本发明属于生物制药
技术领域：
，特别涉及一种合成多肽类药物及其应用，尤其涉及一种合成多肽及其在制备抗静脉血栓形成的药物中的应用。
背景技术：
静脉血栓(venousthrombosis)指在静脉血流迟缓、血液高凝状态及血管内膜损伤条件下，静脉发生急性非化脓性炎症，并继发血栓形成的疾病。静脉血栓多发生于下肢或盆腹腔手术后、严重外伤、急性感染、妊娠、恶性肿瘤、心脏病患者。由各种原因所致小腿静脉回流压力降低，血液黏度增加，血小板增加和血液凝固性增高，当血管内皮受到轻微损伤时，可促使血小板在该处黏附形成血小板性血栓，继而纤维蛋白沉着，血栓增大，而使血管腔闭塞。静脉血栓形成的病因较为多样，其中静脉血流滞缓和血液高凝状态是两个主要因素。研究表明，单一因素不能独立引发静脉血栓，常常是2-3个因素的综合作用造成深静脉血栓形成。例如，产后深静脉血栓形成发病率高，即是综合因素所致。再例如，孕妇产后子宫内胎盘剥离能在短期内迅速止血，不致发生产后大出血，与血液的高凝状态有密切关系。妊娠时胎盘产生大量雌激素，足月时达最高峰，其雌三醇的量可增加到非孕时的1000倍。雌激素促进肝脏产生各种凝血因子，同时妊娠末期体内纤维蛋白原也大量增加，致使血液呈高凝状态，产后再加卧床休息，使下肢血流滞缓，从而有发生深静脉血栓的倾向。单纯血流滞缓不足以产生静脉血栓，有时伴有血管壁的损伤，如直接损伤、慢性疾病或远处组织损伤，产生白细胞趋向性因子，使白细胞移向血管壁。同样，内皮细胞层出现裂隙，基底膜的内膜下胶的显露，均可使血小板移向血管内膜，导致凝集过程的发生，生成静脉血栓。目前，治疗抗静脉血栓的药物多为中药、化药或中西医结合药物，例如201710855393.8公开了一种抗静脉血栓形成的中药方剂、制剂及制备方法，中药方剂包括泽兰、侧伯叶、黄柏、大黄、艾叶、黄连、透骨草、苍耳子和蒲公英。200410013651.0公开了一种治疗下肢静脉血栓形成和血栓性浅静脉炎的药物，所述中药包括：丹参、王不留行、土茯苓、三七、大蓟、玄参和川牛膝，其重量份数为丹参3-5、王不留行3-7、土茯苓5-20、三七0.5-3、大蓟3-5、玄参1-5、川牛膝1.5-3。然而，治疗抗静脉血栓的合成多肽类药物还鲜有报道，与传统的化学药物相比，其具有安全性高、疗效显著、易于合成等优点。技术实现要素：本发明的目的是提供一种合成多肽及其在制备抗静脉血栓形成的药物中的应用，本发明的药物对于静脉血栓的形成具有较好的预防和治疗作用，安全性好，疗效显著，在临床上可作为优良的抗血栓剂使用。为此，本发明技术方案如下：第一方面，本发明提供一种合成多肽，所述合成多肽的氨基酸序列如seqidno：1所示，具体为：val-his-asp-leu-cys-gly-tyr-met-tyr-val-met-pro(vhdlcgymyvmp)。优选地，所述合成多肽的n端氨基乙酰化。优选地，所述合成多肽的c端富集组氨酸。优选地，所述合成多肽的c端富集5-8个l型组氨酸例如，可以是5个l型组氨酸、6个l型组氨酸、7个l型组氨酸或8个l型组氨酸。优选地，所述合成多肽的氨基酸序列如seqidno：2、seqidno：3、seqidno：4或seqidno：5所示，具体为：seqidno：2——val-his-asp-leu-cys-gly-tyr-met-tyr-val-met-pro-his-his-his-his-his(vhdlcgymyvmphhhhh)。seqidno：3——val-his-asp-leu-cys-gly-tyr-met-tyr-val-met-pro-his-his-his-his-his-his(vhdlcgymyvmphhhhhh)。seqidno：4——val-his-asp-leu-cys-gly-tyr-met-tyr-val-met-pro-his-his-his-his-his-his-his(vhdlcgymyvmphhhhhhh)。