朱栾外果皮DNA在朱栾种质资源鉴定分析中的应用的制作方法

本发明涉及生物物种的检测领域，具体地，涉及朱栾外果皮基因组dna在朱栾种质资源鉴定分析中的应用及分析方法。

背景技术：

枳壳作为一种常用中药,是芸香科植物酸橙及其栽培变种黄皮酸橙、代代花、朱栾和塘橙的干燥未成熟果实，临床主要用于治疗胸闷胀痛、食积不化、痰饮、胃下垂、脱肛、子宫脱垂等症状，具有重要的药用价值。由于枳壳品种繁多、种植区域广泛，来源复杂，兼之以次充好、以假充真，使得同物异名、同名异物现象严重，枳壳交易市场混乱，为研究和临床用药带来不便。

朱栾是枳壳的一种主要栽培变种，由于朱栾与其近源种药材在外观上比较接近，依靠形态难以进行鉴定。因此，如何有效、快速地鉴定朱栾成为一个亟须解决的问题，通过鉴定朱栾不仅可以将其与近源物种进行区分，为研究朱栾的作用奠定基础，同时通过鉴定朱栾也可以初步鉴别某一物种是否可以归属于枳壳类。

传统的鉴别方法主要有基源鉴别、性状鉴别、显微鉴别和理化鉴别，主要依靠外观性状特征进行区别，易受外界因素影响。虽然通过基源、显微、理化等方法可以从某种角度上较为客观地鉴别朱栾，但是均存在一定局限性，尤其受生长环境、气候、加工炮制、取材部位等因素影响。为了保证朱栾临床用药的安全有效，寻找一套快速、科学的鉴定检测技术势在必行。

dna分子标记技术在中药材鉴定中具有广泛的应用，为中药材鉴定方法的探索注入了活力，带来了新的方向。dna分子标记技术具有微量、快速、准确、特异性强、对样本要求较低的特点，能够弥补传统生药鉴定方法的不足。但是，dna分子标技术也存在一些不足：①中药材的dna提取困难，中药材经过炮制处理，杂质含量高，难以提取适合后续pcr反应的优质dna；②对实验技术人员要求高；③设备要求高，成本较高，难普及；④重现性不好，鉴别程序复杂；⑤不同部位入药的药材难以区分。高质量的基因组dna是应用dna分子标记技术的先决条件，能否顺利进行后续鉴定取决于提取的基因组dna的质量，dna浓度过低或纯度过低均会影响分子鉴定的后续操作。

本发明通过对朱栾dna提取过程进行优化，探讨朱栾果实不同取材部位提取的基因组dna在朱栾种质资源鉴定分析中的应用，这对于枳壳类药材的物种鉴定是一项有益补充，有利于质监部门进行快速、准确的品种检验。

技术实现要素：

本发明的目的之一是提供一种朱栾种质资源鉴定分析方法。

在一些优选方式中，所述方法利用朱栾外果皮基因组dna进行pcr扩增，包括如下步骤：

(1)提取待测样品的外果皮dna；

(2)合成引物，以提取的dna为模板进行pcr扩增；

(3)将步骤(2)中得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。

本发明还提供一种朱栾dna在朱栾种质资源鉴定分析中的应用。

在一些优选方式中，所述dna为朱栾外果皮基因组dna；

在一些优选方式中，所述外果皮基因组dna的提取包括如下步骤：

(1)取外果皮组织约50mg，研磨至过120目筛的极细粉，装入ep管中；

(2)在ep管中加入0℃超纯水，置于0℃冰箱浸泡30小时，每隔10小时换一次水；12000rpm/min离心5min，用移液枪小心移去上清液，置于40℃烘箱中烘干；

