本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种非组织培养的玉米遗传转化方法。
背景技术：
玉米是一种喜温作物，是世界上分布最广的作物之一，从北纬58度到南纬35～40度的地区间均有大量的栽培。全球玉米播种面积约在每年1.35-1.40亿公顷之间，总产量近7亿多吨，约占全球粮食总量的35％左右，主要分布国家有美国、中国、巴西、阿根廷，这四个国家的玉米总产量约占全球总产量的70％以上，其中美国占40％以上，中国占20％左右。玉米占世界粗粮产量的65％以上，占我国粗粮产量的90％。玉米籽粒中含有70-75％的淀粉，10％左右的蛋白质，4-5％的脂肪，2％左右的多种维生素。以玉米为原料制成的加工产品有3000种以上。玉米是制造复合饲料的最主要原料，一般占65-70％。玉米也是世界上最重要的三大粮食作物之一，也是重要的工业原料和生物能源物质，玉米既是重要的饲料和粮食作物，也是极其重要的工业原料作物。目前全球玉米产量稳步增长，但随着经济的快速发展和人民生活水平的迅速提高，玉米消费总量则持续增加，供求矛盾加剧。通过常规育种进行玉米的遗传改良是现在玉米增产的主要途径之一，但有限的遗传资源和比较长的育种周期等因素往往限制了其应用的潜力。转基因技术可以打破物种界限，对基因进行定向改造和重组，对品种的抗性、品质、产量等性状进行协调改良，在缓解资源约束、保障粮食安全和保护生态环境等方面具有重要的价值。建立良好的遗传转化体系是基因转化能否成功的关键因素之一。遗传转化是进行基因功能分析和改良作物性状的必要手段，目前玉米所使用的遗传转化方法包括基因枪法和农杆菌介导的幼胚浸染法。基因枪法多采用愈伤组织培养，可以转化质粒大片段，但却存在诱导愈伤困难的问题，转化效率受到基因型的影响，由于基因枪轰击的随机性，外源基因进入宿主基因组的整合位点相对不固定，拷贝数往往较多，这样转基因后代容易出现突变、外源基因容易丢失，容易引起基因沉默等现象的发生，不利于外源基因在宿主植物的稳定表达。而且基因枪价格昂贵、运转费用高；以幼胚为受体的农杆菌介导的转基因方法主要依赖受体细胞的脱分化和再分化过程获得转基因植株。该方法具有很多缺点，例如：转化周期长、操作繁琐、影响因素众多、基因型依赖性强。随着组培时间的延长，体细胞发生变异的可能性增大，进而使转基因植株育性降低或丧失及基因沉默等从而大大降低了目的基因的表达效率并影响了转化的目的性和真实性。
因此，我们提出了一种非组织培养的玉米遗传转化方法用于解决上述问题。
技术实现要素：
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种非组织培养的玉米遗传转化方法。
一种非组织培养的玉米遗传转化方法，包括以下步骤：
s1、将含目的基因的质粒导入农杆菌感受态细胞：取2ul含目的基因的质粒于0.2ulep管中，向质粒中加入20ul的农杆菌感受态细胞，轻柔混匀内容物盖好管盖，在冰中静置5min后放入液氮中放置5min，接着37℃放置5min，快速将ep管转移到冰浴中，使细胞冷却5min，向每支ep管加入100μl不含抗生素的lb液体培养基，将0.2ulep管转移到28℃摇床，培育2-3h使抗性基因表达，此时取出含利福平和链霉素的lb固体培养基放置到超净工作台中，重悬菌液，取60ul将其涂于含利福平和链霉素的lb固体培养基上，放置晾干，将平板倒置于28℃培养箱中，培养2d；
s2、玉米幼胚的制备：取授粉后10d-15d的玉米幼穗，用无菌水冲洗2-3遍后用75％的乙醇浸泡3min-5min，浸泡取出后用无菌水冲洗5遍，剥取幼胚后备用；
s3、将农杆菌细胞稀释到lb液体培养基中，使得含农杆菌细胞的lb培养基的od600为0.4-0.8，将玉米幼胚完全浸泡在lb培养基中，摇晃培养20min-30min；
s4、将玉米幼胚取出，并放置在ms培养基上，黑暗条件下培养2-3天后，再将在ms培养基上长势良好的玉米幼胚转移到新的ms培养基上，重复2-3次；
s5、将玉米幼胚移栽到营养土中，温室中培养；
s6、待玉米幼胚长成幼苗后，取玉米叶片并提取质粒后用pcr方法进行检测。
优选的，所述农杆菌感受态细胞的型号为eha105，且农杆菌感受态细胞储藏在-80℃冰箱中，并且从-80℃冰箱中取出农杆菌感受态细胞后使其插入冰浴中30min，待其自然融化。