seqidno：5——val-his-asp-leu-cys-gly-tyr-met-tyr-val-met-pro-his-his-his-his-his-his-his-his(vhdlcgymyvmphhhhhhhh)。第二方面，本发明提供如第一方面所述的合成多肽在制备抗静脉血栓形成的药物方面的应用。需要说明的是，所述抗静脉血栓形成的药物可包含seqidno：1-5中任意一条合成多肽或至少两条合成多肽的组合，其均具有抗静脉血栓形成的功效。优选地，所述抗静脉血栓形成的药物为水性悬浮、溶液或固体状态。优选地，所述固体状态为未包衣或包衣片剂形式，例如丸剂、凝胶胶囊、胶囊或粉末等。如果所述药物处于干燥状态，则它可以与一种或多种惰性稀释剂例如淀粉、纤维素、蔗糖、乳糖或二氧化硅等混合。它在干燥状态下还可以包含其他物质，例如一种或多种润滑剂如硬脂酸镁或滑石粉、着色剂、包衣(糖包衣片剂)或清漆。如果本发明的药物是液体形式，则它可以包括含有惰性稀释剂例如水、乙醇、甘油、植物油或液体石蜡的可药用的溶液、悬浮液、乳剂、糖浆剂和酏剂。所述药物组合物还可以包含除稀释剂以外的其他液体物质，例如润湿剂、甜味剂、增稠剂、调味剂或稳定剂产品。优选地，所述抗静脉血栓形成的药物还包括药学上接收的辅料。优选地，所述辅料为赋形剂、稀释剂、载体、调味剂、粘合剂和填充剂中的任意一种或至少两种的组合，例如可以是赋形剂，载体和稀释剂，调味剂、粘合剂和填充剂，或者稀释剂、载体、调味剂、粘合剂和填充剂的组合，由于篇幅的限制，所有组合的形式不再一一列举。在本发明中，所述药物由治疗上有效剂量的本发明的合成多肽与药学上可接受的溶剂所组成，即将有效量的本发明合成多肽与药学上可接受的溶剂配伍后，按本领域常规的制剂方法将其制备成任意一种适宜的药物组合物。通常该药物组合物适合于口服给药或注射给药，也适合其他的给药方法。根据不同的给药方法，本发明药物可以含有0.1％-99％重量，优选20-50％重量的本发明的合成多肽。通过sd大鼠颈动静脉旁路模型评价了seqidno：1-5的合成多肽的抗血栓活性，试验结果表明，本发明的合成多肽具有明显的抗血栓活性，血栓干重抑制百分率高达67％；sd大鼠凝血时间测试结果表明，本发明的合成多肽在一定的浓度下具有延长凝血时间的功能，与模型组相比，凝血时间延长了约一倍；抗炎症效应测试结果表明，本发明的合成多肽在一定浓度下具有明显的抗炎效应，与对照组相比，小鼠腹腔毛细血管的通透性增加了约50％。另外，本发明的合成多肽没有细胞毒性，没有溶血活性，也没有出血风险。因此，本发明的合成多肽具有优异的抗静脉血栓活性，可用于预防和治疗静脉血栓，可作为临床上的抗静脉血栓剂使用，可推广性良好，具有潜在的经济价值。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明，但下述实施例绝非对本发明有任何限制。实施例1实施例1中的合成多肽序列为val-his-asp-leu-cys-gly-tyr-met-tyr-val-met-pro，由“上海科肽生物科技有限公司”合成，通过质谱分析验证了合成物的纯度大于97％。实施例2实施例2中的合成多肽序列为val-his-asp-leu-cys-gly-tyr-met-tyr-val-met-pro-his-his-his-his-his，由“上海科肽生物科技有限公司”合成，通过质谱分析验证了合成物的纯度大于97％。实施例3实施例3中的合成多肽序列为val-his-asp-leu-cys-gly-tyr-met-tyr-val-met-pro-his-his-his-his-his-his，由“上海科肽生物科技有限公司”合成，通过质谱分析验证了合成物的纯度大于97％。