶于干燥的150mldmf中，往其中滴加5.8ml原乙酸三乙酯(31.8mmol)和0.5ml三氟乙酸，室温下反应1小时，tlc监测g-6消耗进度，完毕，加入20ml水继续反应20分钟，然后倾倒入200ml乙酸乙酯和100ml水中，充分搅拌分层，有机层用200ml水洗涤2次和100ml饱和食盐水洗涤1次，无水硫酸钠干燥4小时，过滤并浓缩得无色油状物，真空干燥6小时得8.64克白色固体，即为苄基-3-o-乙酰基-4,6-o-苯甲叉基-β-l-吡喃古洛糖糖苷(g-7)，产率为96％。
rf＝0.25(pe:ea＝2:1)；1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.55-7.28(m,10h),5.55(s,1h),5.42(d,j＝3.6hz,1h),5.03(d,j＝11.6hz,1h),4.84(d,j＝8.0hz,1h),4.63(d,j＝11.6hz,1h),4.38(d,j＝12.6hz,1h),4.15-4.01(m,3h),3.72(s,1h),2.14(s,3h)；13cnmr(100mhz,cdcl3)δ169.92,137.41,137.22,129.15,128.49,128.23,128.13,127.96,126.23,101.19,99.68,74.22,70.97,70.88,69.17,67.44,66.09,20.96；tof-ms,m/z:[m+na+],calcdforc22h26o7,437.1414；found,423.1408.
(3)苄基-3-o-乙酰基-4,6-o-苄叉基-2-o-(2,4,6-三-o-乙酰基-3-o-氨基甲酰基-α-d-吡喃甘露糖基)-β-l-吡喃古洛糖苷(d-1)的制备
所述d-1的结构式为：
在氮气保护下，将4.24克m-8(7.28mmol)和3.5克g-7(8.7mmol)溶于80ml含有
rf＝0.36(pe:ea＝1:2)；hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.61-7.27(m,10h),5.53(s,1h),5.45(d,j＝3.7hz,1h),5.37(s,1h),5.27(s,1h),5.15(d,j＝10.0hz,1h),5.09-5.02(m,1h),4.97(d,j＝11.2hz,1h),4.87(d,j＝8.4hz,1h),4.69(s,br,2h),4.60(d,j＝11.6hz,1h),4.38(d,j＝12.4hz,1h),4.21(dd,j＝12.0,6.8hz,1h),4.16-3.97(m,5h),3.74(s,1h),2.19(s,3h),2.09(s,3h),2.07(s,3h),1.70(s,3h).tof-ms,m/z:[m+na+],c35h41no16,calcdfor754.2318；found,754.2305。
(4)苄基-3,4,6-三-o-乙酰基-2-o-(2,4,6-三-o-乙酰基-3-o-氨甲酰基-α-d-吡喃甘露糖基)-β-l-吡喃古洛糖苷(d-2)的制备
所述d-2的结构式为：
在氮气保护下，将3.7克d-1(5.0mmol)溶于50ml3％浓硫酸醋酐溶液中，室温搅拌3小时，tlc监控反应进程，完毕，倾倒入300ml乙酸乙酯和80ml饱和碳酸氢钠中，有机层用300ml水洗涤2次和100ml饱和食盐水洗涤1次，无水硫酸钠干燥4小时，滤液减压浓缩得粗品，硅胶柱层析纯化得3.48克白色固体(石油醚/乙酸乙酯＝1/1)，即为苄基-3,4,6-三-o-乙酰基-2-o-(2,4,6-三-o-乙酰基-3-o-氨甲酰基-α-d-吡喃甘露糖基)-β-l-吡喃古洛糖苷(d-2)，产率96％。
