用于检测慢性鼻窦炎伴鼻息肉亚型的试剂盒及ALOX15基因作为生物标志物的应用的制作方法

本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种用于检测慢性鼻窦炎伴鼻息肉亚型的试剂盒及alox15基因作为生物标志物的应用。

背景技术

慢性鼻窦炎伴鼻息肉(chronicrhinosinusitiswithnasalpolyps，crswnp)是鼻窦黏膜的慢性炎症，查体可见鼻腔或中鼻道息肉形成。crswnp常见症状为鼻堵、流涕或鼻涕倒流、嗅觉减退、面部闷胀感或压力感，持续时间超过12周。患病率约为0.5-4％，crswnp常伴有哮喘和过敏性鼻炎，有报道7％的哮喘患者患有crswnp，而26-48％的crswnp患有哮喘。crswnp发病机制目前还不确定，黏膜上皮细胞破坏、宿主免疫系统失衡和病原微生物入侵可能是其发病的主要原因。crswnp主要的治疗方式是手术和药物治疗。但研究表明，即使通过规范的药物或手术治疗，慢性鼻窦炎伴鼻息肉的复发率仍高达56％，严重影响患者生活质量，同时带来高额医疗支出，但临床却缺乏根治性治疗方法，因而成为鼻科学研究领域的重点。

依据嗜酸性粒细胞浸润的程度可以将crswnp分为嗜酸性粒细胞型(eosinophiliccrswnp，ecrswnp)与非嗜酸性粒细胞型(noneosinophiliccrswnp，nonecrswnp)，二者的临床表现、用药和预后均不同，嗜酸性粒细胞型的临床症状较重，以鼻堵和嗅觉减退为主，多合并有哮喘，术后复发率较高。鼻息肉组织中嗜酸性粒细胞浸润程度与复发关系最为密切，当组织中该细胞百分比超过27％时，复发风险超过90％。嗜酸性粒细胞型息肉对糖皮质激素类药物的敏感度显著高于非嗜酸性粒细胞型。非嗜酸性粒细胞型临床症状一般较轻，且合并哮喘的几率较小，气道炎症较轻，且术后复发率较嗜酸性粒细胞型低，对大环内酯类药物治疗反应好。西方国家以嗜酸性粒细胞型为主，主要表现为th2炎症反应，而我国的嗜酸性粒细胞型和非嗜酸性粒细胞型比例均约占一半，非嗜酸性粒细胞型主要表现为th1/th17炎症反应为主。综上所述，嗜酸性粒细胞型和非嗜酸性粒细胞型在免疫病理类型、临床症状、药物治疗反应和预后存在明显不同。不同慢性鼻窦炎伴鼻息肉的炎症/病理分型治疗策略不同。所以对慢性鼻窦炎伴鼻息肉的病理分型的鉴定显得尤为重要。

目前对两种亚型的判断主要依据鼻腔黏膜活检后组织病理标本染色，缺乏无创性生物学标志物用于鉴别诊断。患者在鼻内镜下获得息肉标本后，进行石蜡固定等病理标本的常规处理，然后进行苏木素伊红的染色，接下来通过高倍显微镜观察组织浸润的炎细胞(主要的炎细胞包括嗜酸性粒细胞，中性粒细胞，淋巴细胞，浆细胞)浸润个数，进行细胞分型。鼻腔黏膜病理活检的缺点如下：1.为有创检查：增加了患者的感染风险，不适用于免疫力较低人群如儿童、老年人等；取材时鼻腔出血，往往引起患者恐惧和担忧。2.难以获得疾病的实时动态变化信息：不能在术后对愈合期黏膜进行病理活检。但临床数据表明慢性鼻窦炎伴鼻息肉的病理分类会随药物治疗、手术治疗等转归，用治疗前的病理活检结果无法代表全部疾病时期的特征。3.费时且增加就医成本，从获取组织样本到获取病理结果一般3-4个工作日。由于无法当日或次日获得结果，外地患者就医等产生额外的交通费、住宿费、挂号费，增加了就医成本。4.存在一定的人为误差，不同的病理医生计数的炎细胞数量有可能不同，影响息肉分型的判断。5.组织病理切片较局限，只能反映切片位置的标本炎症状态，不能反映组织的全貌，可能会造成误诊。6.每张片子都需要病理科医生人工计数，难以批量操作。

由此可见，提供一种能够不依赖于鼻腔黏膜病理活检且能快速准确大批量检测慢性鼻窦炎伴鼻息肉亚型的方法成为本领域技术人员亟待解决的技术难题。

技术实现要素：

本发明针对上述的技术问题，提出一种用于检测慢性鼻窦炎伴鼻息肉亚型的试剂盒及alox15基因作为生物标志物的应用。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种用于检测慢性鼻窦炎伴鼻息肉亚型的试剂盒，所述试剂盒包括alox15基因的特异性引物。

作为优选，所述alox15基因的上游引物如seqidno:2所示，所述alox15基因的下游引物如seqidno:3所示。

作为优选，所述试剂盒进一步还包括内参基因的特异性引物。

作为优选，所述内参基因为gapdh，所述内参基因的上游引物如seqidno:4所示，所述alox15基因的下游引物如seqidno:5所示。

作为优选，所述试剂盒进一步还包括：从鼻息肉组织或从鼻黏膜脱落细胞中提取rna的试剂；将总rna逆转录为cdna的试剂；采用定量聚合酶链反应将cdna中的alox15基因和内参基因进行实时荧光定量pcr反应的试剂。

作为优选，所述将总rna逆转录为cdna的试剂包括：逆转录混合液和去rna酶及去dna酶的水；

更优选的，将总rna进行逆转录为cdna的试剂包括：1μl～40μl的逆转录混合液，以及0μl～160μl的去rna酶及去dna酶的水。进一步优选的，所述将总rna逆转录为cdna的试剂包括：2μl的逆转录混合液，以及0μl～8μl的去rna酶及去dna酶的水。

作为优选：采用定量聚合酶链反应将cdna中的alox15基因和内参基因进行实时荧光定量pcr反应的试剂包括：pcr预混合液、双蒸水、机器荧光补偿及矫正剂、alox15基因的上游引物、alox15基因的下游引物、内参基因的上游引物和内参基因的下游引物。

