本发明涉及一种体外扩增脐血nk的方法。
背景技术：
：近十年来，手术和化疗已被用作消除肿瘤的主要方法。然而，机体对抗肿瘤药物所产生的耐药性导致肿瘤复发的几率显著升高。因此，迫切需要研究出行之有效的方法来解决肿瘤复发的难题。最近的研究表明，免疫系统在抑制恶性肿瘤发病中具有重要作用。自然杀伤细胞(naturekillercell,nk)源于骨髓中的造血前体细胞，广泛分布于不同的组织中，如外周血，脾脏，肺，肝脏和子宫中。正常人外周血中nk细胞占淋巴细胞的5％-10％，在脐血中占淋巴细胞的10％-20％，大量的研究已经证实了nk细胞在癌症免疫中的作用及治疗潜力，同时揭示了实体瘤及血液恶性肿瘤的发生与nk细胞的功能受损有关。nk细胞具有有效的抗肿瘤功能，可选择性识别杀伤高表达nk细胞活化性受体的配体、低表达mhci类分子的“非己”的肿瘤细胞，抑制肿瘤细胞的生长和转移，进而有效地清除肿瘤。肿瘤患者的免疫系统较健康人差，且部分患者前期已进行放化疗，致使免疫细胞质量及扩增能力均较差，同时，大量临床研究表明，自体nk细胞回输治疗效果欠佳，主要是因为nk细胞表面存在抑制性kir分子，其可识别自身hla-i类分子并与之结合，从而抑制nk细胞的激活。脐带血中nk细胞比例显著高于外周血中nk细胞，同时脐血中存在大量cd34+干细胞，可以通过因子诱导进行分化为nk细胞，且脐血来源较为丰富，因此，可以以脐血作为nk细胞的扩增材料，对其中nk细胞及干细胞进行体外诱导分化及扩增，从而为肿瘤治疗提供异体nk细胞，为免疫治疗提供最佳方法。目前，已经报道了多种体外扩增nk细胞的方法，从而达到更高的细胞治疗剂量，并增强活性和体内增殖潜力。例如滋养层法和因子法，滋养层法是加入肿瘤细胞系，如k562细胞等，其释放的外泌体可促进正常的造血干细胞转化，从而刺激nk细胞的增殖，但可能在nk回输治疗过程中导致肿瘤细胞发生的风险；因子法是加入促进nk细胞分化及增殖的相关因子，如白介素-2(il-2)、白介素15(il-15)等，可增强nk细胞活性，维持nk细胞长期生长，且不引入风险，安全性较高。il-15在nk细胞的分化发育过程中起着重要作用，已有研究证实il-15可促进脐血中分离的cd34+细胞定向分化为nk细胞，il-21即白细胞介素-21，分子结构与il-15相似，参与调节b细胞增殖，协同il-15促进骨髓前体细胞增殖及nk细胞增殖、分化和细胞毒活性。nk细胞具有抗肿瘤作用，在临床应用上越来越受到重视。临床应用回输时，nk细胞需要达到一定量的细胞数和较高的细胞纯度，因此在体外扩增脐血nk细胞时如何获得更高的细胞治疗剂量和较高的纯度成为肿瘤治疗的关键。技术实现要素：本发明的目的是为了解决现有脐血nk扩增方法复杂，成本高，由于引入动物源成分，安全性不高，体外扩增时间长，细胞纯度低的问题，而提供一种体外扩增脐血nk的方法。本发明的一种体外扩增脐血nk的方法，它的具体步骤如下：一、在t75培养瓶中按体积比为1:4的比例加入包被液和生理盐水；1ml包被液中包含成分：浓度为3～7μg/ml的cd16单抗、浓度为800～1200μg/ml的ifn-γ和浓度为400～600iu/ml的gm-csf；摇晃细胞瓶使包被液铺满瓶底，室温下静置1h，去除包被液，用生理盐水洗瓶底一次，去除生理盐水，放置t75培养瓶备用；二、脐血中单个核细胞的激活a、单个核细胞的分离：将80～100ml的脐血分装于离心管中，在650g，室温条件下离心15min，去除上层浅黄色血浆后，加入与上层浅黄色血浆等体积的生理盐水，得稀释的脐血；另取离心管，加入淋巴细胞分离液，并将稀释的脐血加入到淋巴细胞分离液中，使稀释的血液与淋巴细胞分离液分层，然后在650g，室温条件下离心30min，去除部分上清后，吸取中间的白膜层至离心管中，然后加入等体积的生理盐水，于室温260g离心10min，去除上清，洗涤三次，并计数；其中，淋巴细胞分离液与稀释的脐血的体积比为15:45～50；b、单个核细胞的激活：将上一步去除上清后的沉淀按细胞密度为2.0×106个/ml接种于gt-t551h