rf＝0.38(pe:ea＝1:2)；1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.39-7.29(m,5h),5.39(d,j＝3.6hz,1h),5.35(s,1h),5.24(dd,j＝13.6,3.2hz,2h),5.04(dd,j＝8.6,5.2hz,1h),4.96(d,j＝3.6hz,1h),4.89(dd,j＝11.6,2.8hz,1h),4.82(dd,j＝8.0,2.8hz,1h),4.72(s,br,2h),4.62(dd,j＝11.4,2.8hz,1h),4.32-4.25(m,1h),4.18(d,j＝2.8hz,3h),4.04(d,j＝13.2hz,1h),3.92(dd,j＝8.0,3.6hz,1h),2.20(s,3h),2.15(s,3h),2.11(s,3h),2.08(d,j＝3.0hz,9h)；tof-ms,m/z:[m+na+],c32h41no18calcdfor750.2216；found,750.2200。
(5)3,4,6-三-o-乙酰基-2-o-(2,4,6-三-o-乙酰基-3-o-氨基甲酰基-α-d-吡喃甘露糖基)-β-l-吡喃古洛糖苷(d-3)的制备
所述d-3的结构式为：
在氢气环境下，将2.4克d-2(3.3mmol)溶于50ml乙酸乙酯中，加入480mg10％pd/c,室温搅拌过夜，tlc监控反应进程，完毕，硅藻土过滤，滤液减压浓缩得粗品，硅胶柱层析快速纯化得2.0克白色固体(石油醚/乙酸乙酯＝2/3)，即为3,4,6-三-o-乙酰基-2-o-(2,4,6-三-o-乙酰基-3-o-氨基甲酰基-α-d-吡喃甘露糖基)-β-l-吡喃古洛糖苷(d-3)，产率96％。
rf＝0.15(pe:ea＝1:3)；1hnmr(400mhz,cdcl3)δ5.40(t,j＝3.6hz,1h),5.34(s,1h),5.27(t,j＝7.8hz,2h),5.11-5.01(m,2h),4.96(d,j＝3.6hz,1h),4.77(s,br2h),4.33-4.25(m,1h),4.25-4.04(m,5h),3.82(dd,j＝8.0,4.0hz,1h),2.21(s,3h),2.15(s,6h),2.09(s,6h),2.08(s,3h).tof-ms,m/z:[m+na+],calcdforc25h35no18660.1746,found:660.1726。
实施例5
本发明博来霉素二糖前体的制备方法的一种实施例，包括以下步骤：
(1)按实施例1所述方法制备得到3-o-氨基甲酰甘露糖供体衍生物(m-8)；
(2)2-羟基古洛糖受体衍生物(g-7)的制备
①苄基-β-d-吡喃半乳糖苷(g-2)的制备
在氮气保护下，将180gβ-d-吡喃半乳糖(1mol)溶入100ml苯甲醇中，同时加入1克对甲苯磺酸催化，150℃反应过夜，减压蒸出苯甲醇，用无水甲醇重结晶得235克苄基-β-d-吡喃半乳糖苷，产率为87.1％。
②苄基-2,3-二羟基-4,6-o-苯甲叉基-β-d-吡喃半乳糖苷(g-3)的制备