更优选的，采用定量聚合酶链反应将cdna中的alox15基因和内参基因进行实时荧光定量pcr反应的试剂包括：1μl～25μl的pcr预混合液，0μl～50μl的双蒸水，0μl～2μl的机器荧光补偿及矫正剂，0.01～100μm的alox15基因的上游引物，0.01～100μm的alox15基因的下游引物，0.01～100μm的内参基因的上游引物，0.01～100μm的内参基因的下游引物；进一步优选的，采用定量聚合酶链反应将cdna中的alox15基因和内参基因进行实时荧光定量pcr反应的试剂包括：5μl的pcr预混合液，0μl～10μl的双蒸水，根据总体积用水补齐至10μl，0.2μl的机器荧光补偿及矫正剂，1μm的alox15基因的上游引物，1μm的alox15基因的下游引物，1μm的内参基因的上游引物，1μm的内参基因的下游引物。

作为优选，所述从鼻息肉组织中提取rna的试剂可以选择以下两种试剂，第一种包括：rna抽提液、氯仿、异丙醇、浓度为65％～90％的乙醇、去rna酶及去dna酶的水；其中优选的，包括0.1ml～20ml的rna抽提液trizol或rnaisoblood或rnaisoplus或其它含有苯酚、异硫氰酸胍、8-羟基喹啉、异硫氰酸胍或β-巯基乙醇的物质，所述trizol或所述rnaisoblood或所述rnaisoplus或所述其它含有苯酚、异硫氰酸胍、8－羟基喹啉、异硫氰酸胍或β-巯基乙醇的物质的体积的0.1～0.5倍的氯仿，所述氯仿体积的0.5～3倍的异丙醇，所述异丙醇体积的0.5～5倍的65％至90％的乙醇，以及0.01ml至5ml的去rna酶及去dna酶的水；进一步优选的，针对从鼻息肉组织中提取rna的试剂可选择以下两种试剂，第一种包括：1ml的rna抽提液trizol或rnaisoblood或rnaisoplus或其它含有苯酚、异硫氰酸胍、8-羟基喹啉、异硫氰酸胍或β-巯基乙醇的物质，200μl的氯仿，200μl的异丙醇，200μl体积浓度为65％至90％的乙醇，以及0.02ml的去rna酶及去dna酶的水；

另外一种包括：所述从鼻息肉组织中提取rna的试剂包括：细胞裂解液、用于去除吸附有rna的纯化柱的杂质的第一缓冲液、用于去除吸附有rna的纯化柱的杂质和盐分的第二缓冲液和去rna酶及去dna酶的水；所述从鼻息肉组织中提取rna的工具包括rna纯化柱；其中所述从鼻息肉组织中提取rna的试剂还包括dna酶反应液或所述从鼻息肉组织中提取rna的工具还包括基因组dna吸附柱；所述dna酶反应液包括dna酶缓冲液、重组dna酶和去rna酶的双蒸水。

更优选的，包括0.1ml～2ml的用于裂解细胞和抑制rna降解的细胞裂解液、0.1ml～0.7ml的洗涤用第一缓冲液、0.1ml～0.7ml的洗涤用第二缓冲液、0.01ml～1ml的去rna酶及去dna酶的水、0～10μl的去除基因组dna的重组dna酶、0～10μl的去除基因组dna的dna酶缓冲液、20～100μl的去rna酶的双蒸水，所述从鼻息肉组织中提取rna的工具包括rna纯化柱；或者包括0.1ml～2ml的用于裂解细胞和抑制rna降解的细胞裂解液、0.1ml～0.7ml的洗涤用第一缓冲液、0.1ml～0.7ml的洗涤用第二缓冲液、0.01ml～1ml的去rna酶及去dna酶的水，所述从鼻息肉组织中提取rna的工具包括基因组dna吸附柱和rna纯化柱。

具体的，包括300μl的用于裂解细胞和抑制rna降解的细胞裂解液、500μl的洗涤用第一缓冲液、600μl的洗涤用第二缓冲液、0.02ml的去rna酶及去dna酶的水、4μl的去除基因组dna的重组dna酶、5μl10×去除基因组dna的dna酶缓冲液、41μl的去rna酶的双蒸水，所述从鼻息肉组织中提取rna的工具包括rna纯化柱；或者包括300μl的用于裂解细胞和抑制rna降解的细胞裂解液、500μl的洗涤用第一缓冲液、600μl的洗涤用第二缓冲液、0.02ml的去rna酶及去dna酶的水，所述从鼻息肉组织中提取rna的工具包括基因组dna吸附柱和rna纯化柱。

作为优选，所述鼻息肉组织为鼻腔病理活检获得的鼻息肉组织，或者所述鼻黏膜脱落细胞为刷取或粘取鼻息肉表面获取的鼻息肉细胞。

作为优选，选用△ct(ct(alox15)-ct(gapdh))分析法分析扩增产物的数据结果，且与所述△ct进行比较的界定值为1.675。

一种alox15基因作为生物标志物在制备用于检测慢性鼻窦炎伴鼻息肉亚型的产品中的应用。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：

1、本发明提供一种用于检测慢性鼻窦炎伴鼻息肉亚型的试剂盒，通过蛋白质组学和转录组学方法筛选采用alox15基因作为生物标志物，将其应用到试剂盒中，以实现采用试剂盒进行检测慢性鼻窦炎伴鼻息肉亚型的方法，使最终获取的试剂盒包括alox15基因的特异性引物。在具有该特异性引物的基础上，本发明的试剂盒能够快速对鼻息肉亚型进行鉴别，且相比较传统的病理检测方法准确性更高，此试剂盒可以同时对样品进行大批量、快速检测，节约了人力成本和就医成本。且系统化试剂盒鉴别准确率较高，可以全面的反应组织病理学特点。解决现有技术中人为误差的影响，避免了组织切片反应了组织局部特征造成误诊的弊端。通过试剂盒进行快速、准确、全面的鼻息肉亚型鉴别对临床诊疗至关重要，以尽早根据鼻息肉的炎症亚型进行针对化治疗，有效指导针对慢性鼻窦炎伴鼻息肉患者的药物治疗方式及手术方式的确定，准确预估药物治疗的反应、判断预后效果。

2、本发明所提供的试剂盒能够通过采用刷取或粘取的方式从鼻息肉的表面获取鼻息肉细胞来进行检测，从而确定患者的慢性鼻窦炎伴鼻息肉亚型，避免了对患者造成创面，提高了患者检查的安全性，且操作更便捷，节约了人力成本和就医成本。