3无血清培养基，并加入因子，形成混合液；将混合液置于步骤一包被后的t75培养瓶内，然后在温度为37℃、体积百分含量为5％的co2饱和湿度的培养箱中培养1～5d；并在第3d按细胞密度0.8～1.0×106个/ml补液，第5d转袋并按细胞密度0.8～1.0×106个/ml补液；其中，因子由il-2、il-7、il-15和il-21混合而成；且混合液中il-2的浓度为400～600iu/ml，il-7的浓度为8～12ng/ml，il-15的浓度为80～120ng/ml，il-21的浓度为150～200ng/ml；此步骤所述的补液为含浓度为400～600iu/ml的il-2、浓度为8～12ng/ml的il-7、浓度为40～60ng/ml的il-15和浓度为80～120ng/ml的il-21的gt-t551h3无血清培养基；三、脐血nk细胞的体外扩增在上一步培养5d后，每隔2d按细胞密度0.8～1.0×106个/ml补液，扩增后，即完成所述的体外扩增脐血nk方法；此步骤所述的补液为含浓度为400～600iu/ml的il-2、浓度为8～12ng/ml的il-7、浓度为40～60ng/ml的il-15和浓度为80～120ng/ml的il-21的gt-t551h3无血清培养基。本发明所使用的gt-t551h3无血清培养基是购买自takara公司。本发明包含以下有益效果：1、本发明无论是单个核细胞的激活过程还是扩增过程操作都较为简单，步骤较少，简便了实验流程，避免因操作过程较为复杂而引入污染，安全性高。2、本发明中，培养15天即可收获脐血nk细胞，且细胞总数高达120亿，大大缩短了体外扩增时间；培养时间15天，细胞密度较大，节约了培养基的使用，节省了人力物力，降低了成本。3、本发明所获得的脐血nk细胞纯度较高，可达到95.33％，同时其对肿瘤细胞的杀伤效果较好，仅效靶比10：1时杀伤效率即可达到91.65％。4、本发明利用因子刺激方法进行脐血nk的培养，不加入滋养层细胞，避免了nk回输治疗过程中诱发肿瘤的风险，同时体系中不引入动物源成分，安全性更高。5、包被液中含多种因子，可刺激单个核细胞激活，脐血nk细胞在第5d细胞成团较多，较其他包被液相比，本发明中的包被液激活效果较为明显。6、本发明中，通过差异化培养方式，利用高浓度il-15(100ng/ml)、il-21(180ng/ml)对脐血中cd34+细胞进行分化诱导，而在nk细胞及其前体细胞进行诱导扩增中采用了低浓度il-15(50ng/ml)、il-21(100ng/ml)，从而保证了nk分化成前体细胞的效率，同时也扩增出较高数量、高纯度和杀伤活性的成熟脐血nk细胞。附图说明图1：第0d脐血nk细胞图；图2：第15d脐血nk细胞形态图；图3：现有方法第5d脐血nk细胞形态图；图4：本发明方法第5d脐血nk细胞形态图；图5：流式细胞仪检测第0d脐血nk细胞图；图6：流式细胞仪检测第15d脐血nk细胞纯度图；图7：脐血nk细胞与肺癌a549细胞按效靶比10：1进行杀伤实验结果图。具体实施方式具体实施方式一：本实施方式的一种体外扩增脐血nk的方法，它的具体步骤如下：一、在t75培养瓶中按体积比为1:4的比例加入包被液和生理盐水；1ml包被液中包含成分：浓度为3～7μg/ml的cd16单抗、浓度为800～1200μg/ml的ifn-γ和浓度为400～600iu/ml的gm-csf；摇晃细胞瓶使包被液铺满瓶底，室温下静置1h，去除包被液，用生理盐水洗瓶底一次，去除生理盐水，放置t75培养瓶备用；二、脐血中单个核细胞的激活a、单个核细胞的分离：将80～100ml的脐血分装于离心管中，在650g，室温条件下离心15min，去除上层浅黄色血浆后，加入与上层浅黄色血浆等体积的生理盐水，得稀释的脐血；另取离心管，加入淋巴细胞分离液，并将稀释的脐血加入到淋巴细胞分离液中，使稀释的血液与淋巴细胞分离液分层，然后在650g，室温条件下离心30min，去除部分上清后，吸取中间的白膜层至离心管中，然后加入等体积的生理盐水，于室温260g离心10min，去除上清，洗