重组鱼类干扰素的工程菌及其产物的制备方法与流程

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及重组鱼类干扰素的工程菌及其产物的制备方法。

背景技术

随着我国渔业生产的迅猛发展，养殖水产动物病害日益突出，病害发生已严重制约水产业健康可持续发展，鱼类抗病毒能为差的问题显现出来，尤其是人工饲养的试验用鱼类其抵抗力较野生型的更低，因此，鱼类免疫学逐渐受到学者和养殖户们的广泛关注。在养殖中发现的多发病如草鱼病毒病（草鱼出血病）、虹蹲病毒病（传染性膜腺坏死病、病毒性出血败血症和传染性造血组织坏死病）、鲤鱼病毒病（鲤春病毒血症、鲤痘疮病和鲤鳃坏死病等）、鳗鲡病毒病（鳗鲡花丛病病毒、鳗鲡弹状病毒和类疮疹病毒等）都是由病毒引起。水环境中存在大量细菌和病毒，与其他脊椎动物相比鱼类更依赖天然免疫防御的保护。此外，长期来，由于缺乏有效的病害防治方法，各种抗生素、杀虫剂广泛使用，造成养殖环境和水产品严重污染，水产食品安全受到严重威胁，同时抗生素产生的耐药性又加剧了水产动物病害的发生。因此，研制开发天然、安全、高效的水产动物病害防治制剂及其相关应用技术是一项十分紧迫的任务。水产养殖品种重要免疫抗病基因的开发利用是从根本上解决水产动物病害防治、保障水产食品安全的最有效途径之一，代表了当前发展绿色和环境友好型水产养殖模式的主要方向。

干扰素（interferon，ifn）是机体天然免疫中关键的因子之一，是机体细胞在病毒感染或者受核酸、细菌内毒素、促细胞分裂素等的作用下，由受体细胞分泌的一种具有高度生物学活性的糖蛋白，具有抗病毒、抗肿瘤、免疫调节等生物学功能。干扰素其本身无抗病毒作用并不直接灭活病毒，而是通过合成一系列抗病毒蛋白来干扰病毒的基因转录或病毒蛋白质的翻译。其作用机制为：首先，干扰素与细胞膜上的干扰素特异性受体结合，依赖这一信号途径，合成干扰素激活基因因子，使得细胞膜信号迅速传至细胞核，再与干扰素刺激反应元件结合，促进干扰素激活基因的表达，从而抑制某些病毒蛋白的合成以达到抗病毒目的。目前，在鱼类中发现2类干扰素：i型ifn，耐酸、耐热，类似于哺乳动物ifn-α/β，可以由病毒和双链rna（dsrna）诱导产生；ii型ifn，即ifn-γ，不耐酸、不耐热，可被有丝分裂原等诱导，由白细胞、t细胞或巨噬细胞产生。哺乳动物干扰素信号通路中的重要成员，如干扰素受体、jak-stat、irf和mx等在多种鱼中均被发现，提示鱼类干扰素具有与哺乳动物相似的作用机制。但目前对于鱼类干扰素在鱼类和水产动物病害防治中的应用研究还鲜见报道。由于鱼类在水体环境中生活，在导入方式上采用人类和畜禽中的注射方式很不方便。鉴于国内外大量运用酵母作为真核表达系统来生产干扰素，而酵母本身是优质的饲料蛋白源，因此通过酵母表达鱼类干扰素并制备成含干扰素的菌粉饲料添加剂是理想的选择。它可以大幅度降低生产成本，而且操作简便，具有实际应用性。

现有技术如授权公告号为cn103243106b的中国发明专利，公开了斜带石斑鱼干扰素ifnγ1基因及其编码的蛋白，以及该蛋白在制备一种新的免疫增强剂的应用。通过基因组数据库筛选以及设计特异引物扩增的方法，从斜带石斑鱼头肾总rna中克隆得到ifnγ1基因的开放读码框，其核苷酸序列如seqidno:2所示，所编码蛋白的氨基酸序列如seqidno:1所示。上述斜带石斑鱼干扰素ifnγ1蛋白经初步验证能够诱导相关免疫基因表达，可开发为天然鱼类免疫增强剂或免疫佐剂。但是利用大肠杆菌发酵法生产该蛋白的产量较低，且需要进行纯化。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种重组鱼类干扰素的工程菌及其产物的制备方法，工程菌能成功、高效表达出鱼干扰素重组蛋白，工程菌产物-重组鱼类干扰素的产量高，gcifn基因易于诱导表达且表达稳定性，不需要进行纯化即可应用。