附图说明

图1为本发明实验例一部分alox15基因实时荧光定量pcr扩增曲线图；

图2为本发明实验例一另一部分alox15基因实时荧光定量pcr扩增曲线图；

图3为本发明实验例一再一部分alox15基因实时荧光定量pcr扩增曲线图；

图4为本发明实验例一再一部分alox15基因实时荧光定量pcr扩增曲线图；

图5为本发明实验例一部分alox15基因实时荧光定量pcr熔解曲线图；

图6为本发明实验例一另一部分alox15基因实时荧光定量pcr熔解曲线图；

图7为本发明实验例一再一部分alox15基因实时荧光定量pcr熔解曲线图；

图8为本发明实验例一再一部分alox15基因实时荧光定量pcr熔解曲线图；

图9为本发明实验例一的一种可选的进行慢性鼻窦炎伴鼻息肉分型检测的roc曲线。

图10为本发明实验例二部分alox15基因实时荧光定量pcr扩增曲线图；

图11为本发明实验例二另一部分alox15基因实时荧光定量pcr扩增曲线图；

图12为本发明实验例二再一部分alox15基因实时荧光定量pcr扩增曲线图；

图13为本发明实验例二部分alox15基因实时荧光定量pcr熔解曲线图；

图14为本发明实验例二另一部分alox15基因实时荧光定量pcr熔解曲线图；

图15为本发明实验例二再一部分alox15基因实时荧光定量pcr熔解曲线图；

图16为本发明实验例三alox15基因实时荧光定量pcr扩增曲线图；

图17为本发明实验例三alox15基因实时荧光定量pcr熔解曲线图；

图18为本发明实验例四alox15基因实时荧光定量pcr扩增曲线图；

图19为本发明实验例四alox15基因实时荧光定量pcr熔解曲线图。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例提供了一种用于检测慢性鼻窦炎伴鼻息肉亚型的试剂盒，所述试剂盒包括alox15基因的特异性引物。

本发明通过蛋白质组学和转录组学方法经大量的创造性实验筛选得到采用alox15基因作为生物标志物来制备用于检测慢性鼻窦炎伴鼻息肉亚型的试剂盒，目前现有的技术中尚未提供相应的任何报道。其中针对alox15基因为已知基因，基因id为246，其dna序列如seqidno:1所示，基因nm号为001140.4。

在一可选实施例中，所述alox15基因的上游引物如seqidno:2所示，所述alox15基因的下游引物如seqidno:3所示。针对本发明试剂盒中所确定的上游引物和下游引物，针对本发明的试剂盒在进行鼻息肉亚型鉴别时，准确性最高，且更加有效，使试剂盒适宜进行大批量、快速检测。

在一可选实施例中，所述试剂盒进一步还包括内参基因。更为优选的，将所述内参基因为gapdh，所述内参基因的上游引物如seqidno:4所示，所述alox15基因的下游引物如seqidno:5所示。本发明试剂盒所确定的内参基因上游引物和下游引物，针对本发明的试剂盒在进行鼻息肉亚型鉴别时，能够有效通过显示alox15基因与gapdh相比的表达，获取合适的δct值，以进行鼻息肉亚型鉴别。且具有较高的准确率。

在一可选实施例中，所述试剂盒进一步还包括：从鼻息肉组织或从鼻黏膜脱落细胞中提取rna的试剂；将总rna逆转录为cdna的试剂；采用定量聚合酶链反应将cdna中的alox15基因和内参基因进行实时荧光定量pcr反应的试剂。更为优选的，所述将总rna逆转录为cdna的试剂包括：逆转录混合液和去rna酶及去dna酶的水；采用定量聚合酶链反应将cdna中的alox15基因和内参基因进行实时荧光定量pcr反应的试剂包括：pcr预混合液、双蒸水、机器荧光补偿及矫正剂、alox15基因的上游引物、alox15基因的下游引物、内参基因的上游引物和内参基因的下游引物。

另外针对从鼻息肉组织中提取rna的试剂可选择以下两种试剂，第一种包括：rna抽提液、氯仿、异丙醇、浓度为65％～90％的乙醇、去rna酶及去dna酶的水；

另外一种包括：所述从鼻息肉组织中提取rna的试剂包括：细胞裂解液、用于去除吸附有rna的纯化柱的杂质的第一缓冲液、用于去除吸附有rna的纯化柱的杂质和盐分的第二缓冲液和去rna酶及去dna酶的水；所述从鼻息肉组织中提取rna的工具包括rna纯化柱；其中所述从鼻息肉组织中提取rna的试剂还包括dna酶反应液或所述从鼻息肉组织中提取rna的工具还包括基因组dna吸附柱；所述dna酶反应液包括dna酶缓冲液、重组dna酶和去rna酶的双蒸水。本领域技术人员可根据实际的制备需求进行选择。

具体的，所述将总rna进行逆转录为cdna的试剂包括：1μl～40μl的逆转录混合液，以及0μl～160μl的去rna酶及去dna酶的水。进一步优选的，所述将总rna逆转录为cdna的试剂包括：2μl的逆转录混合液，以及0μl～8μl的去rna酶及去dna酶的水(根据rna量用水补齐至8μl)。针对上述限定的数值范围，均能够实现逆转录步骤，且对于本领域技术人员来说能够根据实际需要进行选择。

具体的，采用定量聚合酶链反应将cdna中的alox15基因和内参基因进行实时荧光定量pcr反应的试剂包括：1μl～25μl的pcr预混合液，0μl～50μl的双蒸水，0μl～2μl的机器荧光补偿及矫正剂，0.01～100μm的alox15基因的上游引物，0.01～100μm的alox15基因的下游引物，0.01～100μm的内参基因的上游引物，0.01～100μm的内参基因的下游引物；进一步优选的，采用定量聚合酶链反应将cdna中的alox15基因和内参基因进行实时荧光定量pcr反应的试剂包括：5μl的pcr预混合液，0μl～10μl的双蒸水(根据总体积用水补齐至10μl)，0.2μl的机器荧光补偿及矫正剂，1μm的alox15基因的上游引物，1μm的alox15基因的下游引物，1μm的内参基因的上游引物，1μm的内参基因的下游引物。针对上述限定的数值范围，均能够实现定量聚合酶链反应将cdna中的alox15基因和内参基因进行实时荧光定量pcr扩增的步骤，且对于本领域技术人员来说能够根据实际需要进行选择。

具体的，针对从鼻息肉组织中提取rna的试剂可选择以下两种试剂，第一种包括：包括0.1ml～20ml的rna抽提液trizol或rnaisoblood或rnaisoplus或其它含有苯酚、异硫氰酸胍、8-羟基喹啉、异硫氰酸胍或β-巯基乙醇的物质，所述trizol或所述rnaisoblood或所述rnaisoplus或所述其它含有苯酚、异硫氰酸胍、8－羟基喹啉、异硫氰酸胍或β-巯基乙醇的物质的体积的0.1～0.5倍的氯仿，所述氯仿体积的0.5～3倍的异丙醇，所述异丙醇体积的0.5～5倍的65％至90％的乙醇，以及0.01ml至5ml的去rna酶及去dna酶的水；