实施例4实施例4中的合成多肽序列为val-his-asp-leu-cys-gly-tyr-met-tyr-val-met-pro-his-his-his-his-his-his-his，由“上海科肽生物科技有限公司”合成，通过质谱分析验证了合成物的纯度大于97％。实施例5实施例5中的合成多肽序列为val-his-asp-leu-cys-gly-tyr-met-tyr-val-met-pro-his-his-his-his-his-his-his-his，由“上海科肽生物科技有限公司”合成，通过质谱分析验证了合成物的纯度大于97％。实施例6实施例6中的合成多肽序列为nhac-val-his-asp-leu-cys-gly-tyr-met-tyr-val-met-pro-his-his-his-his-his-his-his-his，由“上海科肽生物科技有限公司”合成，通过质谱分析验证了合成物的纯度大于97％。实施例7实施例7中的合成多肽序列为nhac-val-his-asp-leu-cys-gly-tyr-met-tyr-val-met-pro-his-his-his-his-his-his，由“上海科肽生物科技有限公司”合成，通过质谱分析验证了合成物的纯度大于97％。实施例8实施例8中的合成多肽序列为nhac-val-his-asp-leu-cys-gly-tyr-met-tyr-val-met-pro，由“上海科肽生物科技有限公司”合成，通过质谱分析验证了合成物的纯度大于97％。实施例9合成多肽对sd大鼠静脉血栓形成的影响1)材料实验动物：雄性sd大鼠120只，体重180-240g，购买自上海印溪仪器仪表有限公司。试剂：tpa、pai、at-iii活性测定，pt、aptt、tt时间测定，以上试剂盒均购买自上海太阳生物技术公司。2)试验方法将上述100只sd大鼠适应性喂养1周后，随机分为空白组，模型组和实施例1-8用药的实验组1-8，每个空白组、模型组和实验组均设置10只sd大鼠。动物选模及给药：腹腔注射乌拉坦(剂量为1000mg/kg)进行麻醉，对腹腔外壁涂抹由实施例1-8提供的合成多肽药物(剂量为5000mg/kg)，模型组及空白组涂抹等量生理盐水(剂量为900mg/kg)。涂抹药物5min后，除空白组外，其余组采用reyers提出的瘀血诱发大鼠下腔静脉血栓形成模型造模，于左肾静脉下方用粗丝线结扎下腔静脉造成静脉血栓模型。缝合腹壁。各组均以消毒动物饲料为食。结扎4h后，各组重新打开腹腔，于结扎线下方2cm处夹闭血管，同时夹住段内主要静脉侧枝并用注射器吸尽静脉段内残血，纵行剖开管腔，观察有无血栓形成并计算血栓形成率，若血栓形成，将形成之血栓置烤箱内60℃烘烤20分钟称其干重。计算血栓干重抑制百分率并做t检验。其中，抑制率计算公式为：抑制率＝(模型组测定值-实验组测定值)/模型组测定值×100％。计算结果见下表1，从表1可以看出，由实施例1-8提供的合成多肽药物分别与模型组相比，其血栓干重均显著减轻，差异均具有统计学意义。表1静脉注射合成多肽药物对sd大鼠静脉血栓重量的影响(x±s)(n＝10)在实施例1的10个重复中，与模型组相比，p1＜0.01；在实施例2的10个重复中，与模型组相比，p2＜0.01；在实施例3的10个重复中，与模型组相比，p3＜0.01；在实施例4的10个重复中，与模型组相比，p4＜0.01；在实施例5的10个重复中，与模型组相比，p5＜0.01；在实施例6的10个重复中，与模型组相比，p6＜0.01；在实施例7的10个重复中，与模型组相比，p7＜0.01；在实施例8的10个重复中，与模型组相比，p8＜0.01。以上结果说明，实施例1-8的血栓干重与模型组相比显著减轻，且结果差异具有高度统计学意义。在上述试验的同时，取剩余的20只sd大鼠适应性喂养1周后，随机分为两组，每组10只，分别即为实施例1-1和实施例1-2，动物选模、合成多肽的种类及给药方式同实施例1，区别仅在于实施例1-1施用的合成多肽药物的剂量为2500mg/kg，实施例1-2施用的合成多肽药物的剂量为7500mg/kg；血栓干重抑制百分率计算方法同上，结果如表2所示。