本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：

酿酒酵母invsc1购于上海北诺生物科技有限公司。

重组鱼类干扰素的工程菌，该工程菌是具有重组鱼类干扰素基因ifn-pyes2的酿酒酵母菌株invsc1/pyes2-gcifn。该工程菌含有重组鱼类干扰素基因gcifn的重组质粒，成功表达出鱼干扰素重组蛋白，表达量达到酵母细胞总蛋白的20％以上，同时该工程菌是一种稳定的微生物，生存能力较强，本身不具备致病性，不产生有毒物质，广泛使用无潜在危险性，此外该工程菌遗传性状非常稳定，经实验室内连续传代10次，经pcr检测目的基因仍遗传稳定，经sds检测外源基因仍能稳定表达。

作为优选，重组鱼类干扰素的工程菌的构建方法具体包括以下步骤：

步骤1：向草鱼背鳍皮下注射0.5mlpolyi:c，26℃水温诱导12hr后再注射一次，12hr后取头肾、脾脏、脑、心肌、肝脏、鳃等组织10克左右，液氮快速冷冻，取冷冻完全的头肾和脾脏组织，置液氮碾磨成粉末状，用trizol提取总rna，然后用逆转录试剂盒将总rna进行逆转录成cdna模版，然后以此cdna为模板，设计上游引物ifn-f1：aaggaaatgggtggaaaatat及下游引物ifn-r1：ttgcgatgatgtccatcctc，进行pcr扩增，即得鱼干扰素基因gcifn片段，该基因gcifn的长度为543bp；

步骤2：利用限制性核酸内切酶hindiii和xhoi双酶切gcifn片段，获得两端具有相同黏性末端的gcifn片段，并将该gcifn片段重组入经xhoi酶切的pyes2载体中，构建重组质粒pyes2-gcifn，选取阳性克隆，上述pyes2大小为5857bp，其中包含氨苄青霉素抗性基因、gal1启动子控制下供外源基因插入的多克隆位点以及ura3基因，其中草鱼干扰素基因是目的片段，是pyes2质粒进行外源表达的主要基因，上述外源基因插在pyes2质粒的hindiii和xhoi酶切位点间，删除片段大小为82bp，系多克隆位点内的片段，对质粒扩增、筛选和外源基因的表达无影响，得到的pyes2-gcifn为双链闭环的dna质粒载体，可以在微生物中繁殖，用pcr和western-blot能够确定目的基因的存在，分析目的基因的表达情况；

步骤3：将鉴定后的阳性克隆质粒电转化导入酿酒酵母invsc1菌株中，获得酵母工程菌invsc1/pyes2-gcifn，上述酵母工程菌invsc1/pyes2-gcifn含有重组鱼类干扰素基因gcifn的重组质粒，成功表达出鱼干扰素重组蛋白，表达量达到酵母细胞总蛋白的20％以上，同时该工程菌是一种稳定的微生物，生存能力较强，本身不具备致病性，不产生有毒物质，广泛使用无潜在危险性，此外该工程菌遗传性状非常稳定，连续传代10次，经pcr检测目的基因仍遗传稳定，经sds检测外源基因仍能稳定表达。

进一步优选，步骤1中pcr为10×extaqbuffer5ul、dntpmixture(各2.5mm)4ul、takaraextaq(5u/ul)0.25ul、模板dna2.5ng、ifn-f1(20um)1ul、ifn-r1(20um)1ul、灭菌蒸馏水加至50ul，pcr反应参数为：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环，最后72℃终延伸8min。

为了优化技术方法，采取的措施还包括：启动子和终止子均来自酿酒酵母，其中gal1启动子长度为451bp，可以启动目的基因gcifn的转录，而终止子为cyc1基因的终止子，长度为239bp，用以终止目的基因的转录；标记基因为氨苄青霉素抗性基因，来源于大肠杆菌，大小为860bp，含有该抗性的质粒转化大肠杆菌后，易于进行阳性克隆挑选；报告基因为ura3基因，来源于酿酒酵母，大小为800bp。

重组鱼类干扰素的工程菌产物的制备方法，包括摇瓶培养、发酵罐培养、产物制备，其具体步骤为：

摇瓶培养：将活化后的酿酒酵母菌株invsc1/pyes2-gcifn接种至ypd种子培养基中，在温度为28-32℃、转速为200-300r/min的条件下培养10-14h得一级种培养物，然后将一级种培养物按8-12%（v/v）的接种量接种至发酵培养基中，在温度为28-32℃、转速为200-300r/min的条件下培养10-14h，即得二级种，备用，该步骤培养条件和发酵生产的培养条件相近，在细菌细胞培养时，可改善与培养基成分的接触和氧的供应，繁殖比较均一，而且效率也高，不会形成菌膜，也不会形成长菌丝所形成的小球，为发酵罐培养做准备；