另外一种包括：包括0.1ml～2ml的用于裂解细胞和抑制rna降解的细胞裂解液、0.1ml～0.7ml的洗涤用第一缓冲液、0.1ml～0.7ml的洗涤用第二缓冲液、0.01ml～1ml的去rna酶及去dna酶的水、0～10μl的去除基因组dna的重组dna酶、0～10μl的去除基因组dna的dna酶缓冲液、20～100μl的去rna酶的双蒸水，所述从鼻息肉组织中提取rna的工具包括rna纯化柱；或者包括0.1ml～2ml的用于裂解细胞和抑制rna降解的细胞裂解液、0.1ml～0.7ml的洗涤用第一缓冲液、0.1ml～0.7ml的洗涤用第二缓冲液、0.01ml～1ml的去rna酶及去dna酶的水，所述从鼻息肉组织中提取rna的工具包括基因组dna吸附柱和rna纯化柱。

进一步优选的，针对从鼻息肉组织中提取rna的试剂可选择以下两种试剂，第一种包括：1ml的rna抽提液trizol或rnaisoblood或rnaisoplus或其它含有苯酚、异硫氰酸胍、8-羟基喹啉、异硫氰酸胍或β-巯基乙醇的物质，200μl的氯仿，200μl的异丙醇，200μl体积浓度为65％至90％的乙醇，以及0.02ml的去rna酶及去dna酶的水；

另外一种包括：包括300μl的用于裂解细胞和抑制rna降解的细胞裂解液、500μl的洗涤用第一缓冲液、600μl的洗涤用第二缓冲液、0.02ml的去rna酶及去dna酶的水、4μl的去除基因组dna的重组dna酶、5μl10×去除基因组dna的dna酶缓冲液、41μl的去rna酶的双蒸水，所述从鼻息肉组织中提取rna的工具包括rna纯化柱；或者包括300μl的用于裂解细胞和抑制rna降解的细胞裂解液、500μl的洗涤用第一缓冲液、600μl的洗涤用第二缓冲液、0.02ml的去rna酶及去dna酶的水，所述从鼻息肉组织中提取rna的工具包括基因组dna吸附柱和rna纯化柱。针对上述限定的数值范围，均能够实现从鼻息肉组织中提取rna的步骤，且对于本领域技术人员来说能够根据实际需要进行选择。其中rna抽提液为trizol、rnaisoblood和rnaisoplus的名称均为商品名。

上述中的所述细胞裂解液用于迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶的物质，第一缓冲液用于去除吸附有rna的纯化柱的杂质，第二缓冲液用于去除吸附有rna的纯化柱的杂质和盐分，去rna酶及去dna酶的水用于溶解rna。

另外上述中的从鼻息肉组织中提取rna的试剂；将总rna逆转录为cdna的试剂；采用定量聚合酶链反应将cdna中的alox15基因和内参基因进行实时荧光定量pcr反应的试剂分别独立包装。

在一可选实施例中，所述鼻息肉组织为鼻腔病理活检获得的鼻息肉组织，或者所述鼻黏膜脱落细胞为刷取或粘取鼻息肉表面获取的鼻息肉细胞。其中采用刷取或粘取方式，避免了对患者造成创面，提高了患者检查的安全性，且操作更便捷，节约了人力成本和就医成本。

在一可选实施例中，选用△ct(ct(alox15)-ct(gapdh))分析法分析扩增产物的数据结果，且与所述△ct进行比较的界定值为1.675。所限定该界定值，能够使本发明提供的试剂盒在检测慢性鼻窦炎伴鼻息肉亚型时的准确率达到75％以上。

本发明实施例还提供一种alox15基因作为生物标志物在制备用于检测慢性鼻窦炎伴鼻息肉亚型的产品中的应用。其中的所述产品可以为检测试剂、芯片或试剂盒。虽上述实施例仅说明了试剂盒的具体技术内容，但对于本领域技术人员来说，在公开本申请的技术方案的基础上，结合公知常识能够直接获取得到检测试剂和芯片产品的具体技术内容。

为了更清楚详细地介绍本发明实施例所提供的用于检测慢性鼻窦炎伴鼻息肉亚型的试剂盒及alox15基因作为生物标志物的应用，下面将结合具体实施例进行描述。

实施例1：

一种用于检测慢性鼻窦炎伴鼻息肉亚型的试剂盒，包括以下试剂：

从鼻息肉组织中提取rna的试剂：20mlrna抽提液trizol或rnaisoblood或rnaisoplus或其它含有苯酚、异硫氰酸胍，8－羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等物质，能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶的物质；2ml的氯仿；20ml的异丙醇；40ml的65～90％乙醇；5ml去rna酶及去dna酶的水；

将提取的rna逆转录为cdna的试剂：40μl的逆转录混合液(含有逆转录所需要的酶、rna酶抑制剂、随机的6核苷酸引物、多聚胸腺嘧啶、t重复寡核苷酸、三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物、缓冲液等)，160μl去rna酶及去dna酶的水；其中去rna酶及去dna酶的水用于补齐体系、溶解、稀释rna；

采用定量聚合酶链反应将cdna中的alox15基因和内参基因进行实时荧光定量pcr反应的试剂：25μl预混合液(含有pcr所需要的酶和缓冲液)、0～50μl的双蒸水(根据总体积用水补齐至50μl)，0～2μl的染料(用于进行机器的荧光补偿及矫正)，100μm的alox15基因的上游引物，100μm的alox15基因的下游引物，100μm的内参基因的上游引物，100μm的内参基因的下游引物，10μg阳性对照，10μg阴性对照，阳性对照是含有alox15的质粒，阴性对照是空质粒(质粒载体)。

实施例2：

一种用于检测慢性鼻窦炎伴鼻息肉亚型的试剂盒，包括以下试剂：

从鼻息肉组织中提取rna的试剂：1mlrna抽提液trizol或rnaisoblood或rnaisoplus或其它含有苯酚、异硫氰酸胍，8－羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等物质，能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶的物质；0.2ml的氯仿；0.2ml的异丙醇；0.2ml的65～90％乙醇；0.05ml去rna酶及去dna酶的水；

