大豆ZF-HD蛋白编码基因GmZFHD11的应用的制作方法

本发明涉及大豆zf-hd蛋白编码基因gmzfhd11的应用，属于基因工程领域。

背景技术

同源异形盒结构域(hd)是一段60个氨基酸的dna结合基序，并存在于许多转录因子中，主要由同源异形盒基因编码，在动物、植物以及真菌的发育过程中发挥着重要的作用。同源异形盒结构域蛋白作为转录因子能与启动子序列结合并影响mrna的表达。典型的hd结构包括3个α螺旋和1个n端转角螺旋。

锌指同源异形盒结构域蛋白(zf-hd)属于转录因子家族并调控植物的生长和发育。zf-hd在n端包含一个锌指结构域，在c端包含一个同源异形盒结构域，因此并命名为zf-hd。目前在许多植物中都鉴定到了zfhd，如拟南芥、水稻、小麦和大豆等。最初是在黄菊中被鉴定到4个能够与pepcase基因启动子结合的zfhd基因(etal.2001)。在拟南芥基因组中含有14个zfhd基因，该家族基因在花中表达量较高并认为调控花发育过程并存在功能冗余。其中zfhd1能够与干旱胁迫基因的启动子结合，表明zfhd1能够参与非生物胁迫。而zfhd5能够与拟南芥mif1结合并调控叶片发育以及花器官形态建成。wang等(2011)报道了athb33能够被arf2负调节并参与aba信号途径。在水稻中包含14个zfhd基因，其中7个基因能够与osdreb1b的启动子结合，并受到低温、干旱和机械损伤的诱导，表明zfhd在非生物胁迫中有重要作用。过表达oszhd1能够影响水稻的叶型，使叶片发生卷曲。张大勇等(2011)对大豆中的zf-hd蛋白家族进行全基因组序列特征分析表明，在大豆中可能存在36个家族成员，其中gmzf-hd1和gmzf-hd2在受到病菌胁迫时能够激活大豆钙调蛋白的表达，因此推断其在抗病方面具有重要作用(parketal.2007)。目前为止，对于大豆中zfhd转录因子家族成员的相关研究较少。因此，该家族成员的相关功能仍需进一步的实验验证。

技术实现要素：

本发明的目的在于公开一个大豆zf-hd蛋白编码基因gmzfhd11在影响植物根毛发育方面的作用。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

大豆zf-hd蛋白编码基因gmzfhd11，其核苷酸序列为：seqidno.1。

大豆zf-hd蛋白，其氨基酸序列为：seqidno.2。

含有本发明所述的大豆zf-hd蛋白编码基因gmzfhd11的重组表达载体。

使用gmzfhd11构建植物表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如在植物中加入选择性标记基因(gus基因、萤光素酶基因等)。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以表型性状筛选转化植株。

本发明所述的大豆zfhd蛋白编码基因gmzfhd11在通过基因工程提高植物根毛的数目中的应用。

携带有本发明gmzfhd11的植物表达载体可通过使用ti质粒、ri质粒、植物病毒载体、dna直接转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是高粱、水稻、小麦、玉米等单子叶植物，也可以是花生、大豆、油菜、番茄、杨树、草坪草、苜蓿等双子叶植物。

有益效果

组织表达分析显示gmzfhd11在各组织中均有表达，在幼嫩的种子、花、叶和根中表达量较高(图2)。在对大豆幼苗分别进行干旱胁迫、盐胁迫、冷害和aba胁迫处理后，gmzfhd11的表达量发生了变化，表明gmzfhd11能够受到非生物胁迫的诱导，而在gmzfhd11的启动子中也存在一些逆境响应元件(图3)。构建了亚细胞定位载体pfgc5941-gmzfhd11，将其和空载体分别利用注射方法转化烟草叶片，结果表明gmzfhd11蛋白定位在细胞核上(图4)。构建了植物过量表达载体pmdc83-gmzfhd11,并将其在野生型拟南芥中进行过表达。对筛选出的t3代阳性苗进行鉴定，发现过表达的植株根毛数目明显增多(图5、图6)，表明该基因可以作为目的基因导入植物，提高植物根毛的数量。

