本发明属于医疗领域，具体涉及一种建立骨肉瘤表柔比星耐药细胞系的方法。
背景技术
骨肉瘤是一种常见的原发性骨恶性肿瘤，多见于青少年，恶性程度高，远处转移早，单纯截肢手术后的5年生存率不足20％。随着新辅助化疗的出现，患者的5年生存率可达50％～80％，其中约60％的肢体骨肉瘤患者可以保肢，但对于发生远端转移的患者而言，疗效并不理想，其5年生存率仅为20～30％。分子靶向治疗是肿瘤治疗中的重要方向，可有效延长肿瘤患者的生存期，提升患者的生活质量，但目前骨肉瘤的靶向治疗尚处于研究阶段，缺乏大样本、多中心的临床试验，距离真正使骨肉瘤患者受益仍有一段距离。因此，目前临床上骨肉瘤的治疗仍以手术结合化疗为主。
骨肉瘤是一种相对耐药的肿瘤，单药化疗的效果并不理想，临床上主要采用多药联合化疗。但大多数化疗药都有一定的心脏毒性与肾脏毒性，一旦联用或大剂量使用易产生严重甚至致命的毒副反应。表柔比星(epirubicin，epi)是第三代蒽环类抗生素，具有较大的安全剂量范围以及很小的心脏毒性与肾脏毒性，将成为骨肉瘤多药化疗主力中不可或缺的一部分。但正如所有的药物一样，一旦使用了，其耐药性是无法避免的，即便是低毒性的表柔比星亦是如此，而骨肉瘤患者的治疗也将因此陷入被动，转移与复发则会如期而至。
目前关于骨肉瘤表柔比星耐药的机制尚不清楚，而关于如何逆转骨肉瘤表柔比星耐药的报道更是无处可寻，造成这种研究空白的一个主要原因是骨肉瘤表柔比星耐药细胞系的匮乏。耐药细胞系的建立主要有逐步增加药物浓度诱导法(或称药物逐步递增诱导法)与大剂量冲击诱导法，前者所建细胞系耐受能力稳定，但耗费时间长，构建周期可达8至12个月，后者所需周期短，但细胞在冲击过程中易死亡，且耐受性不稳定，难度系数大，使得耐药细胞系的建立长期处于高风险、高成本的境地。
技术实现要素：
为了弥补现有一种骨肉瘤表柔比星耐药细胞系构建技术的上述不足，发明人经过大量的研究工作，创造性将逐步增加药物浓度法与大剂量冲击诱导法结合起来，惊讶地发现通过该结合方法建立的耐药细胞具有典型的临床生物形态学特征。具体而言，本发明的技术方案如下所述。
一种建立骨肉瘤表柔比星耐药细胞系的方法，包括如下步骤：以人143b细胞为亲本细胞，以表柔比星为诱导药物，在3-120nm/l药物浓度范围内实施药物逐步递增诱导法和大剂量冲击诱导法，直至得到能够在至少120nm/l药物浓度下正常生长和传代的耐药细胞系，其中所述实施药物逐步递增诱导法和大剂量冲击诱导法包括至少一次(优选两次以上)逐步递增诱导和两次以上冲击诱导，总体上按照“第一次逐步递增诱导→第一次冲击诱导→第二次逐步递增诱导→第二次冲击诱导……”的第n次逐步递增诱导→第n次冲击诱导→第n+1次逐步递增诱导→第n+1次冲击诱导的顺序进行表柔比星诱导，其中n为1以上的自然数，所述第n次冲击诱导所使用的表柔比星浓度高于第n次逐步递增诱导的终浓度，且第n次逐步递增诱导的终浓度不高于、优选低于第n+1次逐步递增诱导所使用的初始浓度。
上述药物逐步递增诱导法中，培养液中表柔比星的浓度递增梯度为5-10nm/l，优选5nm/l或10nm/l。
优选地，在第一次逐步递增诱导之前，取对数生长期的人143b细胞接种在细胞培养液、优选含fbs的dmem培养液中培养，然后在培养液中加入表柔比星开始诱导。
在骨肉瘤表柔比星耐药细胞系的建立过程中，细胞在含10％fbs的dmem培养液中，置于37℃、5％co2饱和湿度培养箱中培养。
上述术语“总体上”是指在后一次药物逐步递增诱导法和前一次药物逐步递增诱导法之间实施一次以上大剂量冲击诱导法。
根据具体实验观测情况，可以灵活调整上述药物逐步递增诱导法和大剂量冲击诱导法的实施顺序。
在一种实施方式中，药物逐步递增诱导法和大剂量冲击诱导法可以交替实施，按照第n次逐步递增诱导→第n次冲击诱导→第n+1次逐步递增诱导→第n+1次冲击诱导顺序进行表柔比星诱导，其中第n次冲击诱导所使用的表柔比星浓度低于第n+1次冲击诱导的浓度。