将提取的rna逆转录为cdna的试剂：2μl的逆转录混合液(含有逆转录所需要的酶、rna酶抑制剂、随机的6核苷酸引物、多聚胸腺嘧啶、t重复寡核苷酸、三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物、缓冲液等)，7μl去rna酶及去dna酶的水；其中去rna酶及去dna酶的水用于补齐体系、溶解、稀释rna；

采用定量聚合酶链反应将cdna中的alox15基因和内参基因进行实时荧光定量pcr反应的试剂：5μl预混合液(含有pcr所需要的酶和缓冲液)、0～10μl的双蒸水(根据总体积用水补齐至10μl)，0～2μl的染料(用于进行机器的荧光补偿及矫正)，50μm的alox15基因的上游引物，50μm的alox15基因的下游引物，50μm的内参基因的上游引物，50μm的内参基因的下游引物，5μg阳性对照，5μg阴性对照，阳性对照是含有alox15的质粒，阴性对照是空质粒(质粒载体)。

实施例3：

一种用于检测慢性鼻窦炎伴鼻息肉亚型的试剂盒，包括以下试剂：

从鼻息肉组织中提取rna的试剂：0.1mlrna抽提液trizol或rnaisoblood或rnaisoplus或其它含有苯酚、异硫氰酸胍，8－羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等物质，能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶的物质；0.05ml的氯仿；0.015ml的异丙醇；0.0075ml的65～90％乙醇；0.01ml去rna酶及去dna酶的水；

将总rna逆转录为cdna的试剂：1μl的逆转录混合液(含有逆转录所需要的酶、rna酶抑制剂、随机的6核苷酸引物、多聚胸腺嘧啶、t重复寡核苷酸、三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物、缓冲液等)，0～10μl去rna酶及去dna酶的水；其中去rna酶及去dna酶的水用于补齐体系、溶解、稀释rna；

采用定量聚合酶链反应将cdna中的alox15基因和内参基因进行实时荧光定量pcr反应的试剂：1μl预混合液(含有pcr所需要的酶和缓冲液)、0～10μl的双蒸水(根据总体积用水补齐至10μl)，0～2μl的染料(用于进行机器的荧光补偿及矫正)，1μm的alox15基因的上游引物，1μm的alox15基因的下游引物，1μm的内参基因的上游引物，1μm的内参基因的下游引物，1μg阳性对照，1μg阴性对照，阳性对照是含有alox15的质粒，阴性对照是空质粒(质粒载体)。

实施例4：

一种用于检测慢性鼻窦炎伴鼻息肉亚型的试剂盒，包括以下试剂和工具：

从鼻息肉组织中提取rna的试剂：100μl的细胞裂解液(rl缓冲液加入50×二硫苏糖醇(dtt))、用于去除基因组dna的基因组dna吸附柱、用于收集去除基因组dna后溶液的收集管、用于富集rna的rna纯化柱、0.1ml用于去除吸附有rna的纯化柱的杂质的第一缓冲液、0.1ml用于去除rna溶液中的杂质和盐分的第二缓冲液、用于收集rna的离心管、0.01ml用于溶解rna的去rna酶及去dna酶的水；

将总rna逆转录为cdna的试剂：1μl的逆转录混合液(含有逆转录所需要的酶、rna酶抑制剂、随机的6核苷酸引物、多聚胸腺嘧啶、t重复寡核苷酸、三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物、缓冲液等)，0～10μl去rna酶及去dna酶的水；其中去rna酶及去dna酶的水用于补齐体系、溶解、稀释rna；

采用定量聚合酶链反应将cdna中的alox15基因和内参基因进行实时荧光定量pcr反应的试剂：25μl预混合液(含有pcr所需要的酶和缓冲液)、0～10μl的双蒸水(根据总体积用水补齐至10μl)，0～2μl的染料(用于进行机器的荧光补偿及矫正)，0.01μm的alox15基因的上游引物，0.01μm的alox15基因的下游引物，0.01μm的内参基因的上游引物，0.01μm的内参基因的下游引物，1μg阳性对照，1μg阴性对照，阳性对照是含有alox15的质粒，阴性对照是空质粒(质粒载体)。

实施例5：

一种用于检测慢性鼻窦炎伴鼻息肉亚型的试剂盒，包括以下试剂和工具：

从鼻息肉组织中提取rna的试剂：0.3ml的细胞裂解液(rl缓冲液加入50×二硫苏糖醇(dtt))、用于富集rna的rna纯化柱、0.5ml用于去除吸附有rna的纯化柱的杂质的第一缓冲液、0.6ml用于去除rna溶液中的杂质和盐分的第二缓冲液、4μl的去除基因组dna的重组dna酶、5μl的去除基因组dna的dna酶缓冲液、41μl去rna酶的双蒸水、用于收集rna的离心管、0.05ml用于溶解rna的去rna酶及去dna酶的水；

将总rna逆转录为cdna的试剂：2μl的逆转录混合液(含有逆转录所需要的酶、rna酶抑制剂、随机的6核苷酸引物、多聚胸腺嘧啶、t重复寡核苷酸、三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物、缓冲液等)，0～10μl去rna酶及去dna酶的水；其中去rna酶及去dna酶的水用于补齐体系、溶解、稀释rna；

采用定量聚合酶链反应将cdna中的alox15基因和内参基因进行实时荧光定量pcr反应的试剂：5μl预混合液(含有pcr所需要的酶和缓冲液)、0～10μl的双蒸水(根据总体积用水补齐至10μl)，0～2μl的染料(用于进行机器的荧光补偿及矫正)，10μmol/l的alox15基因的上游引物，10μmol/l的alox15基因的下游引物，10μmol/l的内参基因的上游引物，10μmol/l的内参基因的下游引物，1μg阳性对照，1μg阴性对照，阳性对照是含有alox15的质粒，阴性对照是空质粒(质粒载体)。

实施例6：

一种用于检测慢性鼻窦炎伴鼻息肉亚型的试剂盒，包括以下试剂和工具：

从鼻息肉组织中提取rna的试剂：2ml的细胞裂解液(rl缓冲液加入50×二硫苏糖醇(dtt))、用于去除基因组dna的基因组dna吸附柱、用于收集去除基因组dna后溶液的收集管、用于富集rna的rna纯化柱、0.7ml用于去除吸附有rna的纯化柱的杂质的第一缓冲液、0.7ml用于去除rna溶液中的杂质和盐分的第二缓冲液、用于收集rna的离心管、1ml用于溶解rna的去rna酶及去dna酶的水；

