本发明属于基因工程和代谢工程技术领域，具体涉及一种含有乙醇诱导启动子的质粒载体及其在提高谷氨酸棒杆菌重组蛋白表达量中的应用。
背景技术：
谷氨酸棒杆菌是一种兼性厌氧的革兰氏阳性工业微生物，广泛用于一些有机酸的合成。因具有无内毒素、抗逆性强、蛋白酶水平较低等优势，近年来谷氨酸棒杆菌也正逐渐被开发用于生物燃料的生产以及外源重组蛋白的表达。
启动子是一段rna聚合酶特异性识别和结合的dna序列，是基因的一个组成部分，控制基因转录的起始。启动子的强弱将直接影响蛋白表达水平。研究证明在控制蛋白质表达水平的序列各种区域中，启动子的影响力高达45％。目前在谷氨酸棒杆菌表达系统中，人们依旧局限于传统tac，trc，cspb等传统启动子的使用，2015年kimetal开发并优化的谷氨酸棒杆菌自诱导载体表达sfgfp时的自诱导倍数仅为3.5倍，可见谷氨酸棒杆菌自诱导启动子在蛋白表达中的应用还有待开发。
技术实现要素：
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
鉴于上述的技术缺陷，提出了本发明。
因此，作为本发明其中一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供一种含有乙醇诱导启动子的质粒载体。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案一种含有乙醇诱导启动子的质粒载体，其中：所述乙醇诱导启动子为谷氨酸棒杆菌异柠檬酸裂合酶编码基因的启动子。
作为本发明所述的含有乙醇诱导启动子的质粒载体的一种优选方案：所述乙醇诱导启动子，为对谷氨酸棒杆菌基因组进行pcr扩增，得到带有hindⅲ以及bsaⅰ接头的异柠檬酸裂合酶编码基因的启动子区域，所述区域为从atg上游500bp到atg下游59bp，其包含转录起始位点以及完整的5'末端非翻译区。
作为本发明所述的含有乙醇诱导启动子的质粒载体的一种优选方案：所述质粒载体，包括p19-0载体。
作为本发明所述的含有乙醇诱导启动子的质粒载体的一种优选方案：所述质粒载体上装载了谷氨酸棒杆菌的外源基因。
作为本发明所述的含有乙醇诱导启动子的质粒载体的一种优选方案：所述外源基因包括荧光蛋白。
作为本发明所述的含有乙醇诱导启动子的质粒载体的一种优选方案：所述应该蛋白包括增强型绿色荧光蛋白。
作为本发明所述的含有乙醇诱导启动子的质粒载体的一种优选方案：所述乙醇诱导，乙醇体积浓度为0.5～10％。
作为本发明所述的含有乙醇诱导启动子的质粒载体的一种优选方案：所述乙醇诱导，乙醇体积浓度为0.5～3％。
本发明的有益效果：本发明含有乙醇诱导启动子的载体装载重组蛋白，在含有1％乙醇的lbb培养基中培养36h后，相比不添加乙醇的本发明的乙醇诱导启动子具有9.5倍的诱导效果。本发明含有乙醇诱导启动子的质粒载体具有显著提高重组蛋白表达的作用，相比于自身对数期(4h)的表达水平，本发明乙醇诱导启动子有着提高21.1倍的自诱导效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为本发明picl-b-egfp双顺反子表达载体结构示意图。该图表示本发明中乙醇启动子的结构，将pcr后得到的异柠檬酸裂合酶编码基因的启动子区域(从atg上游500bp到atg下游59bp)与egfp片段(其5'末端含有一个保守的核糖体结合位点aaaggagga)连接。
图2为本发明picl-b-egfp载体的egfp表达强度和诱导效果图。该图表示添加乙醇与不添加乙醇对egfp表达的影响，以及乙醇在不同时间的诱导效果。
图3为picl-b-egfp载体的egfp表达强度和诱导效果图。该图表示添加乙醇与不添加乙醇对egfp表达的影响，以及乙醇在不同时间的诱导效果。
