一种烟管头草中提取的吉玛烷型倍半萜化合物及其应用的制作方法

本发明属于药物领域，具体涉及一种烟管头草中提取的吉玛烷型倍半萜carpescernolidesa化合物及其制备方法和应用。

背景技术

烟管头草(carpesiumcernuum)为菊科(compositae)天名精属的植物。入药部位为全草，辛、凉、苦。有小毒。主要存活于海拔60米～3,000米左右的地区，主要生长在山丘、荒地及山沟，分布在亚洲与欧洲等地。我国西南地区、中原地区、华北等地均有丰富物种。通过提取芳香油的方法，烟管头草常被制备为香精原料。用作民族药彝药可治疗牙痛，腮腺炎，支气管炎，哮喘，泌尿道感染，乳腺炎，毒蛇咬伤等；白药治疗痢疾，湿热内盛，肺炎，咽喉炎，腹泻，疟疾等；僳僳药治疗急性肠炎，感冒发热，疮疔肿毒，淋巴结结核等；侗药主治疖肿，九子羊。苗药可治疗面风症、淋症、各种炎症，在贵州被当做野烟叶使用，在抗菌消炎《双羊喉痹痛颗粒》成方中为君药。目前，相关文献报道中的烟管头草主要化学成分有黄酮、苯酚、甾体、木质素，三萜、倍半萜，鲜有香豆素的报道，其中具有α,β-不饱和五元内酯环的倍半萜是其主要成分，该类文献报道具有广泛的抗肿瘤活性，但其作用机制至今不明确。

在已有文献报道中，天名精属植物结构复杂，在与黔产药用烟管头草同属的植物贵州天名精中，已经发现了新颖的结构，倍半萜内酯以及倍半萜内酯二聚体类成分，同时，这些成分对白血病具有一定的选择性作用。迄今为止，现有技术中未见有从天然植物中提取吉玛烷型倍半萜carpescernolidesa及其活性的研究报道。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种烟管头草中提取的吉玛烷型倍半萜carpescernolidesa化合物及其制备方法，以及该化合物用于制备治疗肝癌药物中的应用。

本发明的目的及解决其主要技术问题是采用以下技术方案来实现的：一种烟管头草中提取的吉玛烷型倍半萜carpescernolidesa化合物，其特征在于：所述的吉玛烷型倍半萜carpescernolidesa化合物从烟管头草中分离提取得到，其结构式为(i)式：

其制备方法包括乙醇萃取，浸膏浓缩，硅胶柱层析，梯度洗脱，半制备高效液相色谱纯化，具体为：

(1)取烟管头草中干燥枝叶20kg，采用95％工业乙醇在温度为80℃下对其回流提取3次后回收乙醇醇浓缩得浸膏，浸膏用水混溶成浑浊物，经过乙酸乙酯等体积萃取、浓缩得乙酸乙酯层浸膏0.960kg；

(2)乙酸乙酯层浸膏经过300-400目硅胶柱层析，采用石油醚与丙酮体积比为60:1～0:1比例的洗脱剂梯度洗脱，点薄层板合并为7个部分：fr1–7；

(3)对步骤(2)中fr6进行进行mci柱层析，采用甲醇与水体积比为4:6～10:0比例的洗脱剂梯度洗脱，再次被分成4个亚部分：fr6a、fr6b、fr6c和fr6d，fr6b经过半制备高效液相色谱纯化得到化合物1，其中半制备高效液相色谱的流动相为乙腈:水体积比为50:50。

所述的烟管头草为贵州镇宁产烟管头草。

所述吉玛烷型倍半萜化合物carpescernolidesa在制备治疗肝癌药物中的应用。

所述化合物用作药物时，可以分开直接使用或者以药物组合物的形式使用，该药物组合物含有0.1–99％的所述化合物，其余为药用载体或赋形剂。

所述药用载体或赋形剂是一种或多种固体、半固体和液体稀释剂、填料以及药物制品辅剂。

所述药物组合物以单位体重服用量的形式使用。

所述药物组合物的剂型有：注射剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂，冲剂、喷剂、气雾剂。

所述药物组合物进行抗肝癌的治疗给药途径有：静脉注射、静脉。

本发明所公开的吉玛烷型倍半萜carpescernolidesa化合物是首次从贵州安顺镇宁产烟管头草中提取分离出来，并确定其结构式，该化合物对人肝癌细胞smmc-7721的细胞具有治疗作用，并能诱导smmc-7721细胞的凋亡，剂量依赖的促进内源ros的产生和积累、抑制了肿瘤细胞的迁移，并抑制肿瘤细胞克隆的形成，可在制备治疗肝癌的药物中得到应用，该化合物可作为治疗肝癌药物的先导性化合物。