发酵罐培养：将二级种按8-12%（v/v）的接种量接种到发酵罐中，在28-32℃的条件下培养至od600达到0.55-0.62，加入诱导终浓度为0.58-0.62mmol/l的iptg，然后在20-30℃、200-300rpm的条件下诱导培养3-5h，然后在4000-6000r/min的条件下离心15-25min收集菌体，蒸馏水洗净，即得酵母菌体，备用，该步骤可为菌种提供充足的营养物质和良好的生存繁殖条件，保证菌种的快速繁殖，得到酵母菌体，同时可诱导外源基因鱼干扰素重组蛋白的表达，使其表达量增高，产物稳定，易纯化；

产物制备：将酵母菌体经细胞破碎、低温干燥、粉碎后制得的粉剂制品即为工程菌产物，该产物不存在活的酵母菌，无致病性，不产生有毒物质，对环境安全性无影响，产物有效成分为表达的重组鱼类干扰素，在体内外具有显著的抗病毒活性，在草鱼cik细胞上的抗病毒（gchv）活性（log2cpei50/0.1ml）达到11.15±0.66以上，体内以注射或口服途径给予重组鱼类干扰素，对gchv的免疫保护率达到59.42%以上，重组鱼类干扰素通过诱导抗病毒蛋白mx表达而发挥抗病毒作用，同时它具有显著的免疫调节功能，能激活巨噬细胞吞噬杀菌，并促进t、b淋巴细胞增殖转化，可作为抗病饲料添加剂，对渔业病害防治中逐步替代抗生素、保证水产食品和养殖环境安全等具有重要意义。

作为优选，发酵培养基成分及其重量份为：蔗糖90-110份、酵母粉25-35份、蛋白胨4-6份、尿素13-16份、麦芽汁2-4份、天门冬氨酸0.12-0.2份、kh2po43-5份、k2hpo4·3h2o2-3份、mgso4·7h2o0.08-0.12份、znso4·7h2o0.002-0.003份、mnso4·4h2o0.01-0.015份、生物素0.003-0.005份。上述天门冬氨酸中含有0.32-0.42%的右旋天门冬氨酸，上述天门冬氨酸能够和培养基的其他成分起到协同作用，使得发酵培养基的ph能够得到控制，为工程菌invsc1/pyes2-gcifn提供最佳的生存环境，保证工程菌invsc1/pyes2-gcifn的快速繁殖，缩短进入到对数期的时长，提高重组鱼类干扰素的产量，同时可增强重组鱼类干扰素基因对诱导物iptg的敏感性，使重组鱼类干扰素基因易于诱导表达，降低诱导表达的时间，避免gcifn基因漂移现象，在工程菌中连续传代10代以上仍能检测到目的基因及其表达产物，提高gcifn基因的表达稳定性，上述发酵培养基各成分有相互协同作用，不仅能充分提供酵母工程菌invsc1/pyes2-gcifn发酵所需的碳源、氮源及各种生长因子，还能提高酵母工程菌invsc1/pyes2-gcifn的gcifn基因表达量，最终提高产物的产量，且产物不需要进行纯化即可应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：1）本发明从草鱼中克隆出干扰素基因gcifn，将其克隆入表达质粒pyes2，得到重组表达质粒pyes2-gcifn，再通过电转化法导入酿酒酵母（saccharomycescerevisiae）invsc1，成功表达出草鱼干扰素重组蛋白；2）本发明工程菌是一种稳定的微生物，成功表达出鱼干扰素重组蛋白，生存能力较强，本身不具备致病性，不产生有毒物质，广泛使用无潜在危险性，遗传性状非常稳定，连续传代10次外源基因仍能稳定表达；3）该工程菌发酵容易，工程菌产物-重组鱼类干扰素的产量高，gcifn基因的表达稳定性，不需要进行纯化即可应用，产物不存在活的酵母菌，无致病性，不产生有毒物质，对环境安全性无影响，在体内外具有显著的抗病毒活性，能激活巨噬细胞吞噬杀菌，并促进t、b淋巴细胞增殖转化，可作为抗病饲料添加剂，对渔业病害防治中逐步替代抗生素、保证水产食品和养殖环境安全等具有重要意义。

附图说明

图1是目的基因与基因工程菌构建的技术路线；

图2是诱导组rt-pcr产物电泳图（上部分为polyi:c诱导组；下部分为草鱼出血病病毒诱导组）；

图3是重组质粒pyes2-gcifn的构建图；

图4是目的基因的菌落pcr鉴定图；

图5是invsc1/pyes2-gcifn诱导表达的sds-page分析图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：

