本发明涉及生物
技术领域：
，尤其涉及一种成软骨诱导培养基及成软骨分化方法。
背景技术：
：我国已进入老龄化快速发展阶段，老年人中骨关节病的发病非常广泛，严重影响了老年患者的生活自理和行动能力，并加速许多老年病如心脑血管疾病、代谢障碍病等的疾病进程。种子细胞来源一直是限制软骨组织工程发展的主要瓶颈。软骨细胞增殖能力有限，体外大量扩增后容易发生老化和去分化，丧失软骨的形成能力。且软骨细胞的增殖能力随年龄的增长而逐步下降进一步限制了其在组织工程中的应用。因此，寻求一种合适的种子细胞来源显得尤为重要。间充质干细胞来源于中胚层，研究证明其是一种很好的软骨组织工程种子细胞。牙周膜是一种间充质干细胞的组织来源之一，具有取材方便，免疫原性低的特点，因此，可将牙周膜来源的间充质干细胞作为一种新的软骨组织工程的种子细胞。现有技术中牙周膜干细胞成软骨诱导通常采用dmem/f12高糖培养基为基础培养基组成的传统的成软骨诱导培养基，其诱导成软骨细胞的数量少，细胞存活率低，远不能满足现代软骨组织工程种子细胞的要求。另一方面，现有技术仍然采用传统的二维诱导方法，传统的二维诱导方法诱导成软骨分化成功率较低，且需要支架材料才能形成组织，操作复杂，成本较高。技术实现要素：有鉴于此，本发明提供了一种成软骨诱导培养基及成软骨分化方法。该发明改进了干细胞成软骨诱导培养基的配方，加入了条件培养基，且更换了成软骨诱导装置，具有操作简便、成功率高、收率高、细胞存活率高的优点。为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：本发明提供了一种成软骨诱导培养基，包括条件培养基、地塞米松、维生素c、胰岛素、转铁蛋白和转化生长因子-β1。在细胞培养过程中，细胞会分泌活性物质到培养液中，其中细胞因子是主要的活性物质之一，这种培养过细胞或组织以后，含有细胞分泌物的培养液即为条件培养基。条件培养基可参与多种细胞反应，促进细胞生长，其细胞培养效果优于传统的基础培养基。优选地，所述成软骨细胞培养基中各组分的用量为：地塞米松：0.1-10μm；维生素c：10-100μg/ml；胰岛素：1-10μg/ml；转铁蛋白：1-10μg/ml；转化生长因子-β1：1-20ng/ml；条件培养基：补足。优选地，所述成软骨诱导培养基中各组分的用量为：地塞米松：0.1μm；维生素c：50μg/ml；胰岛素：6.25μg/ml；转铁蛋白：6.25μg/ml；转化生长因子-β1：10ng/ml；条件培养基：补足。在本发明提供的实施例中，条件培养基为培养过人膝关节软骨细胞的高糖dmem培养基。优选地，所述人膝关节软骨细胞为第二代至第三代。本发明还提供了一种诱导间充质干细胞成软骨分化的方法，采用上述成软骨细胞培养基培养间充质干细胞。优选地，所述间充质干细胞为牙周膜间充质干细胞。更优选地，所述牙周膜间充质干细胞为第二代至第五代。优选地，所述间充质干细胞的诱导装置为三维培养装置。更优选地，所述三维培养装置为15ml离心管。本发明提供了一种包含条件培养基与多种诱导因子组成的成软骨细胞培养基，较传统的成软骨诱导培养基，使用本发明提供的培养基进行成软骨诱导细胞收率更高，能够获得更多的软骨细胞，且细胞存活率较高，能够满足现代软骨组织工程种子细胞的要求。另一方面，本发明还提供了成软骨诱导的方法，成软骨诱导分化过程中采用15ml离心管构建了一个简单的成软骨诱导三维环境，替代了传统六孔板的二维培养环境，该方法操作简便、成本较低、成功率高。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。图1为实施例1中牙周膜间充质干细胞达到80％-90％融合时的放大40倍的细胞生长形态图；图2为实施例1的软骨细胞经离心沉淀后的细胞团块大小图；图3为对比例1的软骨细胞经离心沉淀后的细胞团块大小图；图4为采用甲苯胺蓝染液进行细胞鉴定的结果。