附图说明

图1是本发明的结构式(i)式。

图2是本发明相应的¹h-nmr。

图3是本发明相应的¹³c-nmr。

图4是carpescernolidesa对smmc-7721细胞活力抑制的影响。

图5是carpescernolidesa促进smmc-7721细胞内源性ros的积累的影响。

图6是carpescernolidesa抑制smmc-7721细胞克隆的形成。

图7是carpescernolidesa抑制smmc-7721细胞迁移。

具体实施方式

实施例1：

(1)取烟管头草中干燥枝叶20kg，采用95％工业乙醇在温度为80℃下对其回流提取3次后回收乙醇醇浓缩得浸膏，浸膏用水混溶成浑浊物，经过乙酸乙酯等体积萃取、浓缩得乙酸乙酯层浸膏0.960kg；

(2)乙酸乙酯层浸膏经过300-400目硅胶柱层析，采用石油醚与丙酮体积比为60:1～0:1比例的洗脱剂梯度洗脱，点薄层板合并为7个部分：fr1–7；

(3)对步骤2中fr6进行进行mci柱层析，采用甲醇与水体积比为4:6～10:0比例的洗脱剂梯度洗脱，再次被分成4个亚部分：fr6a、fr6b、fr6c和fr6d，fr6b经过半制备高效液相色谱纯化得到化合物1，其中半制备高效液相色谱的流动相为乙腈:水体积比为50:50。

采用核磁质谱分析化合物，化合物1数据分析如下：无色四方形晶体，m.p.306-308℃，-286.98(c0.00210g/ml,meoh)，uv(meoh)λmax(logε)195(0.30)nm,ir(kbr)vmax3426，29.57，1756，1632，1456，1099cm^-1，hreimsm/z311.1488[m+h]⁺,calculatedforc16h22o6,311.1489)，¹h-nmr(400mhz,cdcl3)δ:1.25(1h,m,h-1β),2.01(1h,m,h-1α),4.39(1h,m,h-2),2.10(1h,dd,j＝2.0,11.6hz,h-3β),2.56(1h,dd,j＝2.0,11.6hz,h-3α),4.06(1h,s,h-5),1.86(1h,dd,j＝11.2,15.4hz,h-9β),2.23(1h,dt,j＝1.2,15.4hz,h-9α),1.72(1h,m,h-10),1.84(3h,s,h-13),0.93(3h,d,j＝5.6hz,h-14),1.52(3h,s,h-15).¹³cnmr(100mhz,cdcl3)δ:45.06(c-1),77.97(c-2),50.45(c-3),86.53(c-4),83.39(c-5),106.17(c-6),156.39(c-7),104.02(c-8),51.08(c-9),27.86(c-10),129.82(c-11),174.20(c-12),10.60(c-13),26.50(c-14),27.29(c-15),52.89(c-och3)。其结构及相应的¹h-nmr，¹³c-nmr见图1-3.

