本发明涉及生物细胞学领域，特别涉及一种罗非鱼脑细胞系及其应用。
背景技术
罗非鱼是世界第二大水产养殖品种，具有杂食性，对高密度养殖方式也具有超强耐受性。这种价格低廉、品质优良的鱼类已成为发展中国家人们重要的食物来源。联合国粮食及农业组织(fao)数据显示，2015年，全球罗非鱼养殖和捕捞产量达到640万吨，价值约98亿美元，全球贸易额达到18亿美元。目前，中国、印尼和埃及是罗非鱼的三大主要生产国。其中，中国是罗非鱼的养殖大国，养殖产量约占世界总产量的50％，主要集中在广东、广西、海南和福建等地。
与其他鱼类比较，罗非鱼曾经以易养殖和抗病力强著称。然而，从2009年开始，以色列、厄瓜多尔、埃及、泰国等国家先后暴发了罗非鱼湖病毒(tilapialakevirus，tilv)感染引起的传染病，导致大批野生和养殖罗非鱼死亡，造成严重的经济损失。
罗非鱼湖病毒病又称为罗非鱼合胞体肝炎(syncyticalhepatitisoftilapia，sht)，病原tilv为近年来新发现的病毒，其分类地位尚未被确认。根据其生物学特性，目前tilv被归类为正粘病毒科(orthomyxoviridae)的一种新的病毒。电子显微镜显示病毒粒子为具包膜的二十面体结构，大小为55～75nm。
tilv是近年来出现的急性传染性病原。国外已经在病毒的细胞培养、组织病理学、pcr、原位杂交等检测技术方面进行了研究，并建立了相应的检测方法。世界卫生组织(oie)推荐检测水产动物病毒的“黄金标准”是通过细胞来分离病毒。2014年，marinaeyngo等将发生病变的病鱼器官匀浆，经0.22μm滤膜过滤后，分别与8种不同的细胞系(罗非鱼原代脑细胞、e-11、chse-214、bf-2、bb、epc、kf-1、rtg-2和fhm)进行共孵育，发现该病毒能引起罗非鱼原代脑细胞和e-11细胞系(乌鳢成纤维细胞系)的细胞病变效应(cpe)，分别在共孵育后10-12d、5-7d后出现明显的cpe现象。前者表现为细胞由细长变肿胀、变圆，有颗粒形成，后者表现为胞浆空泡、蚀斑形成。tsofack研究表明，tilv可以在e-11、罗非鱼脑细胞原代细胞、omb和tmb等细胞系进行培养，其中e-11细胞被认为是最合适的细胞系。omb和tmb细胞对tilv的感染滴度低于e-11，敏感性也不如e-11。然而，e-11细胞是来源于乌鳢的成纤维细胞，非罗非鱼的本源细胞，长期使用该细胞进行tilv的增殖，易使病毒致弱，不利于tilv的纯化及疫苗的研发工作。源于罗非鱼的细胞更有利于tilv的纯化增殖及疫苗的研发。
国内针对tilv的研究几乎是空白。很多罗非鱼疫病的病因未能彻底调查，无法明确tilv在我国的感染情况，其中很大一个阻碍因素就是国内目前没有源于罗非鱼的对罗湖病毒的敏感细胞系，无法进行病毒的扩增纯化，无法为罗湖病毒的分离鉴定、诊断及疫苗的研发提供物质基础。
技术实现要素：
本发明的目的在于公开一种罗非鱼脑细胞系的制备方法及其应用。
本发明所采取的技术方案是：
一种罗非鱼脑细胞系的构建方法，其步骤是：取鲜活罗非鱼消毒取脑组织，剪碎块，用胶原酶处理后，加入胰蛋白酶；用含培养液充分悬浮，进行原代培养；细胞长满瓶底时，用胰酶-edta消化，接种传代培养；传代培养60代后，于对数生长期加入秋水仙素处理并进行核型分析。
优选的，培养液为含有20％胎牛血清、20ng/l碱性成纤维样生长因子、1ng/ml的表皮生长因子、100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素、0.25μg/ml两性霉素b，ph值为7.2-7.4的m199培养液。
