本发明属于生物医药
技术领域：
，具体涉及一种醋酸奥曲肽的制备方法及其药物组合物。
背景技术：
醋酸奥曲肽(octreotideacetate)是由八个氨基酸组成的合成多肽，属于生长抑素类似物，近年来已被广泛应用于消化道肿瘤、上消化道出血、急性胰腺炎、转移性类癌、肢端肥大症等病的治疗。醋酸奥曲肽的cas：83150-76-9，分子式为c49h66n10o10s2·xc2h4o2；化学名为：d-苯丙氨酰-l-半胱氨酰-l-苯丙氨酰-d-色氨酰-l-赖氨酰-l-苏氨酰-n-[(1r,2r)-2-羟基-1-(羟甲基)丙基]-l-半胱氨酰胺环(2→7)-二硫键醋酸盐，在1982年，瑞士sandoz药厂合成了新一代长效型生长抑素类似物—醋酸奥曲肽，可与广泛存在于中枢神经系统、垂体和胰腺β细胞等处的生长抑素(somatostatin,st)受体结合产生生物学效应，而且抑制生长激素(gh)、胰岛素、胰高血糖素、胃酸分泌均比st强，特异性也较高。同时，由于1，4位l-氨基酸分别被相应d-氨基酸取代，8位为氨基l醇，故醋酸奥曲肽不易被蛋白酶迅速水解，并延长了体内半衰期，t1/2为80-160min，使用时不需连续静注。奥曲肽于1988年在新西兰首先上市，上市剂型为注射剂，1989年美国fda批准在美国上市。醋酸奥曲肽注射液，临床使用可静脉注射、皮下注射、静脉滴注(滴注给药时间可达12小时以上)，其储存方式为2～8℃，避光保存，在室温中(20～30℃)可保存14天，由此可见醋酸奥曲肽溶液稳定性是其产品质量优劣的重要衡量标准。目前临床实用的奥曲肽商品名为善宁，为奥曲肽的醋酸盐注射液，并在其中加入了乳酸、甘露醇作为赋形剂，苯酚为抑菌剂。由于中国药典规定静脉用注射液不能加入抑菌剂，所以善宁的生产厂家诺华公司又对配方进行了改进，改用乳酸、甘露醇为辅料得到了奥曲肽醋酸盐注射液，但此注射液要求避光2-8℃保存，常温下只能保存两周，稳定性差，不利于贮存和运输。cn101647773b公开了一种醋酸奥曲肽注射液，非活性成分有甘露醇、吐温80和柠檬酸，在处方中加入吐温80和柠檬酸以改善溶液稳定性，但该发明中所述的注射液并没有经过终端灭菌，虽有除菌过滤工艺，但在液态的储存过程中，也存在微生物污染的隐患，且产品没有对氧化采取有力的防护措施。同时加入吐温80，具有一定溶血作用。cn102526700a公开了一种注射用醋酸奥曲肽冻干组合物，包括醋酸奥曲肽、甘露醇和适量的缓冲物质，所述醋酸奥曲肽、甘露醇的质量比为1：450-500。所述的缓冲物质为乳酸和碳酸氢钠，也可以为酒石酸和酒石酸钠。产品需冷藏保存。cn102416001b公开了一种注射用醋酸奥曲肽冻干粉针剂，醋酸奥曲肽为活性成分，甘露醇为冻干赋形剂，柠檬酸为调节剂，冻干粉针剂的ph值为5.5～5.7。仅解决了产品复溶问题，未提及产品稳定性的情况。cn102525927b公开了一种醋酸奥曲肽脂质体前体及制备方法。该前体脂质体中含有醋酸奥曲肽、负电磷脂、冻干保护剂，尚可以含有适量其它脂质。但脂质体制备工艺复杂，目前国内上市的产品不多，产业化难度大，并且需要低温保存。cn103932996a公开了一种注射用醋酸醋酸奥曲肽冻干组合物及其制备方法，所述的冻干组合物中含有醋酸奥曲肽、氨丁三醇和马来酸。技术实现要素：基于上述原因，申请人经过多次创造性试验，得到一种新的醋酸奥曲肽的纯化方法，本发明得到的醋酸奥曲肽纯度更高。本发明的另一个目的在于提供一种制备醋酸奥曲肽药物组合物的方法。本发明人在大量现有文献的基础上，通过大量筛选的实验，发现上述文献以及一般的纯化分离方法难于高产率地获得高纯度的化合物，而其他各种分离纯化方法以及多种条件参数又可能存在多种多样的组合性和不可预测性。