表2合成多肽药物浓度对sd大鼠静脉血栓重量的影响(x±s)(n＝10)在实施例1-1的10个重复中，与模型组相比，p1-1＜0.01；在实施例1-2的10个重复中，与模型组相比，p1-2＜0.01；表2的结果说明，实施例1-2的血栓干重明显小于实施例1，且实施例1的血栓干重明显小于实施例1-1，说明大剂量的合成多肽对于血栓的减轻效果明显优于小剂量，即本发明的合成多肽呈剂量效应关系。实施例10合成多肽对sd大鼠血小板聚集的影响如实施例9中收获血栓的同时，将每个实施例的sd大鼠从左颈总动脉用塑料管取血7ml，3.8％枸椽酸钠抗凝(血与抗凝剂体积比9:1)，血液以800r.p.m离心10分钟，制备贫血小板血浆(ppp)作aptt、pt、tt、tpa、pai、at-iii等指标的测定，测定的具体方法按试剂说明书操作，测定结果如表3和表4所示。表3实施例1-8的sd大鼠凝血时间统计(x±s)(n＝10)分组aptt(s)pt(s)tt(s)空白组45.67±0.9222.96±0.6432.51±0.05模型组35.86±0.0417.29±0.2815.97±0.02实施例172.45±0.2335.62±0.2453.92±0.15实施例269.33±0.1538.72±0.8548.73±0.34实施例363.96±0.7740.75±0.6150.91±0.26实施例473.95±0.1535.92±0.0246.18±0.22实施例560.37±0.5537.11±0.8339.17±1.02实施例666.32±0.1038.91±0.8632.10±0.53实施例772.05±1.0242.19±0.7338.02±0.66实施例869.24±0.8738.56±0.4937.51±0.71在实施例1的10个重复中，与模型组相比，p1＜0.01；在实施例2的10个重复中，与模型组相比，p2＜0.01；在实施例3的10个重复中，与模型组相比，p3＜0.01；在实施例4的10个重复中，与模型组相比，p4＜0.01；在实施例5的10个重复中，与模型组相比，p5＜0.01；在实施例6的10个重复中，与模型组相比，p6＜0.01；在实施例7的10个重复中，与模型组相比，p7＜0.01；在实施例8的10个重复中，与模型组相比，p8＜0.01。表3的结果说明，实施例1-8的凝血时间明显长于模型组，且结果差异具有高度统计学意义。表4合成多肽浓度对于sd大鼠凝血时间的影响(x±s)(n＝10)分组aptt(s)pt(s)tt(s)空白组45.67±0.9222.96±0.6432.51±0.05模型组35.86±0.0417.29±0.2815.97±0.02实施例1-159.63±0.0528.94±0.0745.32±0.14实施例172.45±0.2335.62±0.2453.92±0.15实施例1-298.24±0.3143.85±0.6059.83±1.02在实施例1-1的10个重复中，与模型组相比，p1-1＜0.01；在实施例1-2的10个重复中，与模型组相比，p1-2＜0.01；表4的结果说明，大剂量的合成多肽对于sd大鼠凝血时间的延长效果明显优于小剂量，即本发明的合成多肽呈剂量效应关系。实施例11合成多肽的抗炎症效应1)材料实验动物：km小鼠50只，雌雄各半，体重18-24g，购买自上海印溪仪器仪表有限公司。2)试验方法将km小鼠进行分组，每组10只，共5组。阳性对照组、空白对照组和试验组。其中，阳性对照组灌胃阿司匹林(10mg/20g)，空白对照组灌胃医用生理盐水(9ml/20g)，试验组灌胃由实施例1制得的合成多肽分别配制低(1mg/20g)、中(8mg/20g)、高(18mg/20g)剂量组，分别即为实施例101，实施例102和实施例103。