(3)将缓冲液fp1和fp2置于37℃水浴中预热2min；

(4)在样品中加入1000μl缓冲液fp1和15ulrnasea，涡旋振荡1min，60℃水浴20min，每隔5min剧烈摇荡一次；

(5)加入325μl缓冲液fp2，充分混匀，涡旋振荡1min；

(6)12000rpm/min下离心5min，将上清液转至另一离心管中；

(7)向上清液中加入0.2倍体积的2.5mol/lnacl和0.7倍体积的异丙醇，充分混匀，于12000rpm/min离心2min，收集沉淀；

(8)沉淀中加入600μl70％乙醇进行洗涤，涡旋振荡5秒钟，于12000rpm/min离心2min，弃上清液，重复洗涤2-3次；

(9)将沉淀置于40℃烘箱，晾干残余乙醇；

(10)加入50μl灭菌蒸馏水或超纯水溶解dna，60℃水浴助溶，期间颠倒混匀数次，得到dna溶液，于4℃冰箱保存备用，或于-20℃冰箱长期保存。

本发明的有益效果为：

通过上述技术方案，本发明通过从朱栾外果皮组织中提取dna，在对提取的dna进行pcr扩增后进行琼脂糖凝胶电泳检测，进而根据琼脂糖凝胶电泳中是否出现特异性阳性条带来鉴定其是否属于朱栾。本发明通过对比朱栾果实不同部位提取的基因组dna的浓度、纯度及pcr扩增特征，发现朱栾外果皮基因组dna可以特异性的将其与近源物种进行区分，而从中果皮、囊、内果皮提取的dna并不能将其与近源物种进行区分，这一发现对朱栾物种鉴定具有指导意义，在利用分子标记技术进行朱栾物种鉴定时，仅需要提取外果皮dna即可获得浓度和纯度高的dna，而在提取dna时如果对提取部位不加以区分，可能导致所提取的总dna浓度过低或纯度过低而对检测结果产生不良影响。本发明采用普通pcr检测方法，不仅可以鉴别朱栾与其近源物种，具有快速、简便、经济适用的特点，而且提供了一种朱栾外果皮基因组dna在其种质资源鉴定分析中的应用，所述的外果皮dna浓度和纯度较高，适用于应用分子标记技术进行种质资源鉴定分析。

附图说明

图1是朱栾果实不同部位提取的dna的电泳图。

图2是朱栾果实不同部位提取的dna的pcr扩增图。

图3是朱栾、香橼、胡柚果实外果皮dna的pcr扩增图。

图4是朱栾、香橼、胡柚果实内果皮dna的pcr扩增图。

具体实施方式

下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。

在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。若无特别指明，实施例采用的方法为本领域通用技术。

实施例中选用的朱栾、香橼、胡柚收集于嘉兴市药检所。

实施例1朱栾果实不同部位基因组dna的提取

(1)分别取朱栾果实的外果皮、中果皮、囊及内果皮组织约50mg，研磨至过120目筛的极细粉，装入ep管中；

(2)在ep管中加入0℃超纯水，置于0℃冰箱浸泡30小时，每隔10小时换一次水；12000rpm/min离心5min，用移液枪小心移去上清液，置于40℃烘箱中烘干；

(3)将缓冲液fp1和fp2置于37℃水浴中预热2min；

(4)在样品中加入1000μl缓冲液fp1和15ulrnasea(10mg/ml)，涡旋振荡1min，60℃水浴20min，每隔5min剧烈摇荡一次；

(5)加入325μl缓冲液fp2，充分混匀，涡旋振荡1min；

(6)12000rpm/min下离心5min，将上清液转至另一离心管中；

(7)向上清液中加入0.2倍体积的2.5mol/lnacl和0.7倍体积的异丙醇，充分混匀，于12000rpm/min离心2min，收集沉淀；

(8)沉淀中加入600μl70％乙醇进行洗涤，涡旋振荡5秒钟，于12000rpm/min离心2min，弃上清液，重复洗涤2-3次；

(9)将沉淀置于40℃烘箱，晾干残余乙醇；

(10)加入50μl灭菌蒸馏水或超纯水溶解dna，60℃水浴助溶，期间颠倒混匀数次，得到dna溶液，于4℃冰箱保存备用，或于-20℃冰箱长期保存。

上述步骤中，fp1由ph7.5的200mmol/ltris-hcl,25mmol/ledta,250mmol/lnacl和0.5％sds组成；fp2为氯仿。

实施例2朱栾果实不同部位基因组dna的浓度和纯度测定

取10μldna样品用超纯水稀释至60μl，以超纯水为空白对照，用紫外吸收法测定其浓度，并用1.2％琼脂糖凝胶电泳对所提取的dna进行检测。

表1朱栾果实不同部位基因组dna的浓度

从上表可以看出，朱栾果实不同部位提取的dna的浓度顺序为外果皮＞内果皮＞囊＞中果皮，dna提取液a260/a280顺序为外果皮＞内果皮＞囊＞中果皮，dna提取液a260/a230顺序为外果皮＞内果皮＝囊＞中果皮。外果皮所提取的dna的a260/a280接近1.80，说明所提取的dna样品比较纯，而中果皮、囊、内果皮的a260/a280远远低于1.80，因此难以对其进行准确定量，说明朱栾果实外果皮提取的dna质量最好，其浓度和纯度均比其他部位高。