具体实施方式下面将结合本发明具体实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例只是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本领域技术人员应当理解，对本发明的具体实施例进行修改或者对部分技术特征进行同等替换，而不脱离本发明技术方案的精神，均应涵盖在本发明保护的范围中。实施例11、本专利提供的成软骨诱导培养基的配制：1)将p2代的人膝关节软骨按5×106～10×106/cell的接种密度，接种于dmem高糖培养基中培养3d，过滤，得到条件培养基；2)按照表1所示的组成和用量配制成软骨诱导培养基：表12、牙周膜间充质干细胞成软骨分化的方法：1)从实验室获取第2代的牙周膜间充质干细胞；2)取出牙周膜间充质干细胞，置于倒置显微镜中观察，当牙周膜间充质干细胞汇合度达80％时，进行传代处理；3)用弃旧的培养基，加入细胞清洗液清洗，重复1次，每个培养皿中加入2ml0.25％胰蛋白酶溶液，使胰蛋白酶浸润整个皿底孵育1～2min，在倒置显微镜下观察，80％细胞皱缩、变圆漂浮时，加5ml干细胞培养基终止消化；其中，采用的干细胞培养基为含10％fbs的dmem/f12培养基；4)将细胞悬液转移至离心管中，充分混匀后1500rpm离心5min；5)离心结束后，倒掉离心后上清液，加入一定量的干细胞培养基进行细胞计数，调整细胞接种密度为1×105cell/ml，添加1μg/mlegf至终浓度为10ng/ml，将消化后的细胞接种培养；6)待牙周膜间充质干细胞达到80％～90％融合时，在显微镜下观察其细胞生长形态，观察结果如图1所示；弃去原培养基，用0.25％的胰蛋白酶消化1～2分钟，1000rpm离心5分钟后加入新的干细胞培养基，接种到新型诱导装置15ml离心管(购自美国corning公司)中；7)第二天换液加入按照表1方法配制的成软骨诱导培养基，其后每3天更换一次新鲜的成诱导诱导培养基，诱导21天后即得到软骨细胞。对比例11、传统成软骨诱导培养基的配制表2为传统的成软骨诱导培养基的配方，按照表2所示配制培养基：表2成分用量dmem/f12高糖基础培养基95ml胎牛血清5ml地塞米松0.1μm维生素c50μg/ml胰岛素6.25μg/ml转铁蛋白6.25μg/mltgf-β110ng/ml2、采用表2的配方诱导牙周膜间充质干细胞成软骨分化具体诱导过程和实施例1相同，区别在于步骤7)换液后加入按照表2方法配制的传统成软骨诱导培养基。对比例2采用的成软骨诱导培养基和诱导过程和实施例1相同，区别在于将步骤6)中的牙周膜间充质干细胞酶解离心后接种至六孔板中。实施例2取实施例1和对比例1诱导得到的成软骨细胞，离心，观察其沉淀后形成的细胞团块大小。图2为实施例1的软骨细胞经离心沉淀后的细胞团块大小图，图3为对比例1的软骨细胞经离心沉淀后的细胞团块大小图，黑色箭头所指即为软骨细胞团块，将图2和图3进行对比，图2的细胞团块比图3的大，图2的细胞团块肉眼即能明显观察出来，表明实施例1提供的成软骨诱导培养基收率更高。取实施例1的成软骨细胞，并采用甲苯胺蓝染液进行细胞鉴定：1)取诱导21天后的软骨细胞，弃去旧的培养基，用pbs溶液清洗5次；2)加入4％多聚甲醛溶液固定10～15min，用pbs溶液清洗5次；3)加入已配制好的甲苯胺蓝染液避光常温染色30～60min，用pbs溶液清洗5次，置于倒置显微镜下进行观察，并拍照。图4为采用甲苯胺蓝染液进行细胞鉴定的结果，图4中大部分的细胞已经被染成紫色，说明该大部分细胞已经诱导成软骨细胞。当前第1页12