在另一种实施方式中，所述冲击诱导法可以连续进行，即按照第n次逐步递增诱导→第n次冲击诱导→第n+1次冲击诱导→第n+1次逐步递增诱导→第n+2次冲击诱导的顺序进行表柔比星诱导，其中第n次冲击诱导所使用的表柔比星浓度与第n+1次冲击诱导的浓度可以相同、但可以低于第n+2次冲击诱导的浓度。
优选地，第一次逐步递增诱导时表柔比星的初始浓度为5nm/l，待细胞恢复正常生长时，以5nm/l浓度递增；当细胞能在20nm/l浓度下正常生长、传代时，用40nm/l浓度的表柔比星进行第一次冲击诱导培养6-15h、优选8-12h、更优选9-11h、更优选10h；立即更换表柔比星浓度为20nm/l的培养基培养，待细胞稳定生长、传代时，用40nm/l浓度的表柔比星进行第二次冲击诱导培养，直至细胞能在40nm/l的表柔比星中生长；然后以10nm/l的浓度递增梯度进行第二次逐步递增诱导；当细胞能在80nm/l浓度下正常生长、传代时，用120nm/l浓度的表柔比星进行第三次冲击诱导培养6-15h、优选8-12h、更优选9-11h、更优选10h；立即更换表柔比星浓度为80nm/l的培养基培养，待细胞稳定生长、传代时，用120nm/l浓度的表柔比星进行第四次冲击诱导培养，直至细胞能在120nm/l的表柔比星中生长。
本发明的另一个方面在于提供一种骨肉瘤表柔比星耐药细胞系143b-epi，其通过上述的方法得到。
优选地，143b-epi相比于143b细胞的形态主要为长梭形，部分细胞明显拉长，迁移能力增强。可选地，143b-epi相比于143b细胞的克隆形成能力增强、尤其在低剂量表柔比星的存在下具有更强的克隆形成能力。
上述的骨肉瘤表柔比星耐药细胞系143b-epi可以应用于治疗骨肉瘤药物的筛选。
本发明将逐步增加药物浓度法和大剂量冲击诱导法这两种方法有机地结合起来，用于建立骨肉瘤表柔比星耐药细胞系，具有构建周期短、耐药性稳定的特点。通过本发明的方法建立的骨肉瘤表柔比星耐药细胞系具有典型的临床生物学特征包括细胞形态学特征、生长性状和迁移能力，可以作为骨肉瘤的体外表柔比星耐药模型，用于骨肉瘤表柔比星耐药机制的研究，并为逆转耐药研究提供条件。
附图说明
图1显示了143b细胞和143b-epi细胞的形态照片(200×)。
图2显示了143b细胞和143b-epi细胞的生长曲线。
图3是143b细胞和143b-epi细胞对表柔比星(epi)的耐受性曲线图。
图4显示了143b细胞和143b-epi细胞的迁移照片。
图5显示了143b细胞和143b-epi细胞的迁移细胞数量柱状图，其中***表示p<0.001。
图6显示了在20nm/l表柔比星浓度下143b细胞和143b-epi细胞的克隆形成照片。
图7是143b细胞和143b-epi细胞的克隆数柱状图，其中***表示p<0.001。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
为描述方便起见，在本文中可将“(耐药)细胞系”简称为“(耐药)细胞”，都是指骨肉瘤表柔比星耐药细胞系。
在本文中，143b细胞也可表示为143b细胞，都是指人骨肉瘤细胞，这是本领域技术人员所熟知的商品细胞。143b-epi(细胞)是指骨肉瘤表柔比星耐药细胞系或骨肉瘤表柔比星耐药细胞。
应当理解，在本文中，术语“逐步增加(药物)浓度”、或者“(药物)逐步递增”是指在培养液中按照基本固定的浓度梯度加入表柔比星，所述浓度梯度比如是5nm/l或10nm/l。实施逐步增加药物浓度法(或称药物逐步递增法)时，细胞培养时间相对较长，比如为一周左右或更长，直至细胞能在一定浓度下正常生长、传代正常生长、传代。