本发明人经过长期认真的研究，经过组合应用特定的方法并优化参数后，意外发现了一种包括如下处理步骤的醋酸奥曲肽的方法：具体而言，本发明提供了：一种醋酸奥曲肽的纯化方法，包括如下步骤：步骤1：取醋酸奥曲肽粗品溶于乙腈水溶液中溶解，得醋酸奥曲肽粗品溶液；步骤2：取所述粗品溶液，以c8色谱柱，以含有0.1～0.2％三氟醋酸的异丙醇水溶液为a相，含有0.1～0.2％三氟醋酸的乙腈为b相，梯度为15～40％b→30～60％b，进行第一hplc纯化，线性梯度洗脱，收集目的峰获得第一洗脱液；步骤3：取第一洗脱液，以c18反相色谱柱，以质量浓度为0.01～0.06％硫酸铵水溶液为a相，色谱纯乙腈为b相，按下表梯度洗脱，进行第二hplc纯化，表1梯度洗脱时间(分钟)流动相a(％)流动相b(％)08020177723237030346535收集目的峰获得第二洗脱液；取所述第二洗脱液经减压旋蒸浓缩、冷冻干燥，得奥曲肽精品；步骤4：将所得奥曲肽精品与醋酸混合，得醋酸奥曲肽，将所得的醋酸奥曲肽用乙醚洗涤，得精品醋酸奥曲肽。所述乙腈水溶液为体积比为3％～15％的乙腈水溶液。所述异丙醇水溶液为体积比为15％～40％的异丙醇水溶液。步骤2或步骤3中，所述流速为55～1000ml/min。所述醋酸奥曲肽粗品溶液为10～25mg/ml步骤3中流动相a硫酸铵溶液ph值为1.8～2.0。一种含有醋酸奥曲肽的药物组合物，包括：醋酸奥曲肽、海藻糖、甘露醇、乙酸–乙酸钠缓冲液。所述的药物组合物包括以下重量份的成分：所述的药物组合物的ph值为3.7~4.7。一种含有醋酸奥曲肽的药物组合物制备注射液的方法，该方法包括以下步骤：取甘露醇、海藻糖溶解于注射用水中，搅匀；加入醋酸奥曲肽，用乙酸-乙酸钠缓冲液调节ph至3.7-4.7，加入注射用水至1000ml；经0.22μm微孔滤膜过滤，得到醋酸奥曲肽滤液，灌装，灭菌，得到注射液。本发明提供一种纯化醋酸奥曲肽的方法，该方法将醋酸奥曲肽粗品溶于乙腈水溶液获得粗品溶液后，通过hplc纯化获得奥曲肽精品，收率大于60％，纯度大于为99％。本发明提供一种醋酸奥曲肽组合物及其制备方法，该方法制药物组合物具有更高的稳定性。具体实施方式以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。本发明中所用的醋酸奥曲肽粗品购自连云港海恒生化科技有限公司，纯度为76.3％。本发明制备实施例1-5中检测波长为220nm。制备实施例实施例1步骤1：用10％的乙腈水溶液按照15mg/ml的浓度溶解2.2g醋酸奥曲肽粗品，超声使样品完全溶解后用滤膜过滤，收集滤液为粗品溶液，备用。步骤2：取所述粗品溶液，以c8色谱柱，柱子直径和长度为：50mm×250mm。以含有0.1％三氟醋酸的异丙醇水溶液(体积比为85％水/15％异丙醇)为a相，含有0.1％三氟醋酸的乙腈为b相，流速：55ml/min，梯度为40％b→60％b，线性梯度洗脱，洗脱200min，收集纯度大于95％以上洗脱液，将收集的目的峰洗脱液于减压旋蒸浓缩至约20mg/ml后作第二步纯化样品。步骤3：以c18反相色谱柱，进样量为1.5g，柱子直径和长度为：50mm×250mm。0.01％硫酸铵水溶液(ph值为1.8)为a相，色谱纯乙腈为b相，流速：85ml/min，按下表梯度洗脱，进行纯化，表2梯度洗脱时间(分钟)流动相a(％)流动相b(％)08020177723237030346535收集目的峰，得到纯度大于98％以上洗脱液，将收集的目的峰洗脱液于水温不超过35℃的条件下减压旋蒸浓缩至约50mg/ml后进行冷冻干燥，得奥曲肽精品；步骤4：将所得奥曲肽精品与醋酸混合，得醋酸奥曲肽，将所得的醋酸奥曲肽用乙醚洗涤，过滤、干燥，得到醋酸奥曲肽1.32g，纯化总收率为60.3％。