拟南芥长链非编码RNAAtHAL6在调控植物高温胁迫耐性中的应用的制作方法

本发明涉及拟南芥长链非编码rnaathal6在调控植物高温胁迫耐性中的应用，属于分子生物学和生物技术技术领域。

背景技术

温度是影响植物生长发育的最重要的环境因子之一，温度的细微变化能极大地影响植物的生长和发育等行为。全球变暖已经导致了极端高温等气候的变化，对作物生产造成了大量的损失(hasanuzzamanetal.,2013；lesketal.,2016)。

高温胁迫能够破坏植物的光合系统，降低植物的含水量，影响细胞的分裂和生长(hasanuzzamanetal.,2013)。植物由于固着生长，进化出复杂而多样的系统来应对高温胁迫。植物响应高温胁迫存在遗传调控和表观遗传调控。遗传调控包括推测的温度受体、热激转录因子hsf和热激蛋白hsp响应通路、激素调控网络和次级代谢物质(bokszczaninetal.,2013；quetal.,2013)。表观遗传调控包括dna甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑和小分子rnas调控等。表观遗传修饰在维持基因组稳定性、调节植物生长发育和响应逆境胁迫等方面发挥了重要作用(liuandhe,2014)。

长链非编码rna是指一类长度超过200bp的不具有蛋白编码功能的rna。目前关于lncrna的工作主要集中在动物中，发现lncrna有着强大而独特的功能，包括表观调控染色质沉默、转录调控、转录后调控影响剪切体的剪切或者竞争性结合mirna影响靶基因的表达等(faticaandbozzoni,2014；tretal.,2009)。但是在植物中的研究相对较少，目前植物非编码rna的生物学功能和作用机制的研究主要集中在模式植物方面，在除水稻外的作物中研究较少。

技术实现要素：

针对上述现有技术，本发明提供了拟南芥长链非编码rnaathal6的一种新用途——拟南芥长链非编码rnaathal6在调控植物高温胁迫耐性中的应用。本发明还提供了可调控拟南芥长链非编码rnaathal6表达的重组表达载体。

本发明是通过以下技术方案实现的：

拟南芥长链非编码rnaathal6，其核苷酸序列如seqidno.1所示。

拟南芥长链非编码rnaathal6在调控植物高温胁迫耐性中的应用，在制备转基因植物中的应用。本发明通过研究发现，拟南芥长链非编码rnaathal6能够显著提高转基因拟南芥在种子萌发期和幼苗发育早期及壮苗期的耐热性。本发明为培育农作物新品种提供理论依据和基因来源。

一种植物表达载体，其含有上述拟南芥长链非编码rnaathal6。优选的，所述植物表达载体所用的质粒为pbi121。

一种遗传工程化的宿主细胞，其含有上述植物表达载体，或其基因组中插入了拟南芥长链非编码rnaathal6。

所述遗传工程化的宿主细胞的构建方法为常规技术手段，将植物表达载体导入宿主细胞，使植物表达载体/拟南芥长链非编码rnaathal6在宿主细胞中有效表达。

上述植物表达载体、遗传工程化的宿主细胞在制备耐高温的转基因植物(高温胁迫耐性优于野生型植株)中的应用。所述植物包括拟南芥。

本发明从拟南芥中克隆得到一段长链非编码rnaathal6，将其连接于表达载体上，并利用农杆菌侵染法转化拟南芥，数据显示该基因能够显著提高转基因拟南芥在种子萌发期和幼苗发育早期及壮苗期的耐热性。本发明为培育农作物新品种提供理论依据和基因来源。

本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。

附图说明

图1：转基因拟南芥种子与野生型拟南芥种子在正常条件、45℃高温处理6h的ms培养基上的萌发情况，其中，a：正常条件下，野生型和超表达拟南芥种子在ms培养基上的萌发情况；b：45℃高温处理6h，野生型和超表达拟南芥种子在ms培养基上的萌发情况。wt代表野生型拟南芥种子，oe代表转基因拟南芥种子。

图2：转基因拟南芥种子与野生型拟南芥种子在45℃高温处理6h下种子萌发率统计情况，其中，横坐标表示时间，纵坐标表示种子萌发率；wt代表野生型拟南芥种子，oe代表转基因拟南芥种子；ck代表对照，hs代表45℃高温处理6h。