在氮气保护下，将40.5g苄基-β-d-半乳糖苷(150mmol)和2.85g樟脑磺酸的干燥二甲基亚砜(dmso)(250ml)溶液中，往其中滴加27.5ml苯甲醛，反应混合物减压搅拌反应4h，反应温度为80℃；tlc监测反应进程，反应液倒入500ml二氯甲烷和150ml的饱和碳酸氢钠混合物中，搅拌分层，有机层用300ml水洗涤二次，再用饱和食盐水洗涤1次，减压浓缩得43.4克白色固体，即为苄基-2,3-二羟基-4,6-o-苯甲叉基-β-d-吡喃半乳糖苷(g-3)。
③苄基-2-o-乙酰基-3-三氟甲磺酰基-4,6-o-苯甲叉基-β-d-吡喃半乳糖苷(g-4)的制备
在氮气保护下，将46.0gg-3(129mmol)和20ml干燥吡啶溶于600ml二氯甲烷中，降温至-10℃，往其中滴加19.7ml三氟甲磺酸酐(116.1mmol),搅拌30分钟后，再滴加11ml乙酰氯，反应1小时后，tlc监测反应进程，完毕，倾倒入300ml乙酸乙酯和200ml水中，搅拌分层，有机层用400ml水洗涤2次和100ml饱和食盐水洗涤1次，无水硫酸钠干燥5小时，过滤，滤液减压浓缩得黄色油状物，经柱层析的64.8g白色固体(石油醚/乙酸乙酯＝4/1,v/v),即为苄基-2-o-乙酰基-3-三氟甲磺酰基-4,6-o-苯甲叉基-β-d-吡喃半乳糖苷(g-4)。
④苄基-2,3-o-乙酰基-4,6-o-苯甲叉基-β-l-吡喃古洛糖糖苷(g-5)的制备
在氮气保护下，将8.8克g-4(16.5mmol)和7克乙酰氧化四丁基铵溶于200ml干燥dmf中，升温至25℃，反应6小时后，tlc监测g-4消耗进度，完毕，倾倒入300ml乙酸乙酯和200ml水中，充分搅拌分层，有机层用300ml水洗涤2次和100ml饱和食盐水洗涤1次，无水硫酸钠干燥5小时，过滤并浓缩得红色油状物，经柱层析的6.0g白色固体(石油醚/乙酸乙酯＝3/1,v/v),即为苄基-2,3-o-乙酰基-4,6-o-苯甲叉基-β-l-吡喃古洛糖糖苷(g-5)。
⑤苄基-4,6-o-苯甲叉基-β-l-吡喃古洛糖糖苷(g-6)的制备
在氮气保护下，将9克g-5(20.04mmol)和110毫克甲醇钠溶于干燥的100ml甲醇中，室温反应1小时，tlc监测g-5消耗进度，完毕，加入1gdowex-50，共孵15分钟，过滤，滤液减压浓缩得白色固体7.23克，即为苄基-4,6-o-苯甲叉基-β-l-吡喃古洛糖糖苷(g-6)。
⑥苄基-3-o-乙酰基-4,6-o-苯甲叉基-β-l-吡喃古洛糖糖苷(g-7)的制备
在氮气保护下，将7.6克g-6(21.5mmol)溶于干燥的150mldmf中，往其中滴加3.9ml原乙酸三乙酯(21.5mmol)和0.5ml三氟乙酸，室温下反应1小时，tlc监测g-6消耗进度，完毕，加入20ml水继续反应20分钟，然后倾倒入200ml乙酸乙酯和100ml水中，充分搅拌分层，有机层用200ml水洗涤2次和100ml饱和食盐水洗涤1次，无水硫酸钠干燥4小时，过滤并浓缩得无色油状物，真空干燥6小时得8.40克白色固体，即为苄基-3-o-乙酰基-4,6-o-苯甲叉基-β-l-吡喃古洛糖糖苷(g-7)。
(3)苄基-3-o-乙酰基-4,6-o-苄叉基-2-o-(2,4,6-三-o-乙酰基-3-o-氨基甲酰基-α-d-吡喃甘露糖基)-β-l-吡喃古洛糖苷(d-1)的制备
在氮气保护下，将4.24克m-8(7.28mmol)和3.5克g-7(8.7mmol)溶于80ml含有
(4)苄基-3,4,6-三-o-乙酰基-2-o-(2,4,6-三-o-乙酰基-3-o-氨甲酰基-α-d-吡喃甘露糖基)-β-l-吡喃古洛糖苷(d-2)的制备