实施例1：

重组鱼类干扰素的工程菌，该工程菌是具有重组鱼类干扰素基因ifn-pyes2的酿酒酵母菌株invsc1/pyes2-gcifn。目的基因与基因工程菌构建的技术路线如图1所示，该工程菌含有重组鱼类干扰素基因gcifn的重组质粒，成功表达出鱼干扰素重组蛋白，表达量达到酵母细胞总蛋白的20％以上，同时该工程菌是一种稳定的微生物，生存能力较强，本身不具备致病性，不产生有毒物质，广泛使用无潜在危险性，此外该工程菌遗传性状非常稳定，经实验室内连续传代10次，经pcr检测目的基因仍遗传稳定，经sds检测外源基因仍能稳定表达。

上述重组鱼类干扰素的工程菌的构建方法具体包括以下步骤：

步骤1：向草鱼背鳍皮下注射0.5mlpolyi:c，26℃水温诱导12hr后再注射一次，12hr后取头肾、脾脏、脑、心肌、肝脏、鳃等组织10克左右，液氮快速冷冻，取冷冻完全的头肾和脾脏组织，置液氮碾磨成粉末状，用trizol提取总rna，然后用逆转录试剂盒将总rna进行逆转录成cdna模版，然后以此cdna为模板，设计上游引物ifn-f1：aaggaaatgggtggaaaatat及下游引物ifn-r1：ttgcgatgatgtccatcctc，进行pcr扩增，即得鱼干扰素基因gcifn片段，对提取的模板做rt-pcr，结果如图2，从草鱼的6个成体组织包括脑、心肌、头肾、肝脏、脾脏、肠提取总rna，通过rt-pcr以初步探讨草鱼的干扰素同源基因gcifn在这些组织中的表达情况，对照组各种组织内均未见gcifn表达，在两个诱导组中，除病毒组的脾脏见微量表达外，其余的均有较明显表达，且脑与心肌组织中呈强表达，经草鱼出血病病毒诱导后，gcifn在头肾和鳃组织都有较强表达，经polyi:c诱导的草鱼头肾、肝脏，鳃，gcifn也有较强表达，相比较而言，polyi:c为草鱼干扰素的良好诱导剂，且该基因gcifn的长度为543bp；

步骤2：重组质粒pyes2-nkef的构建如图3所示，利用限制性核酸内切酶hindiii和xhoi双酶切gcifn片段，获得两端具有相同黏性末端的gcifn片段，并将该gcifn片段重组入经xhoi酶切的pyes2载体中，转化大肠杆菌top10，菌落pcr检测筛选阳性菌落，选取阳性克隆，用碱裂解法提取重组表达质粒，进行测序鉴定，以初步筛选出的重组子质粒做模板，进行pcr检测，检测结果如图4所示，结果显示在插入gcifn基因后，质粒pyes2-gcifn出现750bp的条带，证明得到插入方向正确的重组表达质粒，含完整的gcifn基因，上述pyes2大小为5857bp，其中包含氨苄青霉素抗性基因、gal1启动子控制下供外源基因插入的多克隆位点以及ura3基因，其中草鱼干扰素基因是目的片段，是pyes2质粒进行外源表达的主要基因，上述外源基因插在pyes2质粒的hindiii和xhoi酶切位点间，删除片段大小为82bp，系多克隆位点内的片段，对质粒扩增、筛选和外源基因的表达无影响，得到的pyes2-gcifn为双链闭环的dna质粒载体，可以在微生物中繁殖，用pcr和western-blot能够确定目的基因的存在，分析目的基因的表达情况；

步骤3：碱裂解法提取少量重组质粒pyes2-gcifn，同时制备酿酒酵母感受态细胞，用电脉冲转化方法将重组质粒转入酿酒酵母，方法如下：将40μl酵母悬浮液与5μl质粒dna混合于预冷的电转化杯（0.2cm），轻摇后冰浴5min；脉冲参数：v=1.5kv，25μf，200ohms，4-5ms；电转化后立刻加1ml预冷的1mol/l山梨醇，涂布sc-u筛选平板上（200μl每平板），30℃培养，直至单个菌落出现，将获得的酵母重组子经菌落pcr检测，筛选长度正确的阳性克隆子，然后提取酵母质粒dna，重新转化大肠杆菌top10，扩增质粒后用ecori和xhoi双酶切检验，获得酵母工程菌invsc1/pyes2-gcifn，上述酵母工程菌invsc1/pyes2-gcifn含有重组鱼类干扰素基因gcifn的重组质粒，成功表达出鱼干扰素重组蛋白，表达量达到酵母细胞总蛋白的20％以上，同时该工程菌是一种稳定的微生物，生存能力较强，本身不具备致病性，不产生有毒物质，广泛使用无潜在危险性，此外该工程菌遗传性状非常稳定，连续传代10次，经pcr检测目的基因仍遗传稳定，经sds检测外源基因仍能稳定表达。