图3：转基因拟南芥幼苗与野生型拟南芥幼苗在正常条件、高温处理后的存活情况，其中，a：正常条件下，野生型和超表达拟南芥幼苗在高温处理后的存活情况；b：转基因拟南芥幼苗与野生型拟南芥幼苗在高温处理后的存活情况。wt代表野生型拟南芥，oe代表转基因拟南芥。

图4：转基因拟南芥幼苗与野生型拟南芥幼苗在高温处理后的存活情况；其中，横坐标表示不同的材料，纵坐标表示存活率；wt代表野生型拟南芥，oe代表转基因拟南芥。

图5：转基因拟南芥壮苗与野生型拟南芥幼苗在正常条件、高温处理后的存活情况，其中，a：正常条件下，野生型和超表达拟南芥壮苗在高温处理后的存活情况；b：转基因拟南芥壮苗与野生型拟南芥幼苗在高温处理后的存活情况。wt代表野生型拟南芥，oe代表转基因拟南芥。

图6：转基因拟南芥壮苗与野生型拟南芥幼苗在高温处理后的存活情况，其中，横坐标表示不同的材料，纵坐标表示存活率；wt代表野生型拟南芥，oe代表转基因拟南芥。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。

本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。

下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。

实施例中所采用的pcr、酶切、连接、转化等基因工程基本操作方法如无特殊说明均可按记载于《分子克隆实验指南第三版》中((美)j.萨姆布鲁克等著，科学出版社，2002年出版)，和《植物基因工程原理与技术》中(王关林，方宏笃著，科学出版社，1998)记载的方法操作。

实施例1：拟南芥长链非编码rnaathal6的获得

(1)拟南芥叶片genomicdna提取；

(2)athal6的pcr扩增：以拟南芥叶片dna为模板，根据athal6序列设计引物，进行pcr扩增，回收和纯化pcr扩增产物，并测序。引物为：

正向引物：5’-tctagaggtgtcaacgtctccactgg-3’(seqidno.2)。

反向引物：5’-gagctccgggaatgaacaacgaggcg-3’(seqidno.3)。

pcr反应体系和扩增条件如表1。

表1

反应步骤为：预变性：98℃30s；循环条件：98℃10s，55℃10s，72℃30s，循环30次；后延伸：72℃10min。

实施例2：重组表达载体的构建

取2μl上述实施例1获得的athal6，与pmd19-t载体进行连接，操作步骤按takara公司产品pmd19-tvectorsystem说明书进行。然后转化大肠杆菌dh5α菌株，转接于表面涂5-溴-4-氯-3-吲哚-β-d-半乳糖苷和x-gal的含氨苄青霉素(100μg/ml)的lb平板上培养过夜。挑取白色菌落，在lb液体培养基中培养过夜并进行菌落pcr鉴定；同时碱法提取质粒dna进行序列测定，制得重组pmd19-t载体。

用限制性内切酶xbai和限制性内切酶saci酶切重组pmd19-t载体，然后与经限制性内切酶xbai和限制性内切酶saci酶切的载体pbi121连接。连接产物转化dh5α细胞，然后在含卡那霉素(50μg/ml)的lb固体平板上培养，对菌落进行pcr鉴定和质粒dna的酶切分析；制得重组表达载体pbi121-athal6。

实施例3：转基因拟南芥的获得

将重组表达载体pbi121-athal6转化农杆菌gv3101的感受态细胞，挑取转入重组表达载体pbi121-athal6的农杆菌的单克隆接种于含50mg/l卡那霉素的lb液体培养基中，28℃振荡培养两天。将发酵液3000rpm/min离心5分钟，所得农杆菌沉淀用含5％蔗糖和0.03％silwetl-77的侵染液悬浮。

采用花序浸染法转化哥伦比亚生态型野生型拟南芥(col-0)(购自美国拟南芥生物资源中心，abrc，http://www.biosci.ohio-state.edu/pcmb/facilities/abrc/abrchome.htm)，收获该当代转基因拟南芥植株所结的种子(t1代)，在含有50mg/lkan(卡那霉素)的ms培养基筛选萌发的种子。将萌发的t1代幼苗移到培养土中，收获种子(t2代)，然后经相同的筛选过程得到纯合的t3代转pbi121-athal6的转基因拟南芥种子。最后将t3代转基因拟南芥种子直接播种到培养土中，长出的t3代转基因拟南芥植株在长日照条件下生长两周左右开花。

