本发明属于细胞提取方法领域，具体是涉及到sd大鼠胃窦间质细胞的分离和培养方法。
背景技术
胃窦间质细胞（icc）是作为胃肠运动的起搏细胞，可以产生自主节律性慢波电位，通过突出及缝隙连接作用于胃肠的平滑肌细胞，促进平滑肌的节律性舒缩。而多种胃肠病如慢性传输型便秘、功能性消化不良、糖尿病胃轻瘫等均与icc的病理变化有关。现有的icc原代细胞提取技术，多是采用成年sd大鼠，用ⅱ型胶原酶消化，梯度离心法进行纯化。但这种方式不能避免成年大鼠icc细胞高度分化，不能避免梯度离心对细胞的损伤和丢失。
技术实现要素：
本发明针对现有icc细胞分离方法的缺陷，采用幼年4~5周龄（110±10g）的sd大鼠作为实验动物，采用细胞接触抑制及优势竞争的原理进行提纯，采用含有干细胞因子（scf）的完全培养基进行培养，可以稳定、持续、高效获得高表达率的icc细胞。
本发明通过以下技术方案得以实现。
sd大鼠胃窦间质细胞的分离和培养方法，包括以下步骤：
s1、初步分离
选用4~5周龄的sd大鼠，禁食不禁水12h后，采取乙醚吸入麻醉，颈椎脱臼发处死；用75%乙醇湿润腹部，无菌条件下打开腹腔，取出胃窦，沿胃小弯剪开，置于无菌玻璃皿内，使用温度为3-5℃的pbs液反复冲洗3次，快速更换无菌玻璃皿并置于冰上，加入适量pbs液，解剖显微镜下用眼科剪和眼科镊锐性分离胃粘膜及粘膜下层，将剥离后的组织置于含有m199完全培养基的试管中，并放于冰下，以保持细胞活性；
s2、分离出icc细胞
将步骤s1中剥离好的胃窦肌层组织放于无菌安倍瓶里，加入2-3倍体积的m199完全培养基，置于冰上，并用眼科镊快速的将组织剪碎成大小为1mm3的组织块，将组织块移至无菌试管中，加入6-10mlm199完全培养基，于冰上静置5min，去掉上清液，加入ⅱ型胶原酶3-5ml，盖紧试管盖并用封口胶封口，水浴锅36-37℃中消化35~40min，水平放置，每10min观察组织块消化情况并轻柔的摇晃试管使组织与液体充分接触，进行离心操作，加入m199完全培养基5ml，用粗口试管缓慢吹打6~10min，用200-300目筛网过滤，得到细胞悬液，移入细胞培养瓶中，十字法摇匀细胞悬液，使其分布均匀；
s3、提纯icc细胞
将步骤s2得到的分布均匀的细胞悬液，置于37℃、5%co2培养箱中培养，8h后观察细胞贴壁情况，并弃细胞培养液，使用d-hanks液洗2次，加入4mlm199完全培养基，第一次换液后，每24h观察细胞形态，每48h换液一次；第一代细胞于第7天到对数生长期，观察并传代，进行消化操作后，倒置显微镜下观察消化情况，待细胞明显收缩、细胞间隙增加时，加入3mlm199完全培养基终止消化，轻轻沿瓶底吹打2min，收集细胞悬液于离心管中，1200r/min离心5min，去掉上清液，得到分离好的icc细胞。
进一步的，所述步骤s1中，剥离组织的要求为：应该快、准，减少对组织的损伤，以锐性分离为原则操作，每只胃窦处理时间控制在10分钟内，在冰上操作。
进一步的，所述步骤s1中使用到的pbs液中含有2%的青霉素-链霉素溶液。
进一步的，所述步骤s2中，最后加入的m199完全培养基中，含有10%血清溶液及2%的青霉素-链霉素溶液。
进一步的，所述步骤s2中的ⅱ型胶原酶的浓度为0.4-0.6%。
进一步的，所述步骤s2中的离心操作为，试样在1500r/min离心3min，去掉上清液，加入m199完全培养基重悬洗去消化液，吹打混匀后再在1500r/min离心3min，最后去掉上清液。
进一步的，所述步骤s2中在水浴锅中的消化温度为36-37℃。
进一步的，所述步骤s3中的消化操作为，细胞悬液使用d-hanks液洗2次后，分出d-hanks液，加入0.25%胰蛋白酶溶液2ml，于37℃消化1mim。
进一步的，所述步骤s1-s3中使用的m199完全培养基中加入干细胞因子，加入的量为m199完全培养基体积的2-5%。
本发明的有益效果为：