优选的，胶原酶处理的方法是：用ⅰ型胶原酶，37℃下消化30分钟。
优选的，加入的胰蛋白酶浓度为0.25％。
优选的，原代培养的方法是：用细胞培养液悬浮细胞，于27℃培养；脑细胞迁出后，每隔3～5天换液一次，去除未贴壁的组织和死细胞。
优选的，原代培养的方法是：当细胞长满培养瓶底时，用吸管除去旧培养液，pbs洗两次，用0.25％胰酶-edta将细胞消化至细胞变圆时，吸弃胰酶，加入新鲜培养液终止消化；用吸管轻吹后收集悬浮细胞，以1：2或1：3的比率接种于培养瓶内，加入培养液，放入27℃培养箱中进行传代培养。
优选的呢，秋水仙素处理的方法是：于对数生长期加入终浓度为20μg/ml的秋水仙素，27℃处理4h后收集细胞。
一种罗非鱼脑细胞系，其名称为罗非鱼脑细胞tibc，已保藏于中国典型培养物保藏中心cctcc，保藏编号为cctccno:c201829。
上述罗非鱼脑细胞tibc在培养罗非鱼湖病毒病中的应用。
本发明罗非鱼脑细胞tibc于2018年1月12日保藏于中国典型培养物保藏中心cctcc，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏中心于2018年1月12日收到申请人提供的细胞。保藏中心给予该培养物的保藏号为cctccno:c201829，提议的分类学名称为罗非鱼脑细胞tibc，已于2018年1月18日鉴定保藏的细胞是存活的。
本发明的有益效果是：首次公开了罗非鱼脑细胞系的制备方法，该制备方法简单方便。并且用该方法制备的罗非鱼脑细胞系(罗非鱼脑细胞tibc)，可以进行长时间的传代培养，对罗非鱼出血病病毒非常敏感，可以广泛应用于实验中。
附图说明
图1是罗非鱼脑细胞形态观察。
图2是罗非鱼脑细胞最佳培养条件的确定。
图3是感染tilv病毒的罗非鱼脑细胞图。
图4是第5代和第60代罗非鱼脑细胞染色体分析图。
图5是第5代细胞dna直方图。
图6是tilv接种罗非鱼脑细胞的tcid50测定。
具体实施方式
实施例1一种罗非鱼脑细胞系的构建方法
将上述本发明的方法按照细致步骤进行详述如下：
1.罗非鱼脑组织的制备：
鲜活罗非鱼于75％酒精中浸泡1～2min，置于超净台中无菌取下脑组织，用pbs漂洗2遍后，置于5ml的无菌青霉素小瓶中(含5％胎牛血清的m199培养液)，用手术剪将其剪成约1mm3碎块，加入5mlpbs收集至15ml离心管，1000rpm离心3分钟，离心收集组织块后弃去上清，重复一次。加入组织块约5倍体积的ⅰ型胶原酶，37℃下消化30分钟，去掉消化液，pbs洗两次，再加入0.25％胰蛋白酶，室温消化6-7min，加入培养液终止消化，用200目尼龙纱网过滤至新的一次性培养皿中，加入5ml细胞培养液冲洗纱网再过滤一次，将滤过液收集至15ml离心管中，离心去上清，收集细胞。纱网上的组织块可以再重复消化，过滤。用含20％fbs的m199培养液充分悬浮细胞，均匀接种于25cm2的培养瓶中，培养条件为27℃。
2.罗非鱼脑细胞培养液的配制：
完全培养基配方为所述的培养基配方为含有20％胎牛血清、20ng/l碱性成纤维样生长因子(bfgf)、1ng/ml的表皮生长因子(egf)、100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素、0.25μg/ml两性霉素b，ph值为7.2-7.4的m199培养液。
3.罗非鱼脑细胞原代培养的启动：
用细胞培养液悬浮细胞，于27℃培养；脑细胞迁出后，每隔3～5天换液一次，以去除未贴壁的组织和死细胞；细胞在完全培养液中生长状态良好，增殖明显。
4.罗非鱼脑细胞的传代培养：