对t3代转基因拟南芥进行转基因植株鉴定，包括：抗性培养基初步筛选、pcr扩增进一步筛选阳性植株、rtpcr表达量鉴定阳性植株；最终从鉴定得到的阳性植株中选出表达量高的株系，收获其种子，制得转基因拟南芥种子，进行抗逆表型鉴定。最终得到两个株系，分别命名为oe2、oe4。

实施例4：转基因拟南芥耐热表型鉴定

本实验设置以下两个对照：

野生型对照：未转入任何质粒的野生型拟南芥(col-0)；

空载体对照：按照获得t3代转入重组表达载体pbi121-athal6的转基因拟南芥的方法，将空载体pbi121转入野生型拟南芥中，然后进行继代培养得到t3代转pbi121的转基因拟南芥，制得空载体对照种子。

(1)高温条件下的种子萌发实验

取野生型拟南芥种子、空载体对照种子和转基因拟南芥种子，在ms培养基上进行种子萌发实验，45℃高温处理不同时间，实验条件是光周期为16小时光照，8小时黑暗；光强为300-400umol/m²/s；光照条件下的温度为22-24℃，相对湿度为70-90％；黑暗条件下的温度为18-20℃，相对湿度大于90％。以正常条件为对照。

每隔12小时统计种子萌发率，实验重复3次，测定结果如图1、图2所示(wt表示野生型拟南芥种子，oe表示转基因拟南芥种子；空载体对照种子和野生型拟南芥种子的表型一致，故图中未显示空载体对照)，转基因拟南芥种子在培养基中45℃高温处理后的萌发率显著高于野生型拟南芥种子和空载体对照种子的萌发率。

(2)转基因拟南芥幼苗期高温表型鉴定

将在ms平板上正常发芽的子叶刚展平的生长一致的幼苗在高温培养间，放置平板，实验条件是光周期为16小时光照，8小时黑暗；光强为300-400umol/m²/s；光照条件下的温度为45℃，相对湿度为70-90％；黑暗条件下的温度为45℃，相对湿度大于90％。培养2小时后恢复一周，拍照并统计存活率，实验重复3次，以正常条件为对照。测定结果如图3、图4所示(wt表示野生型拟南芥，oe表示转基因拟南芥；空载体对照和野生型对照的表型一致，故图中未显示空载体对照)，转基因拟南芥幼苗在45℃高温处理后的存活率显著高于野生型拟南芥种子和空载体对照种子的萌发率。

(3)转基因拟南芥成苗期高温表型鉴定

将在基质中正常生长且生长一致的转基因拟南芥株系与野生型拟南芥成苗共同进行高温处理。如图5、图6所示(wt表示野生型拟南芥，oe表示转基因拟南芥；空载体对照和野生型拟南芥的表型一致，故图中未显示空载体对照)，在正常的生长条件下，野生型与超表达株系生长没有差异。经过高温处理，野生型拟南芥和转基因拟南芥的成苗都表现出了干旱抗性减弱的表型：野生型拟南芥株系普遍萎蔫较快，成活率低。相比之下，转基因拟南芥萎蔫较慢，成活率高。与野生型相比，转基因拟南芥株系的耐热能力明显提高。

给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。本说明书引述的所有出版物、专利和专利申请通过引用并入本文，如同这些出版物、专利和专利申请各自特别地和个别地表明通过引用并入本文。

序列表

<110>山东农业大学

<120>拟南芥长链非编码rnaathal6在调控植物高温胁迫耐性中的应用

<141>2018-06-28

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>449

<212>dna

<213>arabidopsisthaliana

<400>1

cggtgtcaacgtctccactgggcatgtccgatctggcgatccaagaggaagatatctttc60

catcaataaactctattgtgagaattcctaaggggtagacataatttcagagcgagagaa120

gtgttgagcgataaactttaaagatgttttccgtgagtgctgtcatattcgtcaaagatg180

gtggaagcataaggtgggggagaaagttcgagaaagtttgagaaagttgaaggaacatgt240

gtttttgtccgagcttcccaagctctatgctgttggagaactctgcaaggatcttgccac300

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aagaagatgatatcctgatgcccggcaagcaaaagcttctccaatgttggaaaccttgat420

cgggaaagacgcctcgttgttcattcccg449

<210>2

<211>26

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>2

tctagaggtgtcaacgtctccactgg26

<210>3

<211>26

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>3

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