实施例2步骤1：用3％的乙腈水溶液按照10mg/ml的浓度溶解2.5g固体醋酸奥曲肽粗品，超声使样品完全溶解后用滤膜过滤，收集滤液为粗品溶液，备用。步骤2：取所述粗品溶液，以c8色谱柱，柱子直径和长度为：50mm×250mm。以含有0.2％三氟醋酸的异丙醇水溶液(体积比为75％水/25％异丙醇)为a相，含有0.2％三氟醋酸的乙腈为b相，流速：80ml/min，梯度为15％b→30％b，线性梯度洗脱，洗脱180min，收集纯度大于95％以上洗脱液，将收集的目的峰洗脱液于减压旋蒸浓缩至约20mg/ml后作第二步纯化样品。步骤3：以c18反相色谱柱，进样量为1.9g，柱子直径和长度为：50mm×250mm。0.03％硫酸铵水溶液(ph值为1.8)为a相，色谱纯乙腈为b相，流速：70ml/min，按下表梯度洗脱，进行纯化，表3梯度洗脱时间(分钟)流动相a(％)流动相b(％)08020177723237030346535收集目的峰，得到纯度大于98％以上洗脱液，将收集的目的峰洗脱液于水温不超过35℃的条件下减压旋蒸浓缩至约50mg/ml后进行冷冻干燥，得奥曲肽精品；步骤4：将所得奥曲肽精品与醋酸混合，得醋酸奥曲肽，将所得的醋酸奥曲肽用乙醚洗涤，过滤、干燥，得到的醋酸奥曲肽1.59g，纯化总收率为63.5％。实施例3步骤1：用8％的乙腈水溶液按照20mg/ml的浓度溶解3.0g固体醋酸奥曲肽粗品，超声使样品完全溶解后用滤膜过滤，收集滤液为粗品溶液，备用。步骤2：取所述粗品溶液，以c8色谱柱，柱子直径和长度为：50mm×250mm。以含有0.2％三氟醋酸的异丙醇水溶液(体积比为60％水/40％异丙醇)为a相，含有0.2％三氟醋酸的乙腈为b相，流速：100ml/min，梯度为20％b→50％b，线性梯度洗脱，洗脱160min，收集纯度大于95％以上洗脱液，将收集的目的峰洗脱液于减压旋蒸浓缩至约20mg/ml后作第二步纯化样品。步骤3：以c18反相色谱柱，进样量为2.35g，柱子直径和长度为：50mm×250mm。0.02％硫酸铵水溶液(ph值为1.9)为a相，色谱纯乙腈为b相，流速：80ml/min，按下表梯度洗脱，进行纯化，表4梯度洗脱时间(分钟)流动相a(％)流动相b(％)08020177723237030346535收集目的峰，得到纯度大于98％以上洗脱液，将收集的目的峰洗脱液于水温不超过35℃的条件下减压旋蒸浓缩至约50mg/ml后进行冷冻干燥，得奥曲肽精品；步骤4：将所得奥曲肽精品与醋酸混合，得醋酸奥曲肽，将所得的醋酸奥曲肽用乙醚洗涤，过滤、干燥，得到醋酸奥曲肽1.81g，纯化总收率为60.3％。实施例4步骤1：用15％的乙腈水溶液按照15mg/ml的浓度溶解25g固体醋酸奥曲肽粗品，超声使样品完全溶解后用滤膜过滤，收集滤液为粗品溶液，备用。步骤2：取所述粗品溶液，以c8色谱柱，柱子直径和长度为：50mm×250mm。以含有0.15％三氟醋酸的异丙醇水溶液(体积比为80％水/20％异丙醇)为a相，含有0.15％三氟醋酸的乙腈为b相，流速：300ml/min，梯度为20％b→60％b，线性梯度洗脱，洗脱80min，收集纯度大于95％以上洗脱液，将收集的目的峰洗脱液于减压旋蒸浓缩至约20mg/ml后作第二步纯化样品。步骤3：以c18反相色谱柱，进样量为19.25g，柱子直径和长度为：50mm×250mm。0.06％硫酸铵水溶液(ph值为2.0)为a相，色谱纯乙腈为b相，流速：255ml/min，按下表梯度洗脱，进行纯化，表5梯度洗脱时间(分钟)流动相a(％)流动相b(％)08020177723237030346535收集目的峰，得到纯度大于98％以上洗脱液，将收集的目的峰洗脱液于水温不超过35℃的条件下减压旋蒸浓缩至约50mg/ml后进行冷冻干燥，得奥曲肽精品；步骤4：将所得奥曲肽精品与醋酸混合，得醋酸奥曲肽，将所得的醋酸奥曲肽用乙醚洗涤，过滤、干燥，得到醋酸奥曲肽16.1g，总收率为64.3％。