图4为不同乙醇浓度对tac启动子表达egfp的影响图。该图表示tac启动子组成型表达egfp的谷氨酸棒杆菌在0％、1％、3％、5％乙醇培养基中培养24h后的od600以及荧光强度。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
实施例1：
乙醇添加对谷氨酸棒杆菌蛋白表达的影响：
从-80℃冰箱取出表达egfp(pxmj19-egfp)的谷氨酸棒杆菌菌株，在固体平板上划线活化后，挑菌接种至10mllbb培养基，200r/min，30℃，培养24h。以2％的接种量将上述菌液转接至2瓶含有10ml的lb液体培养基中，向上述两个培养瓶中的一瓶添加终浓度为0.5％～3％的无水乙醇，另一瓶不添加。200r/min，30℃，培养36h。收集上述菌体，菌体量定为一致，超声破碎提取蛋白，上述蛋白样品进行sds-page电泳。发现1％乙醇的添加会使得菌体胞内蛋白多出一条明显的条带(图2)，该条带相比其它被1％乙醇诱导的蛋白更为显著，这意味着乙醇对该启动子的诱导幅度较大又或者该基因的翻译效率较高。经质谱检测该条带是乙醛酸循环中的异柠檬酸裂合酶(isocitratelyase，icl)。
实验结果表明，在30℃培养10h之后在上述摇瓶中分别添加终浓度为0.5％～10％的无水乙醇，仍可起到诱导表达的作用。
表1构建picl-b-egfp载体所用的两对引物序列表。
实施例2：
乙醇诱导启动子表达载体的构建及其对外源蛋白egfp表达的影响：
利用引物picl-b-egfp-uf/r对谷氨酸棒杆菌基因组进行pcr扩增，得到带有hindⅲ/以及bsaⅰ接头的异柠檬酸裂合酶编码基因的启动子区域(从atg上游500bp到atg下游59bp，包含了转录起始位点以及完整的5'末端非翻译区)。利用引物picl-b-egfp-df/r对含有egfp的质粒pxmj19-egfp进行pcr扩增，得到含有bsaⅰ以及bamhⅰ接头的egfp片段(其5'末端含有一个保守的核糖体结合位点aaaggagga)。将得到的启动子片段和egfp片段分别用上述接头对应的内切酶处理。酶切、纯化后将两片段与hindⅲ和bamhⅰ处理过的p19-0载体一起进行连接反应。转化大肠杆菌dh5α，构建得到乙醇诱导载体picl-b-egfp(图1)。
将重组表达载体转化至谷氨酸棒杆菌中，获得重组菌株，将该菌株接种至10ml液体lbb培养基中培养24h后以2％接种量转接至新的10ml的lbb培养基中，一瓶添加1％无水乙醇，一瓶不添加，200r/min，30℃，培养。分别于4h、12h、36h取1ml菌液低温离心，弃上清，用pbs缓冲液洗涤两次，重悬并将od600调至0.5左右，重悬后使用bioteksynergy多功能酶标仪检测od600和荧光强度。根据gfp最适检测波长，设置检测荧光强度时的参数为：激发波长488nm，发射波长507nm。pbs用做空白对照。od600表示菌体量，荧光测量值/od600用来表示gfp的单位表达水平。在含有1％乙醇的lbb培养基中培养36h后，相比不添加乙醇的对照该表达载体具有9.5倍的诱导效果，相比自身对数期(4h)的表达水平有着21.1倍自诱导效果(图3)。添加1％乙醇的条件下该自诱导载体的表达水平达到了tac启动子约65％的强度，高出不添加1％乙醇时的tac启动子约30％(图4)。
本发明含有乙醇诱导启动子的载体装载重组蛋白，在含有1％乙醇的lbb培养基中培养36h后，相比不添加乙醇的本发明的乙醇诱导启动子具有9.5倍的诱导效果。本发明含有乙醇诱导启动子的质粒载体具有显著提高重组蛋白表达的作用，相比于自身对数期(4h)的表达水平，本发明乙醇诱导启动子有着提高21.1倍的自诱导效果。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
序列表
<110>江南大学
<120>一种含有乙醇诱导启动子的质粒载体及其在提高谷氨酸棒杆菌重组蛋白表达量中的应用
<160>5
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