当细胞长满培养瓶底时，用吸管除去旧培养液，pbs洗两次，用0.25％胰酶-edta将细胞消化至细胞变圆时，吸弃胰酶，加入新鲜培养基终止消化。用吸管轻吹后收集悬浮细胞，以1：2的比率接种于培养瓶内，加入完全培养液至5ml/瓶，放入27℃培养箱中进行传代培养；待罗非鱼脑细胞再次长成单层时，仍以上述相同方法传代培养。现已传至60代，传代比率为1：2或1：3。
5.细胞的冻存与复苏
1)、用胰酶消化法收集1瓶处于对数生长期、细胞密度90％以上的罗非鱼脑细胞，1000g离心5min后弃去上清，用1ml冻存保护液(含20％fbs和10％dmso的m199培养液)将细胞重悬后置于冻存管中，将冻存管置于程序降温盒中于-70℃过夜，最后投入液氮(-196℃)中长期保存，并做好记录。
2)、细胞的复苏：自液氮中取出保存的冻存管，迅速置于40℃水浴中融化，1000g离心5min，弃掉上清液，加入培养液5ml清洗细胞，1000r/min离心5min，以除去残留的冻存保护液。收集细胞后接种于25cm2的培养瓶中，放入27℃，5％co2培养箱中进行培养，培养24h后更换培养液，继续培养。
实施例2罗非鱼脑细胞的培养条件研究
1罗非鱼脑细胞最佳培养基的确定
选择dmem、m199、mem、l-15四种细胞培养基，并添加终浓度为10％的fbs制备细胞培养液。调整细胞密度为4×105ml-1，四种培养基各按2.5ml/孔的量接种于6孔板，于27℃的培养箱中培养。每1d从每个实验组里取出3孔细胞，用trypsin-edta消化法收集细胞并计数，共培养7d，连续计数7次，绘制其生长曲线。确定其最适培养基为m199或l-15培养基(图2a)。
2罗非鱼脑细胞最适血清浓度的确定
分别配制fbs浓度为5％、10％、15％、20％的培养液，调整细胞密度为4×105ml-1，四种血清浓度培养基各按2.5ml/孔的量接种于6孔板，于27℃的培养箱中培养。每1d从每个实验组里取出3孔细胞，用trypsin-edta消化法收集细胞并计数，共培养7d，连续计数7次，绘制其生长曲线，发现fbs浓度为10％～20％均适合罗非鱼脑细胞的培养(图2b)。
3罗非鱼脑细胞最适培养温度的确定
选择15℃、22℃、27℃、32℃四个不同培养温度，使用添加10％fbs的dmem培养液，调整细胞密度为4×105ml-1，细胞悬液按2.5ml/孔的量接种于6孔板并置于于四个不同培养温度培养箱里。每1d从每个实验组里取出3孔细胞，用trypsin-edta消化法收集细胞并计数，共培养7d，连续计数7次，绘制其生长曲线，发现22℃、27℃均适合罗非鱼脑细胞的培养(图2c)。
实施例3罗非鱼脑细胞染色体测定
第5代和60代罗非鱼脑细胞于对数生长期加入终浓度为20μg/ml的秋水仙素，27℃处理4h后收集细胞，用0.075mol/l的kcl低渗处理25min，加入1ml预冷的卡诺固定液，1000r/min离心5min去上清后，用预冷的卡诺固定液固定3次，每次15min。冷滴片法滴片，干燥后，用5％的giemsa染色25min。镜检，分别选择100个分裂相进行核型分析和统计。结果显示(图4)，第5代的罗非鱼脑细胞60％的染色体为2n＝44；第60代的罗非鱼脑细胞43％的染色体为2n＝50。这预示该细胞为永久细胞系，可以无限增殖。
取第5代和60代罗非鱼脑细胞，消化成细胞悬液，保证细胞浓度在106个/ml，加入冷的70％的酒精4℃固定约一个小时，pi染色30min，然后用40-50um的滤膜过滤后，上机检测，流速控制在100～200个细胞/s，每个样本检测3次。22mw激光，激发波长488nm，接收波长为620nm。比较第5代和60代罗非鱼脑细胞的2倍体峰相对位置(图5)，dna含量差异。第5代脑细胞的2倍体峰值主要出现在200，第60代脑细胞的2倍体峰值出现在300。
