本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种转ntzfp8基因提高水稻组织培养分化效率的方法。
背景技术
植物组织培养技术是细胞全能性的体现。随着体细胞胚胎发生机理研究的深入及相关领域的迅猛发展，植物组织培养技术不仅在林木、农作物和园艺作物的快速繁殖方面得到广泛应用，也在基因工程品种培育中发挥着重要的作用。植物组织培养主要通过两个途径：其一为外植体直接诱导发生；其二是间接诱导发生，即通过体细胞诱导成胚性愈伤组织，愈伤组织再分化出芽，获得再生植株。分化效率是衡量植物组织培养技术效率的重要指标。
外植体和愈伤组织的分化是一个复杂的生物学过程，需要一些特定的物理和化学因子进行启动和维持，如受体植物的基因型，外植体类型和生理状态，培养基组成以及植物激素组成等。如在水稻中研究发现，不同基因型水稻，其愈伤组织分化能力不同，粳稻要明显优于籼稻(linyj,zhangq.optimisingthetissuecultureconditionsforhighefficiencytransformationofindicarice[j].plantcellreports,2005,23(8):540-547.)，同时也对籼稻愈伤组织转基因效率产生影响(tiew,zhouf,wangl,etal.reasonsforlowertransformationefficiencyinindicariceusingagrobacteriumtumefaciens-mediatedtransformation:lessonsfromtransformationassaysandgenome-wideexpressionprofiling[j].plantmolecularbiology,2012,78(1):1-18.)。外植体和愈伤组织分化效率问题增加了植物组织培养工厂化规模繁育的周期，提高了生产成本。
前人通过调节激素配比，改变培养基成分以及改良培养环境等措施提高分化能力(朱克明,陶慧敏,徐硕,等.水稻愈伤分化和再生研究进展[j].种子,2016(11):55-59.)。随着分子生物学技术的发展，通过植物生物工程进行受体植物改造从而提高再生能力已成为一个新的研究方向。
技术实现要素：
本发明的目的是提供了一种新的基因，并通过将其转基因的方式来提高水稻组织培养分化效率。
本发明首先提供了一种基因片段在提高水稻的外植体和/或愈伤组织的分化效率中的用途，其核苷酸序列如seqidno.1所示。
本发明还提供了一种重组载体在提高水稻的外植体和/或愈伤组织的分化效率中的用途，它包括seqidno.1所示的核苷酸序列。优选地，所述重组载体是重组pcambia1301载体。
本发明还提供了一种重组菌在提高水稻的外植体和/或愈伤组织的分化效率中的用途，它包含前述重组载体，优选地，所述重组菌为重组农杆菌，进一步优选为重组农杆菌eha105。
本发明还提供了一种蛋白在提高水稻的外植体和/或愈伤组织的分化效率中的用途，其氨基酸序列如seqidno.2所示.
本发明还提供了一种提高水稻组织培养分化效率的方法，取前述的基因片段、重组载体、重组菌，转入水稻中，获得稳定表达前述蛋白的水稻植株或者水稻种子，即可。
本发明提供的一种转ntzfp8提高水稻组织培养再生率的方法，本发明使用ntzfp8基因片段，得到稳定遗传的转基因材料，并且验证试验表明ntzfp8基因能够对水稻外植体和愈伤组织分化起着重要作用，分化得到的再生芽能够发育成植株，因此可将所述基因和重组质粒在品种选育和组织培养工厂化中应用，从植物基因工程这一条新途径服务于应用和生产。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为ntzfp8基因的pcr扩增的电泳图，其中m泳道为分子量标记(al2000dnamarker,购自艾德莱公司)，1-2泳道为ntzfp8扩增结果。
图2为转ntzfp8基因农杆菌菌落pcr的电泳图，其中m泳道为分子量标记(al2000dnamarker,购自艾德莱公司)，1-6泳道为农杆菌菌液pcr扩增结果。
图3为将消毒过后的种子接种到相对应的培养基上。
图4为抗性愈伤的诱导分化及生根情况。
图5为抗性苗的ntzfp8基因表达情况
图6为愈伤组织分化情况图。
具体实施方式
若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子生物学实验手册》(马文丽，2011)一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
实施例1本发明ntzfp8基因的分离以及转基因水稻的构建
(1)ntzfp8基因片段和载体的构建
称取0.5克烟草新鲜叶片，提取烟草rna，设计引物(ntzfp8-f：5’-atggacaaaacagacagagaaac-3’
ntzfp8-r：5’-tcacaagtgtagatctaaactcacat-3’)，进行pcr扩增，得到目的条带大小的片段(结果如图1所示)。pcr产物用胶回收试剂盒(takara,805a)纯化，连接t载体(transgenebiotech,ct101-01)，用热击法转化大肠杆菌dh5α感受态，转化物在含有卡那霉素的lb平板上筛选，挑取单克隆，送成都擎科梓熙生物技术有限公司进行测序。