术语“冲击”或者“冲击诱导”是指在培养液中陡然加入浓度大幅度增加即大剂量的表柔比星。实施大剂量冲击诱导法时，细胞培养时间相对较短，比如为10个小时(10h)左右。表柔比星的剂量增加幅度以不导致细胞大量死亡为度，比如细胞致死率不高于40％、30％、25％、20％、15％、10％，更优选细胞致死率不高于20％、10％、或者5％。
在人143b细胞诱导培养的具体实施方式中，药物逐步递增诱导法和大剂量冲击诱导法优选包括两次以上逐步递增诱导和两次以上冲击诱导，这两类诱导可以以交替方式实施，即第一次逐步递增诱导→第一次冲击诱导→第二次逐步递增诱导→第二次冲击诱导……，以此类推；也可以以重复+交替方式实施，比如第一次逐步递增诱导→第一次冲击诱导→第二次冲击诱导→第二次逐步递增诱导→第三次冲击诱导→第四次冲击诱导……，以此类推。
在一种实施方式中，第一次逐步递增诱导时表柔比星的初始浓度约为3nm/l、5nm/l、8nm/l、10nm/l、15nm/l、18nm/l或者20nm/l，比如为5nm/l。如果初始诱导浓度低于3nm/l，那么骨肉瘤表柔比星耐药细胞系的构建周期会有延长趋势；如果大于20nm/l，则会引起亲本细胞的大量死亡，难以推进诱导的浓度。
本发明的逐步增加药物浓度法与大剂量冲击诱导法相结合的方法仅需5个月之内就可以完成耐药细胞143b-epi的构建，相比单独进行药物逐步递增法的诱导培养的8-12个月的构建周期，大大提高了工作效率。另一方面，避免了单独进行
大剂量冲击过程中细胞易死亡所致的反复多次冲击以及所得耐药细胞的耐药性不稳定系数的缺陷。
本发明所得的耐药细胞143b-epi相比于人143b细胞，在形态学、迁移能力、耐药性、克隆形成能力等方面已经有明显改变，并且能够保持临床生物形态学特征的稳定性。因此可以作为骨肉瘤的体外表柔比星耐药模型，用于相关研究。
本领域技术人员容易理解，通过本发明的上述方法建立的骨肉瘤表柔比星耐药细胞系可以作为实验对象用于骨肉瘤治疗药物的筛选。
为使本发明更明显易懂，兹以实施例配合附图作详细说明如下。本领域技术人员应当理解，下述实施例仅用于阐明本发明的可行性，并非是对本发明进行限制。
实施例1骨肉瘤表柔比星耐药细胞系的构建
取对数生长期的人143b细胞接种在含10％fbs的dmem培养液中，置于37℃、5％co2饱和湿度培养箱中培养。在培养液中加入适量表柔比星进行诱导，初始浓度为5nm/l，待细胞恢复正常生长时，以5nm/l浓度递增，当细胞能在20nm/l浓度下正常生长、传代时，用40nm/lepi冲击培养10h，立即更换epi浓度为20nm/l的培养基培养一周左右，待细胞稳定生长、传代时，再次冲击，直至细胞能在40nm/l的epi中生长，然后以10nm/l的浓度递增，当细胞能在80nm/l浓度下正常生长、传代时，用120nm/l的epi冲击诱导10h，立即更换epi浓度为80nm/l的培养基培养一周左右，待细胞稳定生长、传代时，再次冲击，直至细胞能在120nm/l的epi中生长，历时五个月，最终获得了能够在含有120nm/lepi的培养体系中稳定生长、传代的143b细胞，命名为143b-epi。
实施例2人143b细胞和143b-epi细胞的形态学特征比较
利用倒置相差显微镜观察143b细胞在表柔比星诱导前后的形态，拍照记录。结果如图1所示，143b主要为短梭形，棱角分明，而143b-epi主要为长梭形，部分细胞明显拉长，提示诱导后细胞的形态发生了明显的变化。
实施例3人143b细胞和143b-epi细胞的生长比较
分别取对数生长期的143b和耐药细胞143b-epi，胰酶消化后用dmem完全培养液重悬细胞，调整密度为3×104个/ml，接种于96孔板中，每孔100μl。每组设5个复孔，置于37℃、5％co2饱和湿度培养箱中培养过夜，次日在两种细胞中加入适量epi，终浓度为20nm/l，置于培养箱中培养5天，期间每天用mtt法测定细胞490nm的吸光值a，绘制生长曲线。如图2所示，两种细胞在前两天生长均较缓慢，在第三天时，143b-epi生长加速，进入指数期，而亲本细胞143b的生长较为平稳，指数期不明显。总的来说，在20nm/lepi条件下，耐药细胞143b-epi生长较快，而亲本细胞143b的生长则受到了抑制。