1、本发明所述的方法，选用4~5周龄（110±10g）的sd大鼠作为实验动物，避免了由于成年大鼠icc细胞的高度分化，而造成细胞获得率低的弊端，同时本发明调整了ⅱ型胶原酶的浓度，避免了低浓度长时间消化或者高浓度短时间消化对细胞造成的损伤；采用细胞接触抑制及优势竞争的原理进行提纯，避免了由于梯度离心对脆弱的细胞造成损伤；
2、本发明所述的方法，采用细胞接触抑制及优势竞争的原理进行提纯，在含干细胞因子（scf）的完全培养基培养，增加了icc细胞的获得率，避免了提取过程中icc细胞的丢失。
具体实施方式
下面进一步描述本发明的技术方案，但要求保护的范围并不局限于所述。
主要仪器和试剂：解剖显微镜、倒置显微镜、荧光显微镜、低温离心机、水浴锅、纯水机、台式高速低温离心机、高压消毒锅、超净台、低温冰箱、外科手术器械、胎牛血清、m199培养液、ⅱ型胶原酶、d-hanks液、pbs液、胰酶0.25%、青霉素-链霉素溶液、乙醚等。
实验动物：spf级sd大鼠，鼠龄月为4~5周龄，体重110±10g，雌雄不限。实验前禁食不禁水12h。
icc细胞的鉴定方法：
取分离好的icc细胞，经pbs液清洗后，无水甲醛固定，5%脱脂奶粉封闭10min，加入c-kitantibody溶液，4℃孵育过夜，pbs液冲洗3遍，加入2%青霉素-链霉素溶液，37℃孵育1h，抗淬灭剂封片后与荧光显微镜先观察并拍照。
实施例1
sd大鼠胃窦间质细胞的分离和培养方法，包括以下步骤：
s1、初步分离
选用4周龄的sd大鼠，禁食不禁水12h后，采取乙醚吸入麻醉，颈椎脱臼发处死；用75%乙醇湿润腹部，无菌条件下打开腹腔，取出胃窦，沿胃小弯剪开，置于无菌玻璃皿内，使用温度为3℃的pbs液反复冲洗3次，快速更换无菌玻璃皿并置于冰上，加入适量pbs液，解剖显微镜下用眼科剪和眼科镊锐性分离胃粘膜及粘膜下层，将剥离后的组织置于含有m199完全培养基的试管中，并放于冰下，以保持细胞活性；剥离组织的要求为：应该快、准，减少对组织的损伤，以锐性分离为原则操作，每只胃窦处理时间控制在10分钟内，在冰上操作。上述所使用的pbs液中含有2%的青霉素-链霉素溶液。
s2、分离出icc细胞
将步骤s1中剥离好的胃窦肌层组织放于无菌安倍瓶里，加入2倍体积的m199完全培养基，置于冰上，并用眼科镊快速的将组织剪碎成大小为1mm3的组织块，将组织块移至无菌试管中，加入6mlm199完全培养基，于冰上静置5min，去掉上清液，加入浓度为0.4%ⅱ型胶原酶3ml，盖紧试管盖并用封口胶封口，水浴锅36℃中消化35min，水平放置，每10min观察组织块消化情况并轻柔的摇晃试管使组织与液体充分接触，试样在1500r/min离心3min，去掉上清液，加入m199完全培养基重悬洗去消化液，吹打混匀后再在1500r/min离心3min，最后去掉上清液；加入m199完全培养基5ml，用粗口试管缓慢吹打6~10min，用200目筛网过滤，得到细胞悬液，移入细胞培养瓶中，十字法摇匀细胞悬液，使其分布均匀；
s3、提纯icc细胞
将步骤s2得到的分布均匀的细胞悬液，置于36℃、5%co2培养箱中培养，8h后观察细胞贴壁情况，并弃细胞培养液，使用d-hanks液洗2次，加入4mlm199完全培养基，第一次换液后，每24h观察细胞形态，每48h换液一次；第一代细胞于第7天到对数生长期，观察并传代，细胞悬液使用d-hanks液洗2次后，分出d-hanks液，加入0.25%胰蛋白酶溶液2ml，于36℃消化1mim，倒置显微镜下观察消化情况，待细胞明显收缩、细胞间隙增加时，加入3mlm199完全培养基终止消化，轻轻沿瓶底吹打2min，收集细胞悬液于离心管中，1200r/min离心5min，去掉上清液，得到分离好的icc细胞。
步骤s1-s3中使用的m199完全培养基中加入了1%的干细胞因子。
实施例2
sd大鼠胃窦间质细胞的分离和培养方法，包括以下步骤：
s1、初步分离