扩增得到的目的片段ntzfp8基因的核苷酸序列(seqidno.1)为：
atggacaaaacagacagagaaactcgtgatttcatgaacgtggagtccttctctcagctaccctttattcgaccagcaccagctaataaagaaaaagccattaggctttttggcaaagaatttggtactgctggtgactccatggctgcaacagaatccactgaaacaaaccctagccaagaagaaatcaaagaccatattagcaacaacagtgagagcagtcgaaaattcgagtgccattattgttgcaggaatttcccgacttcacaagcactaggaggacatcaaaatgctcataagagagaacgccagaatgctaaaagagcgcatcttcaatctgcaatggtacacggtgctttaacagaggcaaatatttatggaataatgaattaccatcgtcttggtagtgcgccaacagcagcttatcatcatcactacgcaaccaacaatattaacagtgctactaggttttatggaagccatcaccatgttaatagtaccccttataattctcatcaaactcctataaatggaagtcctttagctttatggaggattcctgcagcaactagtgttcatcatacttcttcgtcttcgtctaattttggccgtgaacgatccatgaatatgcagccattgccagtatttgctgctaataatgaggatttcaagccttctccaatcatcaatagctcaagttctcaaagagggttcggatatgaaacaaaggccggaattaaagatcatgtgagtttagatctacacttgtga
前述核苷酸序列所述的ntzfp8基因可以通过采用上述方法获得，也可以直接合成。
提取含有ntzfp8基因的质粒，双酶切，t4-dnaligase(rt406)连接pcambia1301载体，16℃连接过夜后，将重组子转入大肠杆菌感受态细胞获得转化子。提取转化子的质粒，将其转化农杆菌eha105感受态后，挑取单菌落进行菌落pcr，菌落pcr结果(结果如图2所示)显示，出现与ntzfp8基因大小相一致的扩增产物，说明得到了含有ntzfp8基因的农杆菌eha105。
(2)转基因水稻的准备
取成熟水稻种子，机械脱壳，挑选饱满无菌斑优质种子，进行消毒，将消毒过后的种子接种到n6d培养基上(如图3所示)。取培养好的农杆菌eha105菌液置于离心管，离心取上清，悬浮在含有30μl1,000×as的30mlaam培养基中(od600＝0.05-0.1)。将长到5mm左右的愈伤组织挑出，置于农杆菌悬浮液侵染。将愈伤组织置于共培养基上培养。3天后将愈伤组织取出。将晾干的愈伤转入筛选培养基(添加了50mg/l潮霉素的n6d培养基)进行第一次筛选。将长有抗性愈伤的初始愈伤转导新筛选培养基(添加了50mg/l潮霉素的n6d培养基)，进行第二次筛选。挑取抗性愈伤，移入装有分化培养基的培养皿，封口膜封好，放入恒温培养室中等待分化成苗，如图4所示。待苗生长至1cm左右，移至生根培养基壮苗，培养条件按照文献的方法：asukanishimura,ikukoaichi,makotomatsuoka.aprotocolforagrobacterium-mediatedtransformationinrice[j].natureprotocols,2006,1(6):2796-802。
共培养基：
调节体积至1l
灭菌冷却至50℃，加入1ml1000×as
取筛选的抗性苗，测定ntzfp8基因(采用通用的rna扩增试剂盒和逆转录试剂盒进行扩增和转录，采用引物pk-f：gacgtaagggatgacgcaca；pk-r：tcttgccgttttcgtcggta进行检测)的表达情况，结果如图5所示，未转染的对照组不表达ntzfp8基因，而本发明筛选的抗性苗均可以有效表达ntzfp8基因。
ntzfp8基因表达的蛋白的氨基酸序列(seqidno.2)为：
mdktdretrdfmnvesfsqlpfirpapankekairlfgkefgtagdsmaatestetnpsqeeikdhisnnsessrkfechyccrnfptsqalgghqnahkrerqnakrahlqsamvhgalteaniygimnyhrlgsaptaayhhhyatnninsatrfygshhhvnstpynshqtpingsplalwripaatsvhhtsssssnfgrersmnmqplpvfaannedfkpspiinssssqrgfgyetkagikdhvsldlhl
实验结果证明，本发明制备得到了含有ntzfp8基因的转基因水稻。
实施例2本发明转基因水稻的分化能力检测
1、实验方法
取实施例1制备的含有ntzfp8基因的3株转基因水稻，以未经处理的水稻作为对照，检测分化能力：