在氮气保护下，将3.7克d-1(5.0mmol)溶于50ml1％浓硫酸醋酐溶液中，室温搅拌3小时，tlc监控反应进程，完毕，倾倒入300ml乙酸乙酯和80ml饱和碳酸氢钠中，有机层用300ml水洗涤2次和100ml饱和食盐水洗涤1次，无水硫酸钠干燥4小时，滤液减压浓缩得粗品，硅胶柱层析纯化得3.48克白色固体(石油醚/乙酸乙酯＝1/1)，即为苄基-3,4,6-三-o-乙酰基-2-o-(2,4,6-三-o-乙酰基-3-o-氨甲酰基-α-d-吡喃甘露糖基)-β-l-吡喃古洛糖苷(d-2)。
(5)3,4,6-三-o-乙酰基-2-o-(2,4,6-三-o-乙酰基-3-o-氨基甲酰基-α-d-吡喃甘露糖基)-β-l-吡喃古洛糖苷(d-3)的制备
在氢气环境下，将2.4克d-2(3.3mmol)溶于50ml乙酸乙酯中，加入240mg10％pd/c,室温搅拌过夜，tlc监控反应进程，完毕，硅藻土过滤，滤液减压浓缩得粗品，硅胶柱层析快速纯化得1.9克白色固体(石油醚/乙酸乙酯＝2/3)，即为3,4,6-三-o-乙酰基-2-o-(2,4,6-三-o-乙酰基-3-o-氨基甲酰基-α-d-吡喃甘露糖基)-β-l-吡喃古洛糖苷(d-3)。
实施例6
本发明博来霉素二糖前体的制备方法的一种实施例，包括以下步骤：
(1)按实施例1所述方法制备得到3-o-氨基甲酰甘露糖供体衍生物(m-8)；
(2)2-羟基古洛糖受体衍生物(g-7)的制备
①苄基-β-d-吡喃半乳糖苷(g-2)的制备
在氮气保护下，将180gβ-d-吡喃半乳糖(1mol)溶入100ml苯甲醇中，同时加入1克对甲苯磺酸催化，150℃反应过夜，减压蒸出苯甲醇，用无水甲醇重结晶得235克苄基-β-d-吡喃半乳糖苷，产率为87.1％。
②苄基-2,3-二羟基-4,6-o-苯甲叉基-β-d-吡喃半乳糖苷(g-3)的制备
在氮气保护下，将40.5g苄基-β-d-半乳糖苷(150mmol)和2.85gdowex50wx8-200的干燥二乙醇二甲醚(250ml)溶液中，往其中滴加27.5ml苯甲醛二甲缩醛(180mmol)，反应混合物减压搅拌反应4h，反应温度为60℃；tlc监测反应进程，反应液倒入500ml二氯甲烷和150ml的饱和碳酸氢钠混合物中，搅拌分层，有机层用300ml水洗涤二次，再用饱和食盐水洗涤1次，减压浓缩得43.4克白色固体，即为苄基-2,3-二羟基-4,6-o-苯甲叉基-β-d-吡喃半乳糖苷(g-3)。
③苄基-2-o-乙酰基-3-三氟甲磺酰基-4,6-o-苯甲叉基-β-d-吡喃半乳糖苷(g-4)的制备
在氮气保护下，将46.0gg-3(129mmol)和20ml干燥吡啶溶于600ml二氯甲烷中，降温至-10℃，往其中滴加32.7ml三氟甲磺酸酐(193.5mmol),搅拌30分钟后，再滴加23ml乙酰氯，反应1小时后，tlc监测反应进程，完毕，倾倒入300ml乙酸乙酯和200ml水中，搅拌分层，有机层用400ml水洗涤2次和100ml饱和食盐水洗涤1次，无水硫酸钠干燥5小时，过滤，滤液减压浓缩得黄色油状物，经柱层析的67.3g白色固体(石油醚/乙酸乙酯＝4/1,v/v),即为苄基-2-o-乙酰基-3-三氟甲磺酰基-4,6-o-苯甲叉基-β-d-吡喃半乳糖苷(g-4)。
④苄基-2,3-o-乙酰基-4,6-o-苯甲叉基-β-l-吡喃古洛糖糖苷(g-5)的制备