附图说明

图1gmzfhd11基因的pcr扩增

m为marker(dl2000，takara)；1、2为gmzfhd11的目的条带

图2gmzfhd11在大豆各组织中的表达分析

图3不同逆境胁迫下gmzfhd11的相对表达量

a：15％peg干旱处理；b：250nmnacl高盐处理；c：4℃低温处理；d：100μm的aba处理

图4gmzfhd11的亚细胞定位

含gfp的质粒pfgc5941-gmzfhd11转入烟草表皮细胞中，并在激光共聚焦显微镜下观察。

图5过表达阳性植株与对照植株根毛发育对比

图6过表达阳性植株的根毛数统计

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明做进一步说明。

下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。

1)大豆zfhd蛋白编码基因gmzfhd11的克隆

以大豆品种科丰1号为材料，根据ncbi数据库中大豆zf-hd蛋白编码基因gmzfhd11(glyma07g35760，geneid:10081492)的序列设计相应的引物，引物序列见seqidno.3和seqidno.4。大豆材料科丰1号由南京农业大学大豆改良中心提供，所有材料种植于江浦试验站。

以科丰1号的开花后15天荚皮为取材对象，去掉种子，放入液氮中速冻，用以提取总rna。以获得的总rna为模板，按照takara反转录试剂盒的说明书进行反转录，得到cdna第一链后，进行pcr扩增，pcr程序如下：95℃预变性3分钟，95℃变性15秒，60℃退火15秒，72℃延伸1分钟，共35个循环，最后72℃保温5分钟，随后12℃恒温。随后进行pcr产物割胶纯化、连接及转化工作，挑取阳性单克隆测序。测序后获得具有完整编码区的长度为1077bp的大豆gmzfhd11基因的cds序列，其中编码区序列见seqidno.1，命名为gmzfhd11，由1077bp组成(图1)。

2)gmzfhd11的亚细胞定位研究

设计包含gmzfhd11基因完整orf的引物(不包含终止密码子)，引物序列见seqidno.5和seqidno.6，具体的pcr过程与步骤1)相同。利用高保真酶进行pcr扩增，所得产物进行胶回收清洁后用限制性内切酶smaⅰ和xhoⅰ对产物及载体进行双酶切，将目的片段与载体pfgc5941用t4dna连接酶进行连接，然后转化、涂板，测序正确的菌液提质粒并命名为pfgc5941-gmzfhd11。将其与空载分别转入eha105感受态中，利用注射方法将其转入烟草叶片中。结果表明gmzfhd11蛋白定位在细胞核上(图4)。

3)gmzfhd11在不同逆境胁迫下的表达分析

选取大小一致的大豆科丰1号种子，播种于灭菌的蛭石和营养土中(1:1)，在第一对真叶展开时挑选大小一致的幼苗并置于1/2的hoagland营养液中培养3天，3天后对所选幼苗进行胁迫处理：

(1)干旱处理：将幼苗置于15％的peg溶液中，处理时间为0h、0.5h和2h，取样后置于液氮中速冻，于-80℃冰箱中保存；

(2)盐处理：将幼苗置于含有250mmnacl的溶液中进行处理，处理时间为0h、3h和6h,取样后处理方法同上；

(3)低温处理：将幼苗置于4℃的培养箱中，处理时间为0h、2h和4h；

(4)aba处理：将幼苗置于浓度为100μm的aba溶液中，处理时间为0h、3h和6h

将对照幼苗置于水中培养，处理条件和时间与上述方法相同，取样后在液氮速冻后于-80℃保存。总rna的提取同步骤1)，反转为cdna之后进行实时荧光定量pcr反应(real-timert-pcr)，引物序列见seqidno.7和seqidno.8。以大豆组成型表达的tubulin作为内部参照，引物序列见seqidno.9和seqidno.10，检测gmzfhd11基因在不同逆境胁迫中的表达量变化。