将总rna逆转录为cdna的试剂：2μl的逆转录混合液(含有逆转录所需要的酶、rna酶抑制剂、随机的6核苷酸引物、多聚胸腺嘧啶、t重复寡核苷酸、三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物、缓冲液等)，0～8μl去rna酶及去dna酶的水(根据rna量用水补齐至8μl)；其中去rna酶及去dna酶的水用于补齐体系、溶解、稀释rna；

采用定量聚合酶链反应将cdna中的alox15基因和内参基因进行实时荧光定量pcr反应的试剂：5μl预混合液(含有pcr所需要的酶和缓冲液)、0-10μl的双蒸水(根据总体积用水补齐至10μl)，0～2μl的染料(用于进行机器的荧光补偿及矫正)，1μm的alox15基因的上游引物，1μm的alox15基因的下游引物，1μm的内参基因的上游引物，1μm的内参基因的下游引物，1μg阳性对照，1μg阴性对照。

上述实施例4～6中，所用的第一缓冲液rwabuffer的生产厂家为takara公司，货号9767；第二缓冲液rwbbuffer的生产厂家为takara公司，货号9767。

本发发明实施例1～6提供的试剂盒均能够实现慢性鼻窦炎伴鼻息肉亚型的检测，现提供如下用于检测慢性鼻窦炎伴鼻息肉亚型的试剂盒的具体效果检测实验：

鼻息肉亚型检测效果实验：

实验例一：

1、实验方法：

(1)、样本的收集与处理：

随机选取78名crswnp患者采用生理盐水冲洗鼻腔后，在鼻内镜下取鼻息肉。将鼻息肉切割成直径约0.5厘米的组织，浸泡于rna稳定和储存溶液(rnalater)中，4℃短期保存，后转移入低于-20℃长期保存。

(2)、rna的提取：

步骤1：将浸泡于rna稳定和储存溶液(rnalater)中的组织称重，称取约0.01g重量的组织放于加磁珠的离心管里，置于液氮中，匀浆机上进行砸磨(3000r，5min)(或者手工研磨)。向装有组织细胞的试管中加入1mltrizol进行溶解，收集到离心管中，充分振荡，室温静置5分钟；然后加入上述rna提取试剂组的200μl氯仿(三氯甲烷)，剧烈震荡混匀，室温静置5分钟。

步骤2：12，000转/分钟，4℃，离心15分钟。

步骤3：取上清液，实际获得其体积约200μl，加入离心管，加入上述rna提取试剂组的等量(约200μl)异丙醇。混匀后静置10分钟，12000转/分钟，4℃，离心15分钟。弃上清，保留沉淀。

步骤4：加入上述rna提取试剂组的(与异丙醇等量)约200μl的75％乙醇(约150μl无水乙醇及50μl去dna酶及rna酶水的混合物)清洗沉淀，混匀。7500转/分钟，4℃，离心15分钟。弃上清，保留沉淀。

步骤5：盖紧离心管，7500转/分钟，4℃，离心2分钟。

步骤6：开盖，弃上清，静置于通风橱15分钟。

步骤7：加入上述rna提取试剂组的0.02ml无rna水解酶和无dna水解酶(rnase-free和dnase-free)的水溶解沉淀。

步骤8：利用分光光度计测量rna浓度，且od260/od280比值在1.7-2.1之间。

(3)、逆转录制备cdna：在冰上配制逆转录(rt)反应液，具体包括以下试剂：2μl的逆转录混合液(含有逆转录所需要的酶、rna酶抑制剂、随机的6核苷酸引物、多聚胸腺嘧啶、t重复寡核苷酸、三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物、缓冲液等)，不超过500ng或不超过8μl的总rna、0～8μl去rna酶及去dna酶的水(根据rna量用水补齐至8μl)；取提取的总rna和上述的逆转录反应液加入反应体系中进行逆转录反应得到cdna模板，其中，反应体系可按需求相应放大，10μl反应体系可最大使用500ng的总rna；

逆转录反应条件如下:

37℃15分钟(反转录反应)

84℃5秒(反转录酶的失活反应)

产物4℃放置。

(4)制备实时荧光定量pcr反应液：包括5μl预混合液(含有pcr所需要的酶和缓冲液)、0.2μl的机器荧光补偿及矫正剂、1ng/μlcdna或阳性对照或阴性对照、0.5μlalox15基因的上游引物、0.5μlalox15基因的下游引物、0.5μl内参基因的上游引物、0.5μl内参基因的下游引物和2.8μl的双蒸水；

(5)、实时荧光定量pcr检测：

反应条件：

第1阶段：预变性：95℃，30秒。

第2阶段：pcr反应：95℃，15秒；60℃，1分钟退火延伸，共进行40个循环；第2阶段中：熔解曲线：60℃逐渐升温至95℃，速率为0.1℃/秒，采集荧光；

反应结束后确认实时荧光定量pcr的扩增曲线如图1至图4所示，以及熔解曲线如图5至图8所示，读取alox15及gapdh的ct值，选用△ct分析法(alox15的ct值减gapdh的ct值)进行分析，采用gapdh作为内参基因。

(6)、数据分析：

步骤1：实验质控的判断：阳性对照ct值<20且阴性对照ct值>38视为实验有效，否则实验无效。

步骤2：分型的判断：目的基因的ct值减内参基因的ct值，根据roc曲线，alox15的ct值的最佳界值为1.675，若alox15的ct值≥1.675，则为非嗜酸性粒细胞型慢性鼻窦炎伴鼻息肉；若alox15的ct值＜1.675，则为典型的嗜酸性粒细胞型慢性鼻窦炎伴鼻息肉。

2、实验结果：选取的78名患者基于上述提供的试剂盒的鼻息肉亚型检测结果如表1所示：

表1本发明提供的试剂盒及组织病理方式获取鼻息肉组织的鼻息肉亚型检测结果

上述78例样本的roc曲线图如图9所示，采用本试剂盒对慢性鼻窦炎伴鼻息肉分型的预测，准确率为78.2％。

实验例二：

1、实验方法：

(1)、样本的收集与处理：

随机选取47名crswnp患者用生理盐水冲洗鼻腔后，在鼻内镜下用毛刷(copan公司产)于鼻息肉表面按压30s，旋转3-4圈，刷取息肉表面，将毛刷置于裂解液中，4℃短期保存(不超过24小时)，或转移入低于-20℃长期保存。

(2)、rna的提取：

步骤1：向装有脱落细胞的试管中加入1mltrizol进行溶解，充分振荡，室温静置5分钟，然后加入200μl氯仿(三氯甲烷)，剧烈震荡混匀，室温静置5分钟；

步骤2：12，000转/分钟，4℃，离心15分钟；

步骤3：取上清液，实际获得其体积约200μl，加入离心管，加入与氯仿等量(约200μl)的异丙醇。混匀后静置10分钟，12000转/分钟，4℃，离心15分钟。弃上清，保留沉淀；