在氮气保护下，将8.8克g-4(16.5mmol)和11.8克乙酰氧化四丁基铵溶于200ml干燥dmf中，升温至35℃，反应6小时后，tlc监测g-4消耗进度，完毕，倾倒入300ml乙酸乙酯和200ml水中，充分搅拌分层，有机层用300ml水洗涤2次和100ml饱和食盐水洗涤1次，无水硫酸钠干燥5小时，过滤并浓缩得红色油状物，经柱层析的6.2g白色固体(石油醚/乙酸乙酯＝3/1,v/v),即为苄基-2,3-o-乙酰基-4,6-o-苯甲叉基-β-l-吡喃古洛糖糖苷(g-5)。
⑤苄基-4,6-o-苯甲叉基-β-l-吡喃古洛糖糖苷(g-6)的制备
在氮气保护下，将9克g-5(20.04mmol)和110毫克甲醇钠溶于干燥的100ml甲醇中，室温反应1小时，tlc监测g-5消耗进度，完毕，加入1gdowex-50，共孵15分钟，过滤，滤液减压浓缩得白色固体7.23克，即为苄基-4,6-o-苯甲叉基-β-l-吡喃古洛糖糖苷(g-6)。
⑥苄基-3-o-乙酰基-4,6-o-苯甲叉基-β-l-吡喃古洛糖糖苷(g-7)的制备
在氮气保护下，将7.6克g-6(21.5mmol)溶于干燥的150mldmf中，往其中滴加7.1ml原乙酸三乙酯(38.7mmol)和0.5ml三氟乙酸，室温下反应1小时，tlc监测g-6消耗进度，完毕，加入20ml水继续反应20分钟，然后倾倒入200ml乙酸乙酯和100ml水中，充分搅拌分层，有机层用200ml水洗涤2次和100ml饱和食盐水洗涤1次，无水硫酸钠干燥4小时，过滤并浓缩得无色油状物，真空干燥6小时得8.64克白色固体，即为苄基-3-o-乙酰基-4,6-o-苯甲叉基-β-l-吡喃古洛糖糖苷(g-7)。
(3)苄基-3-o-乙酰基-4,6-o-苄叉基-2-o-(2,4,6-三-o-乙酰基-3-o-氨基甲酰基-α-d-吡喃甘露糖基)-β-l-吡喃古洛糖苷(d-1)的制备
在氮气保护下，将4.24克m-8(7.28mmol)和3.5克g-7(8.7mmol)溶于80ml含有
(4)苄基-3,4,6-三-o-乙酰基-2-o-(2,4,6-三-o-乙酰基-3-o-氨甲酰基-α-d-吡喃甘露糖基)-β-l-吡喃古洛糖苷(d-2)的制备
在氮气保护下，将3.7克d-1(5.0mmol)溶于50ml10％浓硫酸醋酐溶液中，室温搅拌3小时，tlc监控反应进程，完毕，倾倒入300ml乙酸乙酯和80ml饱和碳酸氢钠中，有机层用300ml水洗涤2次和100ml饱和食盐水洗涤1次，无水硫酸钠干燥4小时，滤液减压浓缩得粗品，硅胶柱层析纯化得3.48克白色固体(石油醚/乙酸乙酯＝1/1)，即为苄基-3,4,6-三-o-乙酰基-2-o-(2,4,6-三-o-乙酰基-3-o-氨甲酰基-α-d-吡喃甘露糖基)-β-l-吡喃古洛糖苷(d-2)。
(5)3,4,6-三-o-乙酰基-2-o-(2,4,6-三-o-乙酰基-3-o-氨基甲酰基-α-d-吡喃甘露糖基)-β-l-吡喃古洛糖苷(d-3)的制备
在氢气环境下，将2.4克d-2(3.3mmol)溶于50ml乙酸乙酯中，加入1.44克10％pd/c,室温搅拌过夜，tlc监控反应进程，完毕，硅藻土过滤，滤液减压浓缩得粗品，硅胶柱层析快速纯化得2.1克白色固体(石油醚/乙酸乙酯＝2/3)，即为3,4,6-三-o-乙酰基-2-o-(2,4,6-三-o-乙酰基-3-o-氨基甲酰基-α-d-吡喃甘露糖基)-β-l-吡喃古洛糖苷(d-3)。
实施例7
本发明博来霉素二糖1的制备方法的一种实施例，包括以下步骤：
(1)按实施例4所述方法制备得到博来霉素二糖前体d-3；