涤三次，并计数；其中，淋巴细胞分离液与稀释的脐血的体积比为15:45～50；b、单个核细胞的激活：将上一步去除上清后的沉淀按细胞密度为2.0×106个/ml接种于gt-t551h3无血清培养基，并加入因子，形成混合液；将混合液置于步骤一包被后的t75培养瓶内，然后在温度为37℃、体积百分含量为5％的co2饱和湿度的培养箱中培养1～5d；并在第3d按细胞密度0.8～1.0×106个/ml补液，第5d转袋并按细胞密度0.8～1.0×106个/ml补液；其中，因子由il-2、il-7、il-15和il-21混合而成；且混合液中il-2的浓度为400～600iu/ml，il-7的浓度为8～12ng/ml，il-15的浓度为80～120ng/ml，il-21的浓度为150～200ng/ml；此步骤所述的补液为含浓度为400～600iu/ml的il-2、浓度为8～12ng/ml的il-7、浓度为40～60ng/ml的il-15和浓度为80～120ng/ml的il-21的gt-t551h3无血清培养基；三、脐血nk细胞的体外扩增在上一步培养5d后，每隔2d按细胞密度0.8～1.0×106个/ml补液，扩增后，即完成所述的体外扩增脐血nk方法；此步骤所述的补液为含浓度为400～600iu/ml的il-2、浓度为8～12ng/ml的il-7、浓度为40～60ng/ml的il-15和浓度为80～120ng/ml的il-21的gt-t551h3无血清培养基。具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：1ml包被液中包含成分：浓度为5μg/ml的cd16单抗、浓度为1000μg/ml的ifn-γ和浓度为500iu/ml的gm-csf。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一不同的是：淋巴细胞分离液与稀释的脐血的体积比为15:50。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一不同的是：因子由il-2、il-7、il-15和il-21混合而成；且混合液中il-2的浓度为500iu/ml，il-7的浓度为10ng/ml，il-15的浓度为100ng/ml，il-21的浓度为180ng/ml。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤二补液为含浓度为500iu/ml的il-2、浓度为10ng/ml的il-7、浓度为50ng/ml的il-15和浓度为100ng/ml的il-21的gt-t551h3无血清培养基。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤三补液为含浓度为500iu/ml的il-2、浓度为10ng/ml的il-7、浓度为50ng/ml的il-15和浓度为100ng/ml的il-21的gt-t551h3无血清培养基。其它与具体实施方式一相同。本
发明内容不仅限于上述各实施方式的内容，其中一个或几个具体实施方式的组合同样也可以实现发明的目的。通过以下实施例验证本发明的有益效果：实施例1本实施例的一种体外扩增脐血nk的方法，具体步骤如下：一、抗体包被细胞瓶在t75培养瓶中加入1ml包被液和4ml生理盐水，1ml包被液中包含成分：cd16单抗(5μg/ml)，ifn-γ(1000μg/ml)，gm-csf(500iu/ml)；缓慢摇晃细胞瓶使包被液铺满瓶底，室温下静置1h，去除包被液，用10ml生理盐水洗瓶底一次；二、脐血中单个核细胞的激活单个核细胞的分离：一份脐血约为80-100ml，将其分装于2个50ml的离心管中，在650g条件下室温离心15min，去除上层浅黄色血浆后，用生理盐水补到血浆原有的体积，再取2个新的50ml的离心管，加入15ml淋巴细胞分离液(ficoll)，并将稀释的血液缓慢地加入到ficoll中，使稀释的血液与ficoll有清晰的分层，在650g条件下室