步骤4：加入上述rna提取试剂组的等量(与异丙醇等量)约200μl的75％乙醇(约150μl无水乙醇及50μl去dna酶及rna酶水的混合物)清洗沉淀，混匀，7500转/分钟，4℃，离心15分钟，弃上清，保留沉淀；

步骤5：盖紧离心管，7500转/分钟，4℃，离心2分钟；

步骤6：开盖，弃上清，静置于通风橱15分钟；

步骤7：加入上述rna提取试剂组的0.02ml无rna水解酶和无dna水解酶(rnase-free和dnase-free)的水溶解沉淀；

步骤8：利用分光光度计测量rna浓度，od260/od280比值在1.7～2.1为好；

(3)、逆转录制备cdna：同实验例一；

(4)、制备实时荧光定量pcr反应液：同实验例一；

(5)、实时荧光定量pcr检测：同实验例一；反应结束后确认实时荧光定量pcr的扩增曲线如图10至图12所示，以及熔解曲线如图13至图15所示；

(6)、数据分析：目的基因的ct值减内参基因的ct值，根据前期试验结果，alox15的ct值的最佳界值为1.675，若alox15的ct值≥1.675，则为非嗜酸性粒细胞型慢性鼻窦炎伴鼻息肉；若alox15的ct值＜1.675，则为典型的嗜酸性粒细胞型慢性鼻窦炎伴鼻息肉；

2、实验结果：计算结果如表2所示。

表2本发明提供的试剂盒采用刷取鼻息肉表面获取鼻黏膜脱落细胞的鼻息肉亚型检测结果

由表2提供的数据结果获取到，本发明实验例二中的试剂盒对慢性鼻窦炎伴鼻息肉亚型检测的准确率为80.9％。

实验例三:

1、试验方法：

(1)、样本的收集与处理：

某患者用生理盐水冲洗鼻腔后，在鼻内镜下用毛刷(copan公司产)于鼻息肉表面按压30s，旋转3-4圈，刷取息肉表面，将毛刷置于裂解液中，4℃短期保存(不超过24小时)，或转移入低于-20℃长期保存。

(2)rna的提取：

步骤1：将基因组dna吸附柱(基因组dnaeraserspincolumn)安放到2ml的收集管(collectiontube)上；

步骤2：将含脱落细胞的裂解液(细胞裂解液)转移入到基因组dna吸附柱中；

步骤3：12，000转/分钟，离心1分钟；

步骤4：弃基因组dna吸附柱，保留2ml收集管中的滤液；

步骤5：向上述步骤4中加入300μl的70％乙醇(此时可能会出现沉淀)，使用移液枪将溶液混合均匀；

步骤6：立即将混合液(含沉淀)全部转入到rna纯化柱(rnaspincolumn)(含2ml收集管)中；

步骤7：12，000转/分钟，离心1分钟，弃滤液。将rna纯化柱放回到2ml收集管中；

步骤8：将500μl的第一缓冲液(bufferrwa)加入至rna纯化柱中，12，000转/分钟，离心30秒钟，弃滤液；

步骤9：将600μl的第二缓冲液(bufferrwb)加入至rna纯化柱中，12，000转/分钟，离心30秒钟，弃滤液。

步骤10：将rna纯化柱安置于1.5ml的无rna水解酶收集管(rnasefreecolletiontube)上，在rna纯化柱膜中央处加入50μl的无rna水解酶的蒸馏水(rnasefreedh2o)或0.1％焦碳酸二乙酯(depc)处理水，室温静置5分钟；

步骤11：12，000转/分钟离心，去rna酶及去dna酶的水洗脱rna2分钟；

步骤12：利用分光光度计测量rna浓度，od260/od280比值为2.0。

(3)、逆转录制备cdna：同实验例一；

(4)、制备实时荧光定量pcr反应液：

步骤1：配置sybrgreen1预混合液45μl；和rox:1.8μl，混匀后分为3份，分别为a.11.7μl；b.11.7μl；c.23.4μl，分别向a中加入1ng/μl阳性对照得到a溶液，b中加入1ng/μl阴性对照得到b溶液，c中加入2ng获得的cdna得到c溶液(sybrgreen1预混合液和rox均为takara公司产品，货号rr820a)；

步骤2：配置8组平行孔；

第1、2平行孔：a溶液、alox15基因的特异性引物、3.8μl灭菌双蒸水；

第3、4平行孔：b溶液、alox15基因的特异性引物、3.8μl灭菌双蒸水；

第5、6平行孔：c溶液、alox15基因的特异性引物、3.8μl灭菌双蒸水；

第7、8平行孔：c溶液、gapdh基因的特异性引物、3.8μl灭菌双蒸水；

步骤3：采用透明胶膜封板，离心，进行pcr操作。

步骤4：两步法pcr扩增标准程序：

(5)、实时荧光定量pcr检测：

反应条件：

第1阶段：预变性：95℃，30秒。

第2阶段：pcr反应：95℃，15秒；60℃，1分钟退火延伸，共进行40个循环。；

反应结束后确认实时荧光定量pcr的扩增曲线如图16所示，以及熔解曲线如图17所示，读取alox15及gapdh的ct值，选用△ct分析法(alox15的ct值减gapdh的ct值)进行分析，采用gapdh作为内参基因。

(6)、数据分析：同实验例一；

2、实验结果：阳性对照孔平均ct：16.2；阴性对照孔平均ct：39.7；样品alox15平均ct：19.4；样品gapdh平均ct：16.4；差异值：19.4-16.4为3，大于1.675，为非嗜酸性粒细胞型慢性鼻窦炎伴鼻息肉。

实验例四：

本发发明实施例1～6提供的试剂盒均能够实现慢性鼻窦炎伴鼻息肉亚型的检测，现以实施例5为例进行如下用于检测慢性鼻窦炎伴鼻息肉亚型的试剂盒的效果检测实验：

(1)样本的收集与处理：

某患者用生理盐水冲洗鼻腔后，在鼻内镜下取息肉。将息肉切割成直径约0.5厘米的组织，浸泡于rna稳定和储存溶液(rnalater)中，4℃短期保存，后转移入低于-20℃长期保存。

(2)rna的提取：

步骤1：将浸泡于rna稳定和储存溶液(rnalater)中的组织称重，称取约0.01g重量的组织放于加磁珠的离心管里，置于液氮中，匀浆机上进行砸磨(3000r，5min)(或者手工研磨)；加入0.3ml细胞裂解液，12，000转/分钟，离心15分钟