实施例5步骤1：用15％的乙腈水溶液按照25mg/ml的浓度溶解90g固体醋酸奥曲肽粗品，超声使样品完全溶解后用滤膜过滤，收集滤液为粗品溶液，备用。步骤2：取所述粗品溶液，以c8色谱柱，柱子直径和长度为：50mm×250mm。以含有0.2％三氟醋酸的异丙醇水溶液(体积比为70％水/30％异丙醇)为a相，含有0.2％三氟醋酸的乙腈为b相，流速：1000ml/min，梯度为20％b→50％b，线性梯度洗脱，洗脱100min，收集纯度大于95％以上洗脱液，将收集的目的峰洗脱液于减压旋蒸浓缩至约20mg/ml后作第二步纯化样品。步骤3：以c18反相色谱柱，进样量为66g，柱子直径和长度为：50mm×250mm。0.05％硫酸铵水溶液(ph值为1.8)为a相，色谱纯乙腈为b相，流速：700ml/min，按下表梯度洗脱，进行纯化，表6梯度洗脱时间(分钟)流动相a(％)流动相b(％)08020177723237030346535流速：1000ml/min，收集目的峰，得到纯度大于98％以上洗脱液，将收集的目的峰洗脱液于水温不超过35℃的条件下减压旋蒸浓缩至约50mg/ml后进行冷冻干燥，得奥曲肽精品；步骤4：将所得奥曲肽精品与醋酸混合，得醋酸奥曲肽，将所得的醋酸奥曲肽用乙醚洗涤，过滤、干燥，得到醋酸奥曲肽56.5g，纯化总收率为62.8％。试验例1：照《中国药典》2015版二部所记载的醋酸奥曲肽中的有关物质检测方法和含量测定方法，测定本发明实施例1-5所得醋酸奥曲肽的各项指标，结果如表8。有关物质：取本品实施例醋酸奥曲肽适量加水溶解并稀释制成每lml中约含0.125mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取1ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。照含量测定项下的色谱条件，精密量取供试品溶液和对照溶液各100μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。【含量测定】照高效液相色谱法(通则0512)测定。色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以四甲基氢氧化铵溶液(取10％四甲基氢氧化铵溶液20ml，加水880ml，用10％磷酸溶液调ph值至5.4)-乙腈(900:100)作为流动相a，以四甲基氢氧化铵溶液(取10％四甲基氢氧化铵溶液20ml，加水380ml，用10％磷酸溶液调ph值至5.4)-乙腈(400:600)作为流动相检测波长为210nm；按下表进行梯度洗脱。取脱苏氨醇奥曲肽与醋酸奥曲肽对照品适量，加水溶解并稀释制成每lml中约含脱苏氨醇奥曲肽10μg和醋酸奥曲肽0.lmg的混合溶液，取20μl注人液相色谱仪，记录色谱图，理论塔板数按奥曲肽峰计算不低于3000；脱苏氨醇奥曲肽峰与奥曲肽峰的分离度应符合要求。表7梯度洗脱时间(分钟)流动相a(％)流动相b(％)07327305545317327377327测定法取本品适量，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每lml中约含0.125mg的溶液，作为供试品溶液，精密量取供试品溶液20μl注入液相色谱仪，记录色谱图；另取醋酸奥曲肽对照品适量，同法测定。按外标法以峰面积计算，即得。表8醋酸奥曲肽相关指标测试结果对比例：参照cn201710259689实施例1所述方法制备。试验结论：由表1可知，本发明所述的方法制得的醋酸奥曲肽的含量均在99％以上，相比于对比例，本发明方法提纯的醋酸奥曲肽具有更高的收率。