实施例3罗非鱼脑细胞对罗非鱼出血病病毒(tilv)的敏感性：
以第60代罗非鱼脑细胞为对象，检测罗非鱼出血病病毒(tilv)对该细胞的敏感程度。细胞接种24小时后，将病毒溶液加入细胞培养瓶中，1小时后，移去病毒溶液，更换新鲜细胞培养液，继续培养，约2天后，观察到细胞病变效应(cpe)后，将细胞做电镜切片观察。透射电镜结果显示，在罗非鱼脑细胞系中观察到大量tilv病毒粒子，见图3，其中图3a为正常细胞；图3b为接tilv-030病毒细胞；图3c、d是感染病毒的细胞电镜切片图。。
实施例4罗非鱼脑细胞系tibc
对实施例1制得的60代罗非鱼脑细胞作进一步筛选，其中一株细胞系具有最佳有利tilv病毒增殖的效果，将特定浓度的病毒接种于该细胞系中，5d后增殖量可达4.3029×107拷贝/μl，显著高于其它细胞系。本发明将该效果最佳的细胞系命名为罗非鱼脑细胞系tibc，其有50条染色体。罗非鱼脑细胞tibc于2018年1月12日保藏于中国典型培养物保藏中心cctcc，保藏地址为中国武汉大学，保藏中心于2018年1月12日收到申请人提供的细胞。保藏中心给予该培养物的保藏号为cctccno:c201829，提议的分类学名称为罗非鱼脑细胞tibc，已于2018年1月18日鉴定保藏的细胞是存活的。
实施例5罗非鱼脑细胞系tibc与其他细胞系对tilv病毒增殖的效果对比
将特定浓度的病毒接种于本发明的罗非鱼脑细胞(tibc)和其他13种常用鱼类细胞系：cik(草鱼肾细胞)、zf4(斑马鱼细胞)、co(草鱼性腺细胞)、epc(鲤鱼内皮瘤细胞)、ccb(普通鲤鱼脑细胞)、ks(锦鲤吻端细胞)、kf(锦鲤尾鳍细胞)、cpb(鳜鱼脑细胞)、crcb(鲫鱼脑细胞)、cf(草鱼胸鳍细胞)、cib(草鱼脑细胞)、sfe(剑尾鱼胚胎细胞)、fhm(胖头鱼细胞)，5d后，提取病毒rna，用fq-pcr方法检测病毒含量，并应用统计学分析软件spss16.0对各细胞中同一毒株的病毒增殖量进行显著性分析，如表1，结果显示，对tilv病毒增殖最多的细胞是tibc，增殖量可达4.3029×107拷贝/μl显著高于其它鱼类细胞(p＜0.01)。
表1不同细胞中tilv病毒的增殖量
(注：本表中所有的数据分析p<0.01)
实施例6tilv接种tibc细胞的tcid50测定
根据reed-muench法测定病毒效价的原理，取生长良好的本发明tibc细胞经消化后取样计数，用l-15将细胞按照5×104个/ml的浓度进行稀释，以100μl/孔的初始量接种到96孔板培养24h使细胞充分贴壁。次日，取出细胞板弃尽生长液，每孔添加100μl含3％fbs的l-15维持液，然后将待检病毒样品按稀释倍数由低到高的顺序以100μl/孔分别添加到96孔板的1～10列各孔中，11～12列各添加100μl含3％fbs的l-15维持液作为阴性对照，该实验设3个重复。将细胞板于37℃、5％co2培养箱中培养96h后观察细胞病变(cytopathiceffect,cpe)并记录终点,按reed-muench法计算病毒的效价，公式为：
病毒效价＝10lgcpe>50％的病毒最高稀释度+(cpe>50％的百分数-50％)/(cpe>50％的百分数-<50％的百分数)tcid50/100μl。
该实验连续进行7天，tilv感染tibc细胞系的病毒滴度范围为100.65tcid50/ml～109.43tcid50/ml(如图6)。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。