上述步骤1中pcr为10×extaqbuffer5ul、dntpmixture(各2.5mm)4ul、takaraextaq(5u/ul)0.25ul、模板dna2.5ng、ifn-f1(20um)1ul、ifn-r1(20um)1ul、灭菌蒸馏水加至50ul，pcr反应参数为：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环，最后72℃终延伸8min。

上述启动子和终止子均来自酿酒酵母，其中gal1启动子长度为451bp，可以启动目的基因gcifn的转录，而终止子为cyc1基因的终止子，长度为239bp，用以终止目的基因的转录；标记基因为氨苄青霉素抗性基因，来源于大肠杆菌，大小为860bp，含有该抗性的质粒转化大肠杆菌后，易于进行阳性克隆挑选；报告基因为ura3基因，来源于酿酒酵母，大小为800bp。

重组鱼类干扰素的工程菌产物的制备方法，包括摇瓶培养、发酵罐培养、产物制备，其具体步骤为：

1）摇瓶培养：将活化后的酿酒酵母菌株invsc1/pyes2-gcifn接种至ypd种子培养基中，在温度为28℃、转速为300r/min的条件下培养10h得一级种培养物，然后将一级种培养物按12%（v/v）的接种量接种至发酵培养基中，在温度为28℃、转速为300r/min的条件下培养10h，即得二级种，备用，该步骤培养条件和发酵生产的培养条件相近，在细菌细胞培养时，可改善与培养基成分的接触和氧的供应，繁殖比较均一，而且效率也高，不会形成菌膜，也不会形成长菌丝所形成的小球，为发酵罐培养做准备；

2）发酵罐培养：将二级种按12%（v/v）的接种量接种到发酵罐中，在28℃的条件下培养至od600达到0.6，加入诱导终浓度为0.6mmol/l的iptg，25℃、250rpm诱导培养8h，然后在4000r/min的条件下离心25min收集菌体，蒸馏水洗净，即得酵母菌体，备用，该步骤可为菌种提供充足的营养物质和良好的生存繁殖条件，保证菌种的快速繁殖，得到酵母菌体，同时可诱导外源基因鱼干扰素重组蛋白的表达，使其表达量增高，产物稳定，易纯化；

3）产物制备：将酵母菌体用蒸馏水清洗3遍后制成悬浮液，置于100℃水浴中处理15min，4℃冰浴冷却，进行超声破碎，超声破碎条件为：超声破碎功率450w，破碎时间20min，时间间隔（工作时间:间歇时间）为10:8（s/s），超声破碎后的酵母悬浮液经25-30℃气流干燥，制成酵母粉，封装入铝箔袋中，冷藏贮运，即为工程菌产物，该产物不存在活的酵母菌，无致病性，不产生有毒物质，对环境安全性无影响，产物有效成分为表达的重组鱼类干扰素，在体内外具有显著的抗病毒活性，在草鱼cik细胞上的抗病毒（gchv）活性（log2cpei50/0.1ml）达到11.15±0.66以上，体内以注射或口服途径给予重组鱼类干扰素，对gchv的免疫保护率达到59.42%以上，重组鱼类干扰素通过诱导抗病毒蛋白mx表达而发挥抗病毒作用，同时它具有显著的免疫调节功能，能激活巨噬细胞吞噬杀菌，并促进t、b淋巴细胞增殖转化，可作为抗病饲料添加剂，对渔业病害防治中逐步替代抗生素、保证水产食品和养殖环境安全等具有重要意义。

上述发酵培养基成分及其重量份为：蔗糖90份、酵母粉35份、蛋白胨4份、尿素16份、麦芽汁2份、天门冬氨酸0.2份、kh2po43份、k2hpo4·3h2o3份、mgso4·7h2o0.08份、znso4·7h2o0.003份、mnso4·4h2o0.01份、生物素0.005份。上述天门冬氨酸中含有0.32%的右旋天门冬氨酸，上述天门冬氨酸能够和培养基的其他成分起到协同作用，使得发酵培养基的ph能够得到控制，为工程菌invsc1/pyes2-gcifn提供最佳的生存环境，保证工程菌invsc1/pyes2-gcifn的快速繁殖，缩短进入到对数期的时长，提高重组鱼类干扰素的产量，同时可增强重组鱼类干扰素基因对诱导物iptg的敏感性，使重组鱼类干扰素基因易于诱导表达，降低诱导表达的时间，避免gcifn基因漂移现象，在工程菌中连续传代10代以上仍能检测到目的基因及其表达产物，提高gcifn基因的表达稳定性，上述发酵培养基各成分有相互协同作用，不仅能充分提供酵母工程菌invsc1/pyes2-gcifn发酵所需的碳源、氮源及各种生长因子，还能提高酵母工程菌invsc1/pyes2-gcifn的gcifn基因表达量，最终提高产物的产量，且产物不需要进行纯化即可应用。