温离心30min，这时会看到明显的分层，下层为红细胞，中间的白膜层为单核细胞，去除部分上清后，仔细的吸取白膜层至一新的50ml的离心管中，加入等体积的生理盐水，于室温在260g条件下离心10min，去除上清，洗涤三次，并计数；单个核细胞的激活：在第0-5d是单个核细胞的激活过程；先按细胞密度为2.0×106个/ml将上一步的沉淀接种于装有20mlgt-t551h3无血清培养基的已包被的t75瓶中，并加入il-2(500iu/ml)、il-7(10ng/ml)、il-15(50ng/ml)，并置于中37℃、5％co2饱和湿度的培养箱中培养；在第3d按细胞密度0.8～1.0×106个/ml补液，第5d转袋并按细胞密度0.8～1.0×106个/ml补液；所述的补的液为含il-2(500iu/ml)、il-7(10ng/ml)、il-15(50ng/ml)的gt-t551h3无血清培养基；三、脐血nk细胞的体外扩增之后每隔2d按细胞密度0.8～1.0×106个/ml补液；所述的补液培养基为含il-2(500iu/ml)、il-7(10ng/ml)、il-15(50ng/ml)的gt-t551h3无血清培养基；在第15d计数，检测纯度及杀伤实验。实施例2本实施例的一种体外扩增脐血nk的方法，具体步骤如下：一、抗体包被细胞瓶在t75培养瓶中加入1ml包被液和4ml生理盐水，1ml包被液中包含成分：cd16单抗(5μg/ml)，ifn-γ(1000μg/ml)，gm-csf(500iu/ml)；缓慢摇晃细胞瓶使包被液铺满瓶底，室温下静置1h，去除包被液，用10ml生理盐水洗瓶底一次；二、脐血中单个核细胞的激活单个核细胞的分离：一份脐血约为80-100ml，将其分装于2个50ml的离心管中，在650g条件下室温离心15min，去除上层浅黄色血浆后，用生理盐水补到血浆原有的体积，再取2个新的50ml的离心管，加入15ml淋巴细胞分离液(ficoll)，并将稀释的血液缓慢地加入到ficoll中，使稀释的血液与ficoll有清晰的分层，在650g条件下室温离心30min，这时会看到明显的分层，下层为红细胞，中间的白膜层为单核细胞，去除部分上清后，仔细的吸取白膜层至一新的50ml的离心管中，加入等体积的生理盐水，于室温在260g条件下离心10min，去除上清，洗涤三次，并计数；单个核细胞的激活：在第0-5d是单个核细胞的激活过程；先按细胞密度为2.0×106个/ml接种于装有20mlgt-t551h3无血清培养基的已包被的t75瓶中，并加入il-2(500iu/ml)、il-7(10ng/ml)、il-15(50ng/ml)、il-21(100ng/ml)，并置于中37℃、5％co2饱和湿度的培养箱中培养；在第3d按细胞密度0.8～1.0×106个/ml补液，第5d转袋并按细胞密度0.8～1.0×106个/ml补液；所述的补的液为含il-2(500iu/ml)、il-7(10ng/ml)、il-15(50ng/ml)、il-21(100ng/ml)的gt-t551h3无血清培养基；三、脐血nk细胞的体外扩增之后每隔2d按细胞密度0.8～1.0×106个/ml补液；所述的补液培养基为含il-2(500iu/ml)、il-7(10ng/ml)、il-15(50ng/ml)、il-21(100ng/ml)的gt-t551h3无血清培养基；在第15d计数，检测纯度及杀伤实验。实施例3本实施例的一种体外扩增脐血nk的方法，具体步骤如下：一、抗体包被细胞瓶在t75培养瓶中加入1ml包被液和4ml生理盐水，1ml包被液中包含成分：cd16单抗(5μg/ml)，ifn-γ(1000μg/ml)，gm-csf(500iu/ml)；缓慢摇晃细胞瓶使包被液铺满瓶底，室温下静置1h，去除包被液，用10ml生理盐水洗瓶底一次；二、脐血中单个核细胞的激活单个核细胞的分离：一份脐血约为80-100ml，将其分装于2个50ml的离心管中，在650g条件下室温离心15min，去除上层浅黄色血浆后，用生理盐水补到血浆原有的体积，