选用5周龄的sd大鼠，禁食不禁水12h后，采取乙醚吸入麻醉，颈椎脱臼发处死；用75%乙醇湿润腹部，无菌条件下打开腹腔，取出胃窦，沿胃小弯剪开，置于无菌玻璃皿内，使用温度为5℃的pbs液反复冲洗3次，快速更换无菌玻璃皿并置于冰上，加入适量pbs液，解剖显微镜下用眼科剪和眼科镊锐性分离胃粘膜及粘膜下层，将剥离后的组织置于含有m199完全培养基的试管中，并放于冰下，以保持细胞活性；剥离组织的要求为：应该快、准，减少对组织的损伤，以锐性分离为原则操作，每只胃窦处理时间控制在10分钟内，在冰上操作。上述所使用的pbs液中含有2%的青霉素-链霉素溶液。
s2、分离出icc细胞
将步骤s1中剥离好的胃窦肌层组织放于无菌安倍瓶里，加入3倍体积的m199完全培养基，置于冰上，并用眼科镊快速的将组织剪碎成大小为1mm3的组织块，将组织块移至无菌试管中，加入10mlm199完全培养基，于冰上静置5min，去掉上清液，加入浓度为0.6%ⅱ型胶原酶3-5ml，盖紧试管盖并用封口胶封口，水浴锅中37℃消化40min，水平放置，每10min观察组织块消化情况并轻柔的摇晃试管使组织与液体充分接触，试样在1500r/min离心3min，去掉上清液，加入m199完全培养基重悬洗去消化液，吹打混匀后再在1500r/min离心3min，最后去掉上清液，加入m199完全培养基5ml，用粗口试管缓慢吹打10min，用300目筛网过滤，得到细胞悬液，移入细胞培养瓶中，十字法摇匀细胞悬液，使其分布均匀；
s3、提纯icc细胞
将步骤s2得到的分布均匀的细胞悬液，置于37℃、5%co2培养箱中培养，8h后观察细胞贴壁情况，并弃细胞培养液，使用d-hanks液洗2次，加入4mlm199完全培养基，第一次换液后，每24h观察细胞形态，每48h换液一次；第一代细胞于第7天到对数生长期，观察并传代，细胞悬液使用d-hanks液洗2次后，分出d-hanks液，加入0.25%胰蛋白酶溶液2ml，于37℃消化1mim，倒置显微镜下观察消化情况，待细胞明显收缩、细胞间隙增加时，加入3mlm199完全培养基终止消化，轻轻沿瓶底吹打2min，收集细胞悬液于离心管中，1200r/min离心5min，去掉上清液，得到分离好的icc细胞。
步骤s1-s3中使用的m199完全培养基中加入了5%的干细胞因子。
实施例3
sd大鼠胃窦间质细胞的分离和培养方法，包括以下步骤：
s1、初步分离
选用4.5周龄的sd大鼠，禁食不禁水12h后，采取乙醚吸入麻醉，颈椎脱臼发处死；用75%乙醇湿润腹部，无菌条件下打开腹腔，取出胃窦，沿胃小弯剪开，置于无菌玻璃皿内，使用温度为4℃的pbs液反复冲洗3次，快速更换无菌玻璃皿并置于冰上，加入适量pbs液，解剖显微镜下用眼科剪和眼科镊锐性分离胃粘膜及粘膜下层，将剥离后的组织置于含有m199完全培养基的试管中，并放于冰下，以保持细胞活性；剥离组织的要求为：应该快、准，减少对组织的损伤，以锐性分离为原则操作，每只胃窦处理时间控制在10分钟内，在冰上操作。上述所使用的pbs液中含有2%的青霉素-链霉素溶液。
s2、分离出icc细胞
将步骤s1中剥离好的胃窦肌层组织放于无菌安倍瓶里，加入2-3倍体积的m199完全培养基，置于冰上，并用眼科镊快速的将组织剪碎成大小为1mm3的组织块，将组织块移至无菌试管中，加入8mlm199完全培养基，于冰上静置5min，去掉上清液，加入浓度为0.5%ⅱ型胶原酶4ml，盖紧试管盖并用封口胶封口，水浴锅36.5℃中消化38min，水平放置，每10min观察组织块消化情况并轻柔的摇晃试管使组织与液体充分接触，试样在1500r/min离心3min，去掉上清液，加入m199完全培养基重悬洗去消化液，吹打混匀后再在1500r/min离心3min，最后去掉上清液，加入m199完全培养基5ml，用粗口试管缓慢吹打8min，用250目筛网过滤，得到细胞悬液，移入细胞培养瓶中，十字法摇匀细胞悬液，使其分布均匀；
s3、提纯icc细胞