除另有规定外，一般每天给药一次，实验室温度控制在18-28℃，自制标准颗粒饲料喂养，自由摄食、摄水。给药7天，每天1次，在给药第7天，末次给药30min后，各鼠均尾静脉注射1％伊文思蓝(0.1ml/g)，随即腹腔注射0.6％hac(0.1ml/10g)，20min后处死小鼠，剪开腹部皮肤肌肉，用6ml生理盐水冲洗腹腔，用注射器吸取洗涤液，离心洗液15min(3000r.p.m)，取上清液于分光光度计590nm处测其吸光度(a)，具体结果如表5所示。表5小鼠腹腔毛细血管通透性检测结果分组吸光度(a)空白组0.524±0.003模型组0.186±0.004实施例1010.203±0.001实施例1020.094±0.005实施例1030.027±0.002从表5的结果可以看出，实施例102和实施例103组的小鼠的腹腔毛细血管的通透性明显增加，说明实施例1的合成多肽在高浓度下具有明显的抗炎效应，而低浓度的抗炎效果劣于高浓度的合成多肽。随后，对实施例2-8的合成多肽分别配制浓度为18mg/20g的药液，按照上述方法分别给小鼠用药后，进行腹腔毛细血管通透性检测，结果与实施例103相似，在此不再赘述，说明实施例2-8的合成多肽在高浓度下同样具有明显的抗炎效应。实施例12合成多肽的细胞毒性测试人角质形成细胞hacat及人单核细胞thp-1分别在含有10％胎牛血清及双抗(青霉素和链霉素各100u/ml)的dmem和rpmi1640培养基中培养至对数期，细胞用pbs(nacl8.0g，kcl0.2g，na2hpo4·h2o1.56g，kh2po40.20g，加去离子水至1000ml，调ph值至7.2)洗细胞三遍后，用新鲜培养基悬浮细胞(hacat用0.25％的胰蛋白酶消化)，调整细胞密度至1×106个/ml，以每孔200ul的体积铺96孔板。细胞铺板过夜后加入浓度为100μg/ml的实施例1的合成多肽(记为样品组)，在37℃，5％co2条件下共培养24小时，培养结束后，每孔加入20μl5mg/mlmtt溶液(溶于细胞用pbs)，继续培养4h，用移液枪吸出孔中液体，每孔加入200μl的dmso，室温下轻摇10分钟，用酶标仪检测490nm波长的光吸收，对照组用生理盐水。样品细胞毒性(i)表示：i＝(b-a)/b×100％a＝样品组在490nm处的吸光度值；b＝对照组在490nm处的吸光度值。结果如表6所示，结果表明实施例1的合成多肽(样品组)对人角质形成细胞hacat和单核细胞thp-1的毒性约为5％左右，与对照组的细胞毒性差异很小，说明实施例1的合成多肽的几乎没有细胞毒性。随后，用同样浓度的实施例2-8的合成多肽进行相同的操作，结果与实施例1相似，说明本发明的合成多肽对于角质形成细胞hacat和单核细胞thp-1没有毒性。表6细胞毒性测试结果分组hacat细胞毒性(％)thp-1细胞毒性(％)样品组5.3894.813对照组3.1653.952实施例13合成多肽的溶血活性测试1)材料：实验动物为新西兰大白兔，雌雄各半，体重为4.5-5kg，购买自中科院昆明动物研究所；随机分为两组，每组10只。2)测试步骤：心脏采血，将所采集血液与阿氏液(8.0g柠檬酸钠，0.55g柠檬酸，20.5g葡萄糖，4.2gnacl，加去离子水至1l，调ph至6.1，高压灭菌后4℃保存)按1:1比例混合置于离心管中，1000rpm离心5min，生理盐水洗涤至上清液不再呈红色为止。将上述洗涤好的红细胞加生理盐水稀释成107-108浓度的悬浮液。上述稀释好的红细胞悬浮液与溶解于生理盐水的实施例1的合成多肽(浓度为100μg/ml)37℃保温30min，1000rpm离心5min，上清液于540nm测吸收值。阴性对照使用生理盐水，阳性对照使用tritonx-100，溶血活性与540nm吸收值成正比。