实施例2：

重组酵母的诱导表达及鉴定

挑取单菌落重组子接种于含2%半乳糖的15mlsc-u培养基中，30℃振荡培养过夜；以初始od值达到0.6，计算在50ml诱导培养基中加入过夜培养物的量，30℃振荡培养。在0、4、6、12、18、24、30h收集细胞，用500µl裂解液（biodev-tech，db001-12）重悬细胞，4℃1500g离心5min，收集细胞，用裂解液重悬细胞，将od600值调到50，加入等体积玻璃珠（sigmag-8772）振荡30s，冰浴30s，重复4次裂解细胞，高速离心10min，取上清，加入sds-page样品缓冲液，煮沸5min，取20µl溶菌液加样，进行sds-page电泳，鉴定重组表达ifn蛋白条带，并用薄层色谱仪于630nm波长扫描，测定重组蛋白条带吸收峰面积，计算相对表大量可达30%以上。如图5所示。从电泳图来看，invsc1/pyes2-gcifn菌株在分子量38kda的位置有一明显的蛋白条带，而invsc1/pyes2菌株没有，因此确定该蛋白即为酵母所表达出的草鱼干扰素蛋白。通过诱导表达实验，我们发现在发酵一开始，由于初始细胞密度较高，草鱼干扰素的表达量在7h左右就可以达到峰值，此后随着时间的增加，如38h检测发现表达量不再显著增加。此外，添加20%甘油，能明显提高草鱼干扰素的表达。

实施例3：

重组鱼类干扰素的工程菌，该工程菌是具有重组鱼类干扰素基因ifn-pyes2的酿酒酵母菌株invsc1/pyes2-gcifn。

上述重组鱼类干扰素的工程菌的构建方法具体包括以下步骤：

步骤1：向草鱼背鳍皮下注射0.5mlpolyi:c，26℃水温诱导12hr后再注射一次，12hr后取头肾、脾脏、脑、心肌、肝脏、鳃等组织10克左右，液氮快速冷冻，取冷冻完全的头肾和脾脏组织，置液氮碾磨成粉末状，用trizol提取总rna，然后用逆转录试剂盒将总rna进行逆转录成cdna模版，然后以此cdna为模板，设计上游引物ifn-f1：aaggaaatgggtggaaaatat及下游引物ifn-r1：ttgcgatgatgtccatcctc，进行pcr扩增，即得鱼干扰素基因gcifn片段，该基因gcifn的长度为543bp；

步骤2：利用限制性核酸内切酶hindiii和xhoi双酶切gcifn片段，获得两端具有相同黏性末端的gcifn片段，并将该gcifn片段重组入经xhoi酶切的pyes2载体中，构建重组质粒pyes2-gcifn，选取阳性克隆，上述pyes2大小为5857bp，其中包含氨苄青霉素抗性基因、gal1启动子控制下供外源基因插入的多克隆位点以及ura3基因，其中草鱼干扰素基因是目的片段，是pyes2质粒进行外源表达的主要基因，上述外源基因插在pyes2质粒的hindiii和xhoi酶切位点间，删除片段大小为82bp；

步骤3：将鉴定后的阳性克隆质粒电转化导入酿酒酵母invsc1菌株中，获得酵母工程菌invsc1/pyes2-gcifn。

上述步骤1中pcr为10×extaqbuffer5ul、dntpmixture(各2.5mm)4ul、takaraextaq(5u/ul)0.25ul、模板dna2.5ng、ifn-f1(20um)1ul、ifn-r1(20um)1ul、灭菌蒸馏水加至50ul，pcr反应参数为：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环，最后72℃终延伸8min。

上述启动子和终止子均来自酿酒酵母，其中gal1启动子长度为451bp，可以启动目的基因gcifn的转录，而终止子为cyc1基因的终止子，长度为239bp，用以终止目的基因的转录；标记基因为氨苄青霉素抗性基因，来源于大肠杆菌，大小为860bp，含有该抗性的质粒转化大肠杆菌后，易于进行阳性克隆挑选；报告基因为ura3基因，来源于酿酒酵母，大小为800bp。

重组鱼类干扰素的工程菌产物的制备方法，包括摇瓶培养、发酵罐培养、产物制备，其具体步骤为：

1）摇瓶培养：将活化后的酿酒酵母菌株invsc1/pyes2-gcifn接种至ypd种子培养基中，在温度为30℃、转速为260r/min的条件下培养12h得一级种培养物，然后将一级种培养物按10%（v/v）的接种量接种至发酵培养基中，在温度为30℃、转速为260r/min的条件下培养12h，即得二级种，备用；