步骤2：吸取上清，加入与上清液等体积的70％乙醇(70％无水乙醇及30％depc或去rna酶及dna酶的水)，使用移液枪将溶液混合均匀；

步骤3：立即将混合液(含沉淀)全部转入到rna纯化柱(含2ml收集管)中；

步骤4：12，000转/分钟，离心1分钟，弃滤液。将rna纯化放回到2ml收集管中；

步骤5：将500μl的第一缓冲液(bufferrwa)加入至rna纯化柱中，12，000转/分钟，离心30秒钟，弃滤液；

步骤6：将600μl的第二缓冲液(bufferrwb)加入至rna纯化柱中，12，000转/分钟，离心30秒钟，弃滤液；

步骤7：dna酶i(dnasei)反应液的配制：取5μl10×dna酶i缓冲液，4μl重组dna酶i(recombinantdnasei，(无rna酶，5u/μl)，41μl无rna酶的双蒸水到新的1.5ml管(无rna酶)中，混合均匀；

步骤8：向rna纯化柱膜中央加入50μldnasei反应液，室温静置15分钟；

步骤9：向rna纯化柱膜中央加入350μl的第二缓冲液，12，000转/分钟，离心30秒钟，弃滤液；

步骤10：重复步骤6；

步骤11：将rna纯化柱重新安置于2ml收集管上，12，000转/分钟，离心2分钟；

步骤12：将rna纯化柱安置于1.5ml的无rna水解酶收集管(rnasefreecolletiontube)上，在rna纯化柱膜中央处加入50μl的无rna水解酶的蒸馏水(rnasefreedh2o)或0.1％焦碳酸二乙酯(depc)处理水，室温静置5分钟；

步骤13：12，000转/分钟离心，去rna酶及去dna酶的水洗脱rna2分钟；

步骤14：利用分光光度计测量rna浓度，od260/od280比值为2.0；

(3)逆转录制备cdna：同实验例一；

(4)制备实时荧光定量pcr反应液：同实验例三；

(5)、实时荧光定量pcr检测：

反应条件采用三步法pcr扩增标准程序：

第1阶段：预变性：95℃，2分钟；

第2阶段：pcr反应：95℃，1分钟；55℃，1分钟,72℃1分钟，共进行40个循环，最后72℃，7分钟退火延伸；

反应结束后确认实时荧光定量pcr的扩增曲线如图18所示，以及熔解曲线如图19所示，读取alox15及gapdh的ct值，选用△ct分析法(alox15的ct值减gapdh的ct值)进行分析，采用gapdh作为内参基因。

(6)数据分析：同实验例一；

2、实验结果：阳性对照孔平均ct：16.7；阴性对照孔平均ct：38.4；样品alox15平均ct：19.2；样品gapdh平均ct：16.4；差异值：为2.8，大于1.675，为非嗜酸性粒细胞型慢性鼻窦炎伴鼻息肉。

综上所述，本发明提供一种用于检测慢性鼻窦炎伴鼻息肉亚型的试剂盒，筛选采用alox15基因作为生物标志物，将其应用到试剂盒中，以实现采用试剂盒进行检测慢性鼻窦炎伴鼻息肉亚型的方法，通过试剂盒能够快速、准确、全面的针对患者鼻息肉亚型进行准确鉴别，以尽早根据鼻息肉的炎症亚型进行针对化治疗，有效指导针对慢性鼻窦炎伴鼻息肉患者的药物治疗方式及手术方式的确定，准确预估药物治疗的反应、判断预后效果。

序列表

<110>张罗

王成硕

闫冰

北京市耳鼻咽喉科研究所

首都医科大学附属北京同仁医院

<120>用于检测慢性鼻窦炎伴鼻息肉亚型的试剂盒及alox15基因作为生物标志物的应用

<130>cc18k10093ccn

<141>2018-07-03

<160>5

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>2715

<212>dna

<213>human

<400>1

gagcgaaacatctttgagcaagatgggtctctaccgcatccgcgtgtccactggggcctc60

gctctatgccggttccaacaaccaggtgcagctgtggctggtcggccagcacggggaggc120

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cgacgcctggttctgcaactggatctctgtgcagggccccggagccggggacgaggtcag300

gttcccttgttaccgctgggtggagggcaacggcgtcctgagcctgcctgaaggcaccgg360

ccgcactgtgggcgaggaccctcagggcctgttccagaaacaccgggaagaagagctgga420

agagagaaggaagttgtaccggtggggaaactggaaggacgggttaattctgaatatggc480

tggggccaaactatatgacctccctgtggatgagcgatttctggaagacaagagagttga540

ctttgaggtttcgctggccaaggggctggccgacctcgctatcaaagactctctaaatgt600

tctgacttgctggaaggatctagatgacttcaaccggattttctggtgtggtcagagcaa660

gctggctgagcgcgtgcgggactcctggaaggaagatgccttatttgggtaccagtttct720

taatggcgccaaccccgtggtgctgaggcgctctgctcaccttcctgctcgcctagtgtt780

ccctccaggcatggaggaactgcaggcccagctggagaaggagctggagggaggcacact840

gttcgaagctgacttctccctgctggatgggatcaaggccaacgtcattctctgtagcca900

gcagcacctggctgcccctctagtcatgctgaaattgcagcctgatgggaaactcttgcc960

catggtcatccagctccagctgccccgcacaggatccccaccacctccccttttcttgcc1020

tacggatcccccaatggcctggcttctggccaaatgctgggtgcgcagctctgacttcca1080

gctccatgagctgcagtctcatcttctgaggggacacttgatggctgaggtcattgttgt1140

ggccaccatgaggtgcctgccgtcgatacatcctatcttcaagcttataattccccacct1200

gcgatacaccctggaaattaacgtccgggccaggactgggctggtctctgacatgggaat1260

tttcgaccagataatgagcactggtgggggaggccacgtgcagctgctcaagcaagctgg1320

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ggtgcctaatgcaccctgcacgatgcggctgcccccgccaaccaccaaggatgcaacgct1740

ggagacagtgatggcgacactgcccaacttccaccaggcttctctccagatgtccatcac1800

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tttttcgggccctgagcctaaggctgtgctgaagaagttcagggaggagctggctgccct1920

ggataaggaaattgagatccggaatgcaaagctggacatgccctacgagtacctgcggcc1980

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ccatcacccaagccacaagctgaccccttcgtggttatagccctgccctcccaagtccca2100

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