实施例6在洁净的条件下，将10g海藻糖和40g甘露醇投入配液器具中，加入注射用水700ml中搅拌溶解，搅匀；加入0.1g醋酸奥曲肽(实施例4)，用0.2mol/l乙酸–乙酸钠缓冲液调节ph至4.5，加入注射用水至1000ml，经0.22μm微孔滤膜过滤，得到醋酸奥曲肽滤液，灌装，得到注射液。实施例7在洁净的条件下，将15g海藻糖和35g甘露醇投入配液器具中，加入注射用水700ml中搅拌溶解，搅匀，加入0.1g醋酸奥曲肽(实施例5)，用0.2mol/l乙酸–乙酸钠缓冲液调节调节ph至4.6，加入注射用水至1000ml，经0.22μm微孔滤膜过滤，得到醋酸奥曲肽滤液，灌装，得到注射液。实施例8在洁净的条件下，将12g海藻糖和38g甘露醇投入配液器具中，加入注射用水700ml中搅拌溶解，搅匀；加入0.1g醋酸奥曲肽(实施例3)，用0.2mol/l乙酸–乙酸钠缓冲液调节ph至4.5，加入注射用水至1000ml，经0.22μm微孔滤膜过滤，得到醋酸奥曲肽滤液，灌装，得到注射液。试验例2：对比例1：称取醋酸奥曲肽0.1g、氨丁三醇80g加入冷至15℃的注射用水中，搅拌溶解，加入适量柠檬酸，调节药液ph值4.5，循环过滤，送样检测半成品药液含量，将确定含量的药液经0.22μm微孔滤膜过滤，灌装，得到注射液。对比例2：称取醋酸奥曲肽0.1g、酒石酸钠80g加入冷至15℃的注射用水中，搅拌溶解，加入适量马来酸，调节药液ph值4.5，循环过滤，送样检测半成品药液含量，将确定含量的药液经0.22μm微孔滤膜过滤，灌装，得到注射液。对比例3：称取醋酸奥曲肽0.1g、氨丁三醇80g和甘露醇100g加入冷至15℃的注射用水中，搅拌溶解，加入适量马来酸，调节药液ph值4.5，循环过滤，送样检测半成品药液含量，将确定含量的药液经0.22μm微孔滤膜过滤，灌装，得到注射液。对比例4：称取醋酸奥曲肽0.1g、氨丁三醇80g加入冷至15℃的注射用水中，搅拌溶解，加入适量马来酸，调节药液ph值4.5，循环过滤，送样检测半成品药液含量，将确定含量的药液经0.22μm微孔滤膜过滤，灌装，得到注射液。对比例醋酸奥曲肽为市售醋酸奥曲肽精品，含量为99.9％，有关物质为0.12％。购自连云港海恒生化科技有限公司。测试方法：有关物质取本品作为供试品溶液，或取本品适量，用水稀释制成每lml中约含奥曲肽0.lmg的溶液作为供试品溶液；照醋酸奥曲肽项的方法检查。供试品溶液的色谱图中如有杂质峰，除去相对保留时间小于0.5的色谱峰外，单个杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积(2.0％)各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积的2倍(4.0％)。含量测定取本品作为供试品溶液，或精密量取本品适量，用水定量稀释制成每lml中含奥曲肽0.lmg的溶液作为供试品溶液，照醋酸奥曲肽项下的方法测定，即得。加速试验：在上市药品包装条件下，取实施例6及对比例1～4制备的制剂样品在40℃，75％rh下进行加速试验1个月，对其含量及有关物质等指标进行考察，各项指标均符合规定。测定结果见表9。表9各处方加速试验试验结果以上实验数据表明，本发明制备的醋酸奥曲肽相比于对比例具有更好的稳定性。以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员，在不脱离本发明的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为落入本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。当前第1页12