2）发酵罐培养：将二级种按10%（v/v）的接种量接种到发酵罐中，在30℃的条件下培养至od600达到0.6，加入诱导终浓度为0.6mmol/l的iptg，25℃、250rpm诱导培养7h，然后在5000r/min的条件下离心20min收集菌体，蒸馏水洗净，即得酵母菌体，备用；

3）产物制备：将酵母菌体经细胞破碎、低温干燥、粉碎后制得的粉剂制品即为工程菌产物。

上述发酵培养基成分及其重量份为：蔗糖100份、酵母粉30份、蛋白胨5份、尿素15份、麦芽汁3份、天门冬氨酸0.15份、kh2po44份、k2hpo4·3h2o2.5份、mgso4·7h2o0.1份、znso4·7h2o0.0026份、mnso4·4h2o0.012份、生物素0.004份。上述天门冬氨酸中含有0.38%的右旋天门冬氨酸。

重组鱼类干扰素在酵母细胞中的表达量达到27.1%，活性达到112u/mg蛋白。

实施例4：

重组鱼类干扰素的工程菌的构建方法，进一步优化步骤为：

步骤1：向草鱼背鳍皮下注射0.5mlpolyi:c，26℃水温诱导12hr后再注射一次，12hr后取头肾、脾脏、脑、心肌、肝脏、鳃等组织10克左右，液氮快速冷冻，取冷冻完全的头肾和脾脏组织，置液氮碾磨成粉末状，用trizol提取总rna，然后用逆转录试剂盒将总rna进行逆转录成cdna模版，然后以此cdna为模板，设计上游引物ifn-f1：aaggaaatgggtggaaaatat及下游引物ifn-r1：ttgcgatgatgtccatcctc，进行pcr扩增，即得鱼干扰素基因gcifn片段，该基因gcifn的长度为543bp；

步骤2：利用限制性核酸内切酶hindiii和xhoi双酶切gcifn片段，获得两端具有相同黏性末端的gcifn片段，并将该gcifn片段重组入经xhoi酶切的pyes2载体中，构建重组质粒pyes2-gcifn，选取阳性克隆，上述pyes2大小为5857bp，其中包含氨苄青霉素抗性基因、gal1启动子控制下供外源基因插入的多克隆位点以及ura3基因，其中草鱼干扰素基因是目的片段，是pyes2质粒进行外源表达的主要基因，上述外源基因插在pyes2质粒的hindiii和xhoi酶切位点间，删除片段大小为82bp；

步骤3：将鉴定后的阳性克隆质粒电转化导入酿酒酵母invsc1菌株中，获得酵母工程菌invsc1/pyes2-gcifn。

上述步骤1中pcr为10×extaqbuffer5ul、dntpmixture(各2.5mm)4ul、takaraextaq(5u/ul)0.25ul、模板dna2.5ng、ifn-f1(20um)1ul、ifn-r1(20um)1ul、n,n-二甲基乙酰胺0.01ul、脂肪酸二乙醇酰胺0.003ul、灭菌蒸馏水加至50ul，pcr反应参数为：94℃预变性5min，94℃变性15s，58℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环，最后72℃终延伸8min。该pcr反应体系中n,n-二甲基乙酰胺和脂肪酸二乙醇酰胺的特殊存在能够破坏dna分子内碱基对之间的氢键，缩短dna序列的变性时间，降低对酶活性的损害，最大限度地激活taqdna聚合酶的催化活性，进而提高聚合酶的延伸速率，从而有效扩增dna片段，同时能够避免序列内有较长的回文结构，使引物自身不能形成发夹结构，避免非特异扩增，提高pcr扩增产物的得率和稳定性，进而保证工程菌能成功、高效表达出鱼干扰素重组蛋白。

上述启动子和终止子均来自酿酒酵母，其中gal1启动子长度为451bp，可以启动目的基因gcifn的转录，而终止子为cyc1基因的终止子，长度为239bp，用以终止目的基因的转录；标记基因为氨苄青霉素抗性基因，来源于大肠杆菌，大小为860bp，含有该抗性的质粒转化大肠杆菌后，易于进行阳性克隆挑选；报告基因为ura3基因，来源于酿酒酵母，大小为800bp。

重组鱼类干扰素在酵母细胞中的表达量达到28.9%，活性达到123u/mg蛋白。

实施例5：

重组鱼类干扰素的工程菌产物的制备用发酵培养基成分及其重量份为：蔗糖100份、酵母粉30份、蛋白胨5份、尿素15份、麦芽汁3份、kh2po44份、k2hpo4·3h2o2.5份、mgso4·7h2o0.1份、znso4·7h2o0.0026份、mnso4·4h2o0.012份、生物素0.004份。其余步骤及方法和实施例3一致。