实施例4人143b细胞和143b-epi细胞的耐药性比较
ic50与耐药指数的测定：分别取对数生长期的143b细胞和143b-epi细胞，胰酶消化后调整细胞密度为8×104个/ml，接种于96孔培养板中，每孔100μl，置于37℃、5％co2饱和湿度培养箱中培养过夜。次日加入适量表柔比星，使其终浓度依次为0、0.01、0.1、1、10、100μm/l，每个浓度设5个复孔，培养72h后，mtt法测定每组在490nm的吸光值a490，并计算生存率(％)：
生存率(％)＝样品od均值/对照od均值×100。
根据epi的浓度以及生存率绘制药物浓度-生存率曲线，利用spss16.0计算出半数抑制浓度(ic50)，并计算耐药指数(ri)：
耐药指数(ri)＝耐药细胞ic50/亲本细胞ic50。
参见图3，143b细胞在低剂量(0.01～0.1μm/l)时对epi不敏感，当表柔比星的浓度达到1.0μm/l时，亲本细胞143b的存活率大幅下降，不足50％；而143b-epi的存活率远高于50％，对表柔比星表现出良好的耐受性。经计算，143b和143b-epi的ic50依次为0.891、3.606μm/l，耐药指数为4.05，提示143b-epi对表柔比星产生了一定的耐药性。
实施例5人143b细胞和143b-epi细胞的迁移能力比较
分别取对数生长期的143b细胞和143b-epi细胞，胰酶消化后pbs洗两遍，用无血清的dmem培养基重悬细胞，调整密度为3×105个/ml，每个小室加入100μl细胞液，在小室外加入600μl含10％fbs的dmem培养基，每个样品设三个平行，随后置于37℃、5％co2饱和湿度培养箱内培养24h。培养结束后弃去培养基，加入适量pbs漂洗2次，用棉签擦拭除去小室内部的细胞，随后甲醇固定、结晶紫染色，处理完毕后置于显微镜下观察并记录5个视野，imagej统计迁移细胞数，以迁移细胞的数目表示肿瘤细胞的迁移能力，并进行统计学分析。
迁移能力的增强是肿瘤耐药的一个重要特征。如图4和图5所示，亲本细胞143b具备一定的迁移能力，迁移的细胞数在160左右；经表柔比星诱导后，143b-epi细胞迁移能力显著增强，迁移的细胞数达到270左右(p＜0.001)。
实施例6人143b细胞和143b-epi细胞的克隆形成能力比较
分别取对数生长期的143b细胞和143b-epi细胞，胰酶消化后调整细胞密度，每孔1000个细胞，接种于六孔板中，每种细胞设3个复孔，置于37℃、5％co2饱和湿度培养箱中培养过夜，次日加入适量表柔比星，使其终浓度均为20nm/l，继续培养7-10天，当培养板中出现肉眼可见的克隆时终止培养，结晶紫染色，而后拍照，imagej统计克隆数，并进行统计学分析。
如图6和图7所示，在20nm/l表柔比星浓度下，耐药细胞143b-epi形成的克隆较多，克隆数为390左右，且单个克隆普遍较大；而亲本细胞143b形成的克隆特别稀疏，克隆数约为98，仅为耐药组的四分之一左右，提示耐药细胞143b-epi在低剂量表柔比星的存在下具有更强的克隆形成能力。
上述实验证明，对143b细胞采用大剂量冲击法结合逐步增加药物浓度法能够快速稳定地诱导产生143-epi耐药细胞株。通过细胞功能学实验，我们能够发现143b耐表柔比星细胞系形态学上主要呈长梭形，部分细胞明显拉长；耐药细胞生长更快，迁移能力显著增强，耐药指数较亲本细胞显著提高，表明骨肉瘤细胞耐药模型已成功建立。
以上实施例对于本发明的技术方案进行了验证，在不违背本发明的思想下，本领域技术人员在此基础上对本发明作出的各种改动或者修改，同样应属于本发明的范围。