再取2个新的50ml的离心管，加入15ml淋巴细胞分离液(ficoll)，并将稀释的血液缓慢地加入到ficoll中，使稀释的血液与ficoll有清晰的分层，在650g条件下室温离心30min，这时会看到明显的分层，下层为红细胞，中间的白膜层为单核细胞，去除部分上清后，仔细的吸取白膜层至一新的50ml的离心管中，加入等体积的生理盐水，于室温在260g条件下离心10min，去除上清，洗涤三次，并计数；单个核细胞的激活：在第0-5d是单个核细胞的激活过程；先按细胞密度为2.0×106个/ml接种于装有20mlgt-t551h3无血清培养基的已包被的t75瓶中，并加入il-2(500iu/ml)，il-7(10ng/ml)、il-15(100ng/ml)、il-21(180ng/ml)，并置于中37℃、5％co2饱和湿度的培养箱中培养；在第3d按细胞密度0.8～1.0×106个/ml补液，第5d转袋并按细胞密度0.8～1.0×106个/ml补液；所述的补的液为含il-2(500iu/ml)、il-7(10ng/ml)、il-15(50ng/ml)、il-21(100ng/ml)的gt-t551h3无血清培养基；三、脐血nk细胞的体外扩增之后每隔2d按细胞密度0.8～1.0×106个/ml补液；所述的补液为含il-2(500iu/ml)、il-7(10ng/ml)、il-15(50ng/ml)、il-21(100ng/ml)的gt-t551h3无血清培养基；在第15d计数，检测纯度及杀伤实验。对实施例1至3扩增后的脐血nk细胞进行验证：1、脐血nk细胞台盼蓝计数：将脐血nk细胞混匀后，取10μl与10μl0.2％的台盼蓝混匀，打入计数板中，显微镜计数。每次计数后，按照0.8～1.0×106个/ml进行补液。第0天和第15天脐血nk细胞总数如表1所示，细胞形态图如图1和图2所示，第5d脐血nk细胞形态如图3和图4所示；2、流式细胞仪检测脐血nk细胞纯度：取开始培养第0天的脐血nk细胞和培养至15天的脐血nk细胞5ml，1300rpm离心2分钟，去除上清，pbs洗一遍，调节细胞数为2×106个/ml，500μlpbs重悬后置于流式细胞ep管中，各加入5μlcd3和cd56抗体，室温避光孵育20min，设置同型对照，1300rpm离心2分钟，去除上清，再加入500μlpbs1300rpm离心2分钟，去除上清，最后用500μlpbs重悬后上机检测。第15天脐血nk细胞流式检测结果如表2和图5和图6所示。3、肿瘤细胞杀伤实验：1)向杀伤孔板中加入50μl培养a549细胞(人肺癌细胞)的完全培养基，调基线。2)生长状态良好的a549细胞作为靶细胞，汇合度达到90％以上可用0.25％的胰酶消化，终止消化后台盼蓝计数，1300rpm离心5min，去除上清后用培养基悬起，稀释细胞密度达到1×105个/ml，杀伤孔板中加入100μl细胞悬液，培养箱中孵育过夜。3)第二天脐血nk细胞计数，脐血nk细胞作为效应细胞，细胞密度达到2×106个/ml，按效靶比5：1、10：1、20：1，加入杀伤孔板中，每组设置3个重复，培养箱中孵育过夜。肿瘤杀伤数据分析如表3和图7所示。表1实施例1实施例2实施例3第0天nk细胞数4.0*107个4.0*107个4.0*107个第15天nk细胞数6.8*109个8.2*109个12.0*109个细胞扩增倍数170205300表2表3实施例1实施例2实施例3效靶比(5:1)时杀伤率24.63％26.17％30.57％效靶比(10:1)时杀伤率85.07％87.56％91.65％效靶比(20:1)时杀伤率81.71％84.36％88.29％通过上述实施例1-3对不同细胞因子，以及浓度的分析比较，可知，实施例3所采用的细胞因子及浓度效果最佳，实施例3在培养15天即可收获脐血nk细胞，且细胞总数高达120亿，大大缩短了体外扩增时间。实施例3所获得的脐血nk细胞纯度较高，可达到95.33％，同时其对肿瘤细胞的杀伤效果较好，仅效靶比10：1时杀伤效率即可达到91.65％。当前第1页12