将步骤s2得到的分布均匀的细胞悬液，置于36.5℃、5%co2培养箱中培养，8h后观察细胞贴壁情况，并弃细胞培养液，使用d-hanks液洗2次，加入4mlm199完全培养基，第一次换液后，每24h观察细胞形态，每48h换液一次；第一代细胞于第7天到对数生长期，观察并传代，细胞悬液使用d-hanks液洗2次后，分出d-hanks液，加入0.25%胰蛋白酶溶液2ml，于36.5℃消化1mim，倒置显微镜下观察消化情况，待细胞明显收缩、细胞间隙增加时，加入3mlm199完全培养基终止消化，轻轻沿瓶底吹打2min，收集细胞悬液于离心管中，1200r/min离心5min，去掉上清液，得到分离好的icc细胞。
步骤s1-s3中使用的m199完全培养基中加入了3%的干细胞因子。
实施例4
sd大鼠胃窦间质细胞的分离和培养方法，包括以下步骤：
s1、初步分离
选用4.2周龄的sd大鼠，禁食不禁水12h后，采取乙醚吸入麻醉，颈椎脱臼发处死；用75%乙醇湿润腹部，无菌条件下打开腹腔，取出胃窦，沿胃小弯剪开，置于无菌玻璃皿内，使用温度为4.5℃的pbs液反复冲洗3次，快速更换无菌玻璃皿并置于冰上，加入适量pbs液，解剖显微镜下用眼科剪和眼科镊锐性分离胃粘膜及粘膜下层，将剥离后的组织置于含有m199完全培养基的试管中，并放于冰下，以保持细胞活性；剥离组织的要求为：应该快、准，减少对组织的损伤，以锐性分离为原则操作，每只胃窦处理时间控制在10分钟内，在冰上操作。上述所使用的pbs液中含有2%的青霉素-链霉素溶液。
s2、分离出icc细胞
将步骤s1中剥离好的胃窦肌层组织放于无菌安倍瓶里，加入2-3倍体积的m199完全培养基，置于冰上，并用眼科镊快速的将组织剪碎成大小为1mm3的组织块，将组织块移至无菌试管中，加入9.5mlm199完全培养基，于冰上静置5min，去掉上清液，加入浓度为0.45%ⅱ型胶原酶3.5ml，盖紧试管盖并用封口胶封口，水浴锅中36.7℃消化39min，水平放置，每10min观察组织块消化情况并轻柔的摇晃试管使组织与液体充分接触，试样在1500r/min离心3min，去掉上清液，加入m199完全培养基重悬洗去消化液，吹打混匀后再在1500r/min离心3min，最后去掉上清液，加入m199完全培养基5ml，用粗口试管缓慢吹打9min，用300目筛网过滤，得到细胞悬液，移入细胞培养瓶中，十字法摇匀细胞悬液，使其分布均匀；
s3、提纯icc细胞
将步骤s2得到的分布均匀的细胞悬液，置于36.8℃、5%co2培养箱中培养，8h后观察细胞贴壁情况，并弃细胞培养液，使用d-hanks液洗2次，加入4mlm199完全培养基，第一次换液后，每24h观察细胞形态，每48h换液一次；第一代细胞于第7天到对数生长期，观察并传代，细胞悬液使用d-hanks液洗2次后，分出d-hanks液，加入0.25%胰蛋白酶溶液2ml，于36.8℃消化1mim，倒置显微镜下观察消化情况，待细胞明显收缩、细胞间隙增加时，加入3mlm199完全培养基终止消化，轻轻沿瓶底吹打2min，收集细胞悬液于离心管中，1200r/min离心5min，去掉上清液，得到分离好的icc细胞。
上述实施例中，步骤s1-s3中使用的m199完全培养基中分别加入了完全培养基体积的2%、5%、3%、4.5%的干细胞因子。
对比例1
实施例中在步骤s1选用成年大鼠来进行试验，其余条件和实施例3一致；
对比例2
实施例中在步骤s2中选用浓度为0.2%的ⅱ型胶原酶来进行消化，其余条件和实施例3一致；
对比例3
实施例中在步骤s2中选用浓度为0.9%的ⅱ型胶原酶来进行消化，其余条件和实施例3一致；
将实施例1-4以及对比例1-3分离出的icc细胞进行了鉴定，发现：
将实施例1-实施例4分离出的icc细胞，在荧光显微镜下可见细胞胞体呈红色荧光染色，红色局域分布均匀，没有别的杂色出现，说明分离出的icc细胞较纯净，含量高；对比例1-3分离出的细胞胞体，在荧光显微镜下可见有部分细胞呈现红色荧光染色，红色局域分布混乱，有别的杂色出现，说明分离出的icc细胞不纯净，可能还有部分平滑肌细胞，纯度较低。
以上内容是结合具体的/优选的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以对这些已描述的实施例做出若干替代或变型，而这些替代或变型方式都应当视为属于本发明的保护范围。