(2)在氮气环境下，将0.5克d-3(0.78mmol)溶于8ml氘代氯仿(cd3od)中，加入10mg甲醇钠,室温搅拌30分钟，tlc监控反应进程，完毕，加入dowex50h+树脂，共孵20分钟，过滤，滤液直接浓缩得288.2mg白色固体，即为所述博来霉素二糖1，化学名为2-o-(3-o-氨基甲酰基-α-d-吡喃甘露糖基)-αβ-l-吡喃古洛糖苷，产率96％。
1hnmr(400mhz,h2o)δ5.14(dd,j＝8.0,3.6hz,1h).tof-ms,m/z:[m+na+],calcdforc13h23no12386.1112；found:408.1101。
所述博来霉素二糖1的结构式为
实施例8
本发明博来霉素二糖1的制备方法的一种实施例，包括以下步骤：
(1)按实施例4所述方法制备得到博来霉素二糖前体d-3；
(2)在氮气环境下，将0.5克d-3(0.78mmol)溶于8mlcd3od中，加入4.5mg甲醇钠,室温搅拌30分钟，tlc监控反应进程，完毕，加入dowex50h+树脂，共孵20分钟，过滤，滤液直接浓缩得263.1mg白色固体，即为所述博来霉素二糖1，化学名为2-o-(3-o-氨基甲酰基-α-d-吡喃甘露糖基)-αβ-l-吡喃古洛糖苷。
实施例9
本发明博来霉素二糖1的制备方法的一种实施例，包括以下步骤：
(1)按实施例4所述方法制备得到博来霉素二糖前体d-3；
(2)在氮气环境下，将0.5克d-3(0.78mmol)溶于8mlcd3od中，加入21.1mg甲醇钠,室温搅拌30分钟，tlc监控反应进程，完毕，加入dowex50h+树脂，共孵20分钟，过滤，滤液直接浓缩得270.1mg白色固体，即为所述博来霉素二糖1，化学名为2-o-(3-o-氨基甲酰基-α-d-吡喃甘露糖基)-αβ-l-吡喃古洛糖苷。
实施例10
本发明博来霉素二糖2的制备方法的一种实施例，包括以下步骤：
(1)按实施例4所述方法制备得到博来霉素二糖前体d-3；
(2)在氮气保护下，将2.00克d-3(3.14mmol)溶于80ml含有
rf＝0.26(pe:ea＝1:2)；1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.33-7.28(m,4h),7.24-7.18(m,6h),5.68(t,j＝4hz,1h),5.48(s,1h),5.28(s,1h),5.21(t,j＝8hz,1h),5.12(s,1h),5.04(d,j＝12hz,1h),4.98(s,1h),4.7(s,2h),4.33-4.28(m,2h),4.11-3.98(m,5h),2.23(s,3h),2.15(s,3h),2.06(s,6h),2.01(s,3h),1.97(s,3h).1hnmr(400mhz,cdcl3)δ169.56,169.39,169.15,168.42,168.25,168.19,154.03,149.31,149.24,149.18,149.11,128.81,128.63,124.56,124.52,119.25,119.20,119.02,118.98,70.90,70.81,70.49,68.69,68.55,68.23,67.68,66.54,64.87,61.60,60.14,19.82,19.71,19.69,19.63.tof-ms,m/z:(m+na+),calcdforc37h44no21p892.2036,found:892.1995。
所述博来霉素二糖2的结构式为
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。