重组鱼类干扰素在酵母细胞中的表达量达到20.7%，活性达到93u/mg蛋白。

重组鱼类干扰素在酵母细胞中的表达量达到28.9%，活性达到93u/mg蛋白。

由实施例3和实施例5可知，发酵培养基中天门冬氨酸的加入能够提高重组重组鱼类干扰素的表达量和产量；由实施例3和实施例4可知，pcr反应体系中n,n-二甲基乙酰胺和脂肪酸二乙醇酰胺的特殊存在能够提高重组鱼类干扰素的表达量和产量。

实施例6：

重组草鱼干扰素酵母粉对鲫鱼的免疫保护

试验材料

试验草鱼购自浙江省淡水水产研究所，规格为12.5±2.8g/尾；试验鲫鱼购自浙江省湖州市锦山鱼种场，规格21.2±5.3g/尾。材料鱼在23±1℃的水池中暂养5天后，进行急性毒性试验。

重组草鱼干扰素酵母粉为实施例3工程菌产物。

试验方法

将适养两周的健康鲫鱼随机分为4组，3组为试验组，1组为对照组，每组80尾。试验组按体重的2%投喂给受试鲫鱼，我们每天给鲫鱼投喂饲料的质量是鲫鱼总体重2%，而且使鲫鱼每克鱼体重摄入的重组草鱼干扰素酵母粉的质量为3000mg/kg鱼体重，每天投喂一次，连续投喂4天。对照组投喂相同重量的饲料。

polyi:c攻毒试验

鲫鱼连续投喂4天后，每尾草鱼均行腹腔注射100μlpolyi:c(500μg/ml)模拟人工染毒。每24h至少观察三次，记录死亡数，进行96h观察记录，计算相对免疫保护率，rps=（1-免疫组死亡率/对照组死亡率）×100%，结果如表1所示。

表1重组鱼类干扰素酵母粉对鲫鱼的免疫保护结果

表1重组鱼类干扰素酵母粉对鲫鱼的免疫保护结果

由表1可知，试验组组鲫鱼的死亡率远远低于对照组，平均成活率提高55.42%，相对免疫保护率rps达65.20%，表明饲喂实施例3工程菌产物在增强鲫鱼对抗polyi:c病毒中确实起到了保护作用。

实施例7：

工程菌产物在草鱼养殖中的应用

试验在6-9月份进行，将养殖草鱼网箱分成6组，3组网箱为试验组，3组为对照组，试验组使用含实施例3工程菌产物的饲料（每公斤饲料添加含工程菌产物50mg）投喂，对照组投喂等量空白饲料，连续投喂8周，统计自然发病死亡率，计算相对免疫保护率，结果如表2所示；

表2工程菌产物在草鱼养殖中的应用试验结果

由表2可知，试验组组草鱼的病害发生率显著下降，平均成活率提高28.64%，相对免疫保护率rps达86.28%，表明饲喂实施例3工程菌产物能增强草鱼的免疫力和防病抗病能力，最终提高草鱼的成活率。

实施例8：

工程菌产物在鲈鱼养殖中的应用

试验在6-9月份进行，将养殖草鱼网箱分成6组，3组网箱为试验组，3组为对照组，试验组使用含实施例3工程菌产物的饲料（每公斤饲料添加含工程菌产物50mg）投喂，对照组投喂等量空白饲料，连续投喂8周，统计自然发病死亡率，计算相对免疫保护率，结果如表3所示；

表3工程菌产物在鲈鱼养殖中的应用试验结果

由表3可知，试验组组鲈鱼的病害发生率显著下降，平均成活率提高27.33%，相对免疫保护率rps达87.33%，表明饲喂实施例3工程菌产物能增强鲈鱼的免疫力和防病抗病能力，最终提高鲈鱼的成活率。

实施例9：

工程菌产物在虾类养殖中的应用

试验在6-9月份进行，将养殖中国对虾网箱分成6组，3组网箱为试验组，3组为对照组，试验组使用含实施例3工程菌产物的饲料（每公斤饲料添加含工程菌产物35mg）投喂，对照组投喂等量空白饲料，连续投喂8周，统计自然发病死亡率，计算相对免疫保护率，结果如表4所示；

表4工程菌产物在中国对虾养殖中的应用试验结果

由表4可知，试验组组中国对虾的病害发生率显著下降，平均成活率提高12.50%，相对免疫保护率rps达39.16%，表明饲喂实施例3工程菌产物能增强中国对虾的免疫力和防病抗病能力，最终提高中国对虾的成活率。

本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。

以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。