优选的，所述lb固体培养基的组成为胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l，琼脂粉10g/l，ph值为7.2，lb液体培养基的组成为胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l，ph值为7.2。
优选的，所述ms培养基的组成成分为硝酸钾1.9g/l，硝酸铵1.6g/l，磷酸二氢钾0.17g/l，硫酸镁0.37g/l，氯化钙4.4g/l，蔗糖30g/l，琼脂7g/l，碘化钾0.83mg/l，硼酸6.2mg/l，硫酸锰22.3mg/l，硫酸锌8.6mg/l，硫酸钠0.25mg/l，硫酸铜0.025mg/l，氯化钴0.025mg/l，乙二胺四乙酸二钠37.3mg/l，硫酸亚铁27.8mg/l，肌醇100mg/l，甘氨酸2mg/l，盐酸硫胺素0.1mg/l，盐酸吡哆醇0.5mg/l，烟酸0.5mg/l。
优选的，所述营养土的组成成分为花生壳8份、高粱根粉6份、米糠7份、玉米秸秆粉12份、海藻泥13份，豆饼2份、秸秆8份、稻草灰4份。
优选的，所述pcr检测法采用taq酶对质粒进行插入基因的检测。
本发明的有益效果是：本发明采用农杆菌介导浸染玉米幼胚的方法成功建立适用于玉米的基因转化方法，该方法可以避免组织培养过程，不受基因型的限制，简便、高效、规模化的转化体系，以期使在玉米中进行基因功能研究与利用基因工程技术快速、适时改良玉米成为可能，促进更多的基因工程品种应用于生产，进而推动当前农作物生物工程的发展。本发明在未经历组织培养过程的阶段，而将外源的基因整合到玉米基因组中，为一种新的玉米基因遗传转化方法。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。
实施例
一种非组织培养的玉米遗传转化方法，包括以下步骤：
s1、将含目的基因的质粒导入农杆菌感受态细胞：取2ul含目的基因的质粒于0.2ulep管中，向质粒中加入20ul的型号为eha105的农杆菌感受态细胞，农杆菌感受态细胞储藏在-80℃冰箱中，从-80℃冰箱中取出农杆菌感受态细胞后使其插入冰浴中30min，待其自然融化，轻柔混匀内容物盖好管盖，在冰中静置5min后放入液氮中放置5min，接着37℃放置5min，快速将ep管转移到冰浴中，使细胞冷却5min，向每支ep管加入100μl不含抗生素的lb液体培养基，lb液体培养基的组成为胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l，ph值为7.2，将0.2ulep管转移到28℃摇床，培育3h使抗性基因表达，此时取出含利福平和链霉素的lb固体培养基放置到超净工作台中，重悬菌液，取60ul将其涂于含利福平和链霉素的lb固体培养基上，lb固体培养基的组成为胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l，琼脂粉10g/l，ph值为7.2，放置晾干，将平板倒置于28℃培养箱中，培养2d；
s2、玉米幼胚的制备：取授粉后15d的玉米幼穗，用无菌水冲洗3遍后用75％的乙醇浸泡5min，浸泡取出后用无菌水冲洗5遍，剥取幼胚后备用；
s3、将农杆菌细胞稀释到lb液体培养基中，使得含农杆菌细胞的lb培养基的od600为0.6，将玉米幼胚完全浸泡在lb培养基中，摇晃培养30min；
s4、将玉米幼胚取出，并放置在ms培养基上，ms培养基的组成成分为硝酸钾1.9g/l，硝酸铵1.6g/l，磷酸二氢钾0.17g/l，硫酸镁0.37g/l，氯化钙4.4g/l，蔗糖30g/l，琼脂7g/l，碘化钾0.83mg/l，硼酸6.2mg/l，硫酸锰22.3mg/l，硫酸锌8.6mg/l，硫酸钠0.25mg/l，硫酸铜0.025mg/l，氯化钴0.025mg/l，乙二胺四乙酸二钠37.3mg/l，硫酸亚铁27.8mg/l，肌醇100mg/l，甘氨酸2mg/l，盐酸硫胺素0.1mg/l，盐酸吡哆醇0.5mg/l，烟酸0.5mg/l，黑暗条件下培养3天后，再将在ms培养基上长势良好的玉米幼胚转移到新的ms培养基上，重复2次；
s5、将玉米幼胚移栽到营养土中，营养土的组成成分为花生壳8份、高粱根粉6份、米糠7份、玉米秸秆粉12份、海藻泥13份，豆饼2份、秸秆8份、稻草灰4份，温室中培养；
s6、待玉米幼胚长成幼苗后，取玉米叶片并提取质粒后用taq酶的pcr方法对质粒进行插入基因进行检测。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。