图1是朱栾果实不同部位提取的dna的电泳图，其中，a～d泳道分别代表外果皮、中果皮、囊和内果皮。从图可以看出，外果皮的条带最清晰明亮，囊和内果皮的条带较为模糊，难以辨别，而中果皮无dna电泳条带出现，说明外果皮提取的dna质量最好，而中果皮、囊、内果皮提取的dna不宜用于pcr分析。

实施例3朱栾果实不同部位基因组dna的pcr反应

pcr扩增在bio-raddnaengine上进行，引物来源于fangdq和加拿大哥伦比亚大学公布的第9套序列(fangdq,rooseml.identificationofcloselyrelatedcitruscultivarswithinter-simplesequencerepeatmarkers.internationaljournalofplantbreedingresearch.1997,3(3):408-417.)，编号为aw90，序列为aaagtgtgtgtgtgtgtg，由上海生工合成。

反应总体积20μl，其中2.5ng/μl模板dna50ng，premixtag聚合酶10μl，10μmol/l引物1μl，蒸馏水补足至20μl。扩增程序为：94℃预变性4min，94℃变性30s，52℃退火45s，72℃延伸2min，共35个循环；72℃延伸7min，4℃保存。扩增产物在1.5％的琼脂糖凝胶﹙eb染色﹚上电泳，用凝胶成像仪拍照，分析。

图2是朱栾果实不同部位提取的dna的pcr扩增图，其中，a～d泳道分别代表外果皮、中果皮、囊和内果皮。可以看出，从外果皮所提取的dna的pcr产物清晰明亮，并且在2000bp具有阳性条带，而中果皮、囊和内果皮的pcr产物模糊不清，这进一步说明外果皮提取dna更适合朱栾分子鉴定的后续反应。

实施例4朱栾、香橼、胡柚果实外果皮dna的pcr反应

分别提取朱栾、香橼、胡柚果实外果皮基因组dna，以aw90为引物进行pcr反应，dna提取过程同实施例1所述，pcr反应体系及程序同实施例3所述。

图3是朱栾、香橼、胡柚果实外果皮基因组dna的pcr扩增图，其中，a～c泳道分别代表朱栾、香橼、胡柚。可以看出，从朱栾外果皮提取的dna的pcr产物清晰明亮，并且在2000bp具有特异性扩增的阳性条带，而从香橼、胡柚外果皮提取的dna的pcr产物模糊不清，在2000bp没有产生阳性条带，因此，以外果皮提取的基因组dna进行pcr扩增可以将朱栾与其近源物种香橼、胡柚进行区分。

实施例5朱栾、香橼、胡柚果实内果皮dna的pcr反应

分别提取朱栾、香橼、胡柚果实内果皮基因组dna，以aw90为引物进行pcr反应，dna提取过程同实施例1所述，pcr反应体系及程序同实施例3所述。

图4是朱栾、香橼、胡柚果实内果皮基因组dna的pcr扩增图，其中，a～c泳道分别代表朱栾、香橼、胡柚。可以看出，从朱栾和胡柚内果皮提取的dna的pcr产物模糊不清，在2000bp并没有出现阳性条带，从而香橼内果皮提取的dna的pcr产物清晰明亮，说明通过内果皮提取的基因组dna进行pcr扩增并不能将朱栾与其近源物种香橼、胡柚进行区分。

发明人以外果皮基因组dna为模板，改变引物aw90，即将aw90中的v和h所代表的碱基用c/g/t碱基进行替换，用改变后的引物进行扩增，达到了同样的技术效果，而利用中果皮、囊、内果皮基因组dna进行扩增，并不能有效区分朱栾、香橼和胡柚。

同时，发明人以外果皮基因组dna为模板，以fang等公布的其他引物，如利用编号为aw88、aw102、aw103和aw241的引物进行扩增，达到了同样的技术效果，而利用中果皮、囊、内果皮基因组dna进行扩增，并不能有效区分朱栾、香橼和胡柚，此处不再一一详细描述。

表2pcr扩增引物序列

上述序列表中，其中y＝c/t，h＝a/c/t，b＝c/g/t，v＝a/c/g，d＝a/g/t。

由上述可知，应用朱栾外果皮基因组dna进行pcr扩增，进而根据琼脂糖凝胶电泳检测pcr扩增产物是否在2000bp出现条带来鉴定其是否属于朱栾，不仅可以将其近源物种如香橼、胡柚进行区分，而且可以初步判定其是否可以归属于枳壳类物种；而应用中果皮、囊、内果皮基因组dna并不能有效的区分朱栾与其近源物种。基于本发明，在进行朱栾种质资源鉴定分析中，提取外果皮基因组dna可以简单、有效的对枳壳类物种中的朱栾进行物种鉴定。