(1)水稻种子消毒：
70％酒精30s，6％次氯酸钠15min，蒸馏水清洗5次。
(2)愈伤诱导及分化：
种子平铺放置于n6d培养基上，生长10天后将愈伤组织切下放入msnk培养基上(培养3-4周)，培养条件按照文献的方法：asukanishimura,ikukoaichi,makotomatsuoka.aprotocolforagrobacterium-mediatedtransformationinrice[j].natureprotocols,2006,1(6):2796-802，检测愈伤组织的分化情况：统计能长出再生芽的愈伤组织，计算愈伤组织分化率。
n6d培养基
调节体积至1l
msnk
调节体积至1l
2、实验结果
经过检测，对照组的愈伤分化率为64.7％，本发明3株转基因水稻含有ntzfp8基因的转基因水稻的愈伤分化率均为100％，分化示意图如图6所示。
实验结果证明，本发明人将ntzfp8基因转入水稻后，可以提高水稻外植体的分化能力。
序列表
<110>四川大学
<120>一种转ntzfp8基因提高水稻组织培养分化效率的方法
<130>gy007-18p1285
<150>2017104276298
<151>2017-06-08
<160>4
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>771
<212>dna
<213>段ntzfp8基因的核苷酸序列(nicotianal)
<400>1
atggacaaaacagacagagaaactcgtgatttcatgaacgtggagtccttctctcagcta60
ccctttattcgaccagcaccagctaataaagaaaaagccattaggctttttggcaaagaa120
tttggtactgctggtgactccatggctgcaacagaatccactgaaacaaaccctagccaa180
gaagaaatcaaagaccatattagcaacaacagtgagagcagtcgaaaattcgagtgccat240
tattgttgcaggaatttcccgacttcacaagcactaggaggacatcaaaatgctcataag300
agagaacgccagaatgctaaaagagcgcatcttcaatctgcaatggtacacggtgcttta360
acagaggcaaatatttatggaataatgaattaccatcgtcttggtagtgcgccaacagca420
gcttatcatcatcactacgcaaccaacaatattaacagtgctactaggttttatggaagc480
catcaccatgttaatagtaccccttataattctcatcaaactcctataaatggaagtcct540
ttagctttatggaggattcctgcagcaactagtgttcatcatacttcttcgtcttcgtct600
aattttggccgtgaacgatccatgaatatgcagccattgccagtatttgctgctaataat660
gaggatttcaagccttctccaatcatcaatagctcaagttctcaaagagggttcggatat720
gaaacaaaggccggaattaaagatcatgtgagtttagatctacacttgtga771
<210>2
<211>256
<212>prt
<213>ntzfp8基因表达的蛋白的氨基酸序列(nicotianal)
<400>2
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151015
pheserglnleupropheileargproalaproalaasnlysglulys
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65707580
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115120125
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asnmetglnproleuprovalphealaalaasnasngluaspphelys
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gluthrlysalaglyilelysasphisvalserleuaspleuhisleu
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<210>3
<211>23
<212>dna
<213>ntzfp8-f（artificial）
<400>3
atggacaaaacagacagagaaac23
<210>4
<211>26
<212>dna
<213>ntzfp8-r（artificial）
<400>4
tcacaagtgtagatctaaactcacat26