片剂：取所得的吉玛烷型倍半萜carpescernolidesa10mg，乳糖180mg，淀粉55mg，硬脂酸镁5mg；

制备方法：将化合物、乳糖和淀粉混合，用水均匀湿润，把湿润的混合物过筛并干燥，再过筛，加入硬脂酸镁，然后将混合物压片，每片重250mg，化合物含量为10mg。

实施例2：

安瓿剂：实施例1所得化合物carpescernolidesa2mg，氯化钠10mg；

制备方法：将化合物和氯化钠溶解于适量的注射用水中，过滤所得溶液，在无菌条件下装入安瓿瓶中。

实施例3：

胶囊剂：实施例1所得carpescernolidesa10mg，乳糖187mg，硬脂酸镁3mg；

制备方法：将carpescernolidesa与助剂混合，过筛，均匀混合，把得到的混合物装入硬明胶胶囊中，每个胶囊重200mg，活性成分为10mg。

为了进一步分析吉玛烷型倍半萜carpescernolidesa对人体肝癌细胞株(smmc-7721)的细胞具有治疗作用，并能诱导人体肝癌细胞株(smmc-7721)细胞的凋亡，并更好的用于制备治疗肝癌的药物中，将得到的吉玛烷型倍半萜carpescernolidesa对肝瘤细胞smmc-7721的抑制影响做以下实验：

1.实验材料：

96孔培养板(nest)，deme培养液(bi公司生产)，胎牛血清(bi公司生产)，0.25％胰酶(trypsin)为美国hyclone产品，四甲基偶氮唑蓝(3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl-tetrazoliumbromide；mtt)购自sigma公司，二甲基亚砜(dimethylsulfoxide；dmso)为广州化学试剂公司生产，allegrax-15r台式离心机(美国贝克曼公司)，共聚焦显微镜(gehealthcare公司)，ts100双目倒置相差生物显微镜(日本尼康公司)，酶标仪(美国thermo公司)。选用的肿瘤细胞株为：人体肝癌细胞株(smmc-7721)。药物用dmso(二甲基亚砜)溶解后配成储存液，-20℃保存备用。

2.smmc-7721用含10％胎牛血清及混合后再加100u/ml青霉素和100mg/ml链霉素的dmem培养液，至37℃、5％co2恒温饱和湿度的培养箱中进行培养。当细胞密度达到80％左右时进行传代，选取对数生长期细胞进行实验。将肿瘤细胞消化后转移到离心管后，1000r/min离心5min，弃上清后加入新的培养液，在96孔培养板每孔中加入5×104个细胞，各药物分别设置4个复孔，并设置空白组与对照组，于37℃，5％co2恒温饱和湿度条件下培养过夜后加入不同浓度的化合物处理，dmso处理组作为阴性对照，继续培养72h后，加入终浓度为1mg/ml的mtt，孵育4h后，用多功能酶标仪在490波长下测定od值，计算ic50。按下列公式计算细胞增殖抑制率(此部分实验重复3次)：

生长抑制率(％)＝(空白组吸光度平均值-加药组吸光度平均值)/空白组吸光度平均值×100％

3.抑制肿瘤细胞克隆形成实验

在6孔板中每孔加入分散均匀的smmc-7721细胞200个，待过夜培养，细胞贴壁后，加入不同浓度的化合物处理细胞。37c孵育16天，待肉眼可见阴性对照组生长出明显的克隆时，移去培养液，加入1mlr250染料。室温染色1h后，pbs清洗三次，即可拍照统计克隆数目。

4.tanswell小室检测体外侵袭能力

消化smmc-7721细胞。终止消化后离心弃去培养液，(用pbs洗1－2遍)，用无血清培养基重悬。调整细胞密度至5×105/ml。取细胞悬液100l加入transwell小室。37℃细胞培养箱培养24小时。注意，在放入小室的同时应接种细胞，避免将小室置于下层培养班后在接种。下层培养液中为含有fbs的dmem，小室中培养液为无fbs的dmem。培养过夜后取出transwell小室，弃去孔中培养液，用无钙的pbs洗2遍，甲醇固定15分钟。用考马斯亮蓝r250室温染色30min。之后用pbs洗涤3次，观察迁移到小室膜下边的细胞，分别取上下左右及中间五个视野计数，拍照统计数据。

5.试验结果

从图4-7结果表明，carpescernolidesa可以剂量依赖性的抑制人体肝癌细胞株(smmc-7721)细胞活力的作用，剂量依赖的促进内源ros的产生和积累、抑制了肿瘤细胞的迁移，并能抑制肿瘤细胞克隆的形成。得出结论：carpescernolidesa对人体肝癌细胞株(smmc-7721)具有较强的抑制作用，并能诱导smmc-7721细胞的凋亡。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，任何未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。