gmzfhd11在干旱处理0.5h时的表达量与对照相比几乎没有差异，在处理2h后，gmzfhd11的表达量低于对照；在高盐处理3h时，gmzfhd11的表达量的增长低于对照，但是在6h时急剧上升，是对照的9倍左右；低温处理2h后，gmzfhd11在处理材料和对照材料中的表达量都呈上升趋势，处理材料的表达量高于对照，但是在4h时gmzfhd11在两种材料中的表达量都显著下降且处理材料的表达量低于对照；aba处理过程中，处理3h时，表达量逐渐上升，处理6h后，表达量逐渐下降且处理材料高于对照(图3)。

实施例2基因gmzfhd11的基因工程应用

1)大豆zfhd蛋白编码基因gmzfhd11的克隆

以大豆(glycinemax)科丰1号品种的荚皮总rna为模板，经反转录合成cdna第一链后，进行pcr扩增，引物序列见seqidno.1和seqidno.2，pcr程序如下：95℃预变性3分钟，95℃变性15秒，60℃退火15秒，72℃延伸1分钟，共35个循环，最后72℃保温5分钟，随后12℃恒温，将pcr产物克隆至ceentryvector载体，测序后获得具有完整编码区的长度为1077bp的大豆gmzfhd11基因的cds序列,其中编码区序列见seqidno.1；

2)植物表达载体的构建

将gmzfhd11基因序列与invitrogen公司的technologywithclonase^tmii试剂盒中的pdonr221载体进行bp反应，并进行菌液pcr测序验证，引物序列见seqidno.11和seqidno.12，具体的pcr过程与步骤1)相同，获得入门克隆；将得到的入门克隆与invitrogen公司开发的目的表达载体pmdc83进行重组交换，得到pmdc83-gmzfhd11植物过量表达表达载体，植物转化载体pmdc83含有2×35s强启动子，可强烈诱导目的基因gmzfhd11在受体中的表达。然后通过冻融法将载体转入根癌农杆菌菌株eha105中；

3)转基因植株的获得

将步骤2)获得的含pmdc83-gmzfhd11载体的根癌农杆菌菌株eha105通过采用沾花法转化拟南芥(arabidopsisthaliana)columbia-0型生态型，对获得的转基因植株进行pcr，利用目的基因特异性引物对提取的dna片段进行pcr特异性扩增，引物序列见seqidno.13和seqidno.14，检测基因编码框是否插入拟南芥基因组dna中，具体的pcr过程与步骤1)相同，实时荧光定量qpcr引物序列见seqidno.7和seqidno.8，验证后进行植物的表型性状分析：

将筛选得到的转基因株系移栽于装有蛭石的盆中，用1/2ms培养液进行适时浇灌，22℃长日照周期条件下生长。观察并记录t1及t2代转基因拟南芥的生长发育过程及其表型性状。t3代拟南芥在固体培养基上生长至9-10片叶时，使用体视镜对其根部形态结构进行拍照。结果表明过表达植株的根毛数量要明显多于野生型对照组(图5、图6)，表明该基因可以作为目的基因导入植物，提高植物根毛的数量从而影响植物生长发育。

序列表

<110>南京农业大学

<120>大豆zf-hd蛋白编码基因gmzfhd11的应用

<160>14

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1077

<212>dna

<213>大豆(glycinemax)

<400>1

atggacctaacctccatcagtacccacaacacaaacacaacacaaaccttagatgctgct60

aatactactactaaaaccaccccaccaacgccaatccccaccaccaccccaaagtctcta120

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<211>358

<212>prt

<213>大豆(glycinemax)

<400>2

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151015

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180185190

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<210>3

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>9

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>11

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<211>49

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>12

ggggaccactttgtacaagaaagctgggtctaagatgacatctcattaa49

<210>13

<211>47

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>13

caggtcgactctagaggatccgccaccatggacctaacctccatcag47

<210>14

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>14

tgaagaagatggtcctctcctg22