样品溶血活性(i)的计算：i＝(a-nc)/(pc-nc)×100％a＝测试样品在540nm的吸光值；nc＝阴性对照组在540nm波长的吸光度值；pc＝阳性对照组在540nm波长的吸光度值。结果如表7所示，从结果可以看出，结果表明实施例1的合成多肽(样品组)的溶血活性约为5％左右，与对照组的溶血活性差异很小，说明实施例1的合成多肽的几乎没有溶血活性。随后，用同样浓度的实施例2-8的合成多肽进行相同的操作，结果与实施例1相似，说明本发明的合成多肽没有溶血活性。表7溶血活性测试结果分组溶血活性(％)样品组4.028±0.462对照组3.825±0.516实施例14合成多肽的出血风险评估取雄性km小鼠(体重18-20g)6只一组，即每组试验6个重复，不同浓度的实施例1的合成多肽及对照通过静脉注射给药，给药120min后，将小鼠置于固定器中，使其尾部垂直，用消毒保险刀片切去尾尖约2mm，立即将鼠尾浸入37℃的生理盐水中，以血流停止时间为指标，观察记录断尾出血停止的时间，结果如表8所示。特别说明，生理盐水处理的出血时间为56.653±0.152s；测试结果表明，在30μg/kg剂量时，实施例1的合成多肽存在很小的出血活性，但是在60μg/kg和120μg/kg剂量时，却没有出血风险。相反，对照奥扎格雷组有非常明显的出血活性。实施例2-8的结果与实施例1相同，不再赘述，说明本发明的合成多肽在较高浓度剂量时(≥60μg/kg)没有出现风险。表8出血风险测试结果综上所述，本发明的合成多肽具有明显的抗血栓活性，血栓干重抑制百分率高达67％；sd大鼠凝血时间测试结果表明，本发明的合成多肽在一定的浓度下具有延长凝血时间的功能，与模型组相比，凝血时间延长了约一倍；抗炎症效应测试结果表明，本发明的合成多肽在一定浓度下具有明显的抗炎效应，与对照组相比，小鼠腹腔毛细血管的通透性增加了约50％。另外，本发明的合成多肽没有细胞毒性，没有溶血活性，也没有出血风险。应该注意到并理解，在不脱离后附的权利要求所要求的本发明的精神和范围的情况下，能够对上述详细描述的本发明做出各种修改和改进。因此，要求保护的技术方案的范围不受所给出的任何特定示范教导的限制。申请人声明，以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。序列表<110>张建华<120>一种合成多肽及其在制备抗静脉血栓形成的药物中的应用<130>006<160>5<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>12<212>prt<213>人工序列(artificialsequences)<400>1valhisaspleucysglytyrmettyrvalmetpro1510<210>2<211>17<212>prt<213>人工序列(artificialsequences)<400>2valhisaspleucysglytyrmettyrvalmetprohishishishis151015his<210>3<211>18<212>prt<213>人工序列(artificialsequences)<400>3valhisaspleucysglytyrmettyrvalmetprohishishishis151015hishis<210>4<211>19<212>prt<213>人工序列(artificialsequences)<400>4valhisaspleucysglytyrmettyrvalmetprohishishishis151015hishishis<210>5<211>20<212>prt<213>人工序列(artificialsequences)<400>5valhisaspleucysglytyrmettyrvalmetprohishishishis151015hishishishis20当前第1页12