本发明涉及生物技术领域，特别涉及cdc42信号通路在激活原始卵泡生长发育中的应用。
背景技术
哺乳动物卵巢是包括人类女性在内的雌性动物生殖繁衍所必须的生殖器官，卵巢主要具有两个功能：支持卵母细胞发育成熟和产生女性激素。从出生到发育期、育龄期，最后到围绝经期和老年期，卵巢经历了一系列变化，这些变化直接影响生殖功能、性特征及心理。
而在女性生殖细胞发育过程中，原始卵泡又是卵巢最基本的功能单位。原始卵泡由单个休眠的卵母细胞及包裹在其周围的一层扁平前颗粒细胞共同构成。原始卵泡的数量即原始卵泡库在哺乳动物出生前后确定下来，其初始数量是在早期发育阶段被决定并加以固定的，并且成年后原始卵泡库不可更新。在卵巢中，休眠的原始卵泡需要经过一个被称为卵泡激活的过程方可进入后续发育，随后经历初级卵泡、次级卵泡和有腔卵泡的发育阶段，最终排出成熟的卵子，受精后发育为子代个体。因而，原始卵泡的数量决定了雌性哺乳动物卵巢中可利用生殖资源的数量，原始卵泡正常的激活发育则决定了可利用生殖资源的质量。在原始卵泡激活发生后，卵母细胞的体积增长数百倍，周围的颗粒细胞迅速增殖，由最初的单层扁平颗粒细胞发育至数层立方状的上千个细胞。随后当卵泡发育至有腔卵泡阶段，其生长受到垂体分泌的促卵泡激素fsh的刺激进而发育至最终排卵阶段。最终在排卵前促黄体激素lh峰的作用下，卵母细胞排出，颗粒细胞则发生黄体化为受精卵的发育做准备。
在哺乳动物的卵巢中，原始卵泡库中的原始卵泡不断被激活而进入生长期，以人为例，女性原始卵泡库建立初期，大约有500万左右的原始卵泡，在正常的成年女性每个月大约有1000个原始卵泡进入生长期，但在女性一生中排出的成熟卵子只有区区数百个，其利用率非常低。而当原始卵泡库中的原始卵泡不足1000个时，卵巢将不再排卵，即此时女性进入绝经期。如果能对卵巢中的原始卵泡加以利用，将会有巨大的应用价值。并且在一些病理条件下，原始卵泡不能正常激活和发育，如原发性卵巢功能不全和卵巢早衰等疾病导致育龄女性不孕不育，因而找到一种有效的调节原始卵泡激活的方法具有重要的意义。
现有研究表明pi3k信号通路和mtor信号通路在原始卵泡的激活中扮演着重要的角色。现有的原始卵泡激活剂为pi3k信号通路激活剂、pten抑制剂和mtor信号通路激活剂，但这些试剂激活原始卵泡需要时间较长，致使病人多次手术增加痛苦。都需将皮质块取出，体外冷冻保存，当病人恢复一段时间后，将取出的皮质块进行体外激活处理后移植回病人体内，原始卵泡逐级发育为成熟卵子后取出卵子，体外受精后移植回病人体内进行后续发育。同时，目前常用的pi3k信号通路激活剂或mtorc1信号通路激活剂，普遍为化学合成分子，并且由于pi3k信号通路激活剂或mtorc1信号通路与癌症具有直接关系，其安全性有待进一步评估。因而，找到一种可快速激活原始卵泡的生物天然试剂和一种新的激活方法来避免病人遭受多次手术的痛苦有巨大的现实意义。不仅可以为不孕不育的女性患者提供多种治疗方案，减少手术给患者带来的伤害；并降低处理后的潜在并发症产生。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提供cdc42信号通路在激活原始卵泡生长发育中的应用，通过快速激活或过表达cdc42进而高效激活原始卵泡生长发育；
本发明的另外一个发明目的在于提供cdc42激活剂在体外以非治疗诊断目的激活原始卵泡生长发育的应用，以及在制备体内或体外激活原始卵泡生长发育的试剂中的应用；
本发明的另外一个目的在于提供一种具体的体内或体外激活原始卵泡生长发育的试剂；
本发明的另外一个目的在于提供过表达cdc42载体在体外以非治疗诊断目的激活原始卵泡生长发育的应用，以及在制备体内或体外激活原始卵泡生长发育的试剂中的应用。
本发明采用cdc42通路抑制剂ml141(sigma公司)和zcl278(selleck公司)处理小鼠卵巢并继续培养，然后将卵巢固定并进行组织学检测，结果显示，cdc42通路抑制剂的处理可导致原始卵泡的激活显著抑制，卵巢中cdc42活性显著下降，卵泡计数结果表明cdc42活性抑制后原始卵泡激活比率明显下调；
上述结果预示cdc42通路可能与原始卵泡激活生长有密切联系，因此本发明构建cdc42过表达载体并转染至小鼠卵巢中进行过表达处理，免疫印迹检测表明cdc42过表达显著提升了cdc42蛋白在卵巢中的表达量，并且卵泡计数结果表明cdc42过表达处理后原始卵泡激活比率明显上调，同时组织学检测表明cdc42过表达处理后激活卵泡显著增多。上述两方面实验结果证明，cdc42信号通路在激活原始卵泡生长中存在明显直接的正向作用，即可通过快速激活或过表达cdc42进而高效激活原始卵泡生长。
基于上述信号通路的研究结论，本发明提供了cdc42激活剂在制备激活原始卵泡生长试剂中的应用和/或在体外以非治疗目的激活原始卵泡生长的应用。
其中，本发明所提出的在体外以非治疗目的激活原始卵泡生长的应用是为了进一步研究卵泡后续的生长发育过程，用于基础研究所用，同时由于在体外研究，无法达到治疗目的。
由于cdc42信号通路在激活原始卵泡生长中作用的确立，则所有本领域已知的cdc42激活剂都可快速激活cdc42并进一步激活原始卵泡生长，而在本发明具体实施方式中，本发明通过cn02(cytoskeleton公司)和egf(sigma公司)两种具体的激活剂进行了验证实验。
应用cdc42通路激活剂在体外处理小鼠卵巢组织，发现生长卵泡比原始卵泡的比率显著大于对照组，且原始卵泡卵母细胞激活后下游标志分子foxo3a出核，卵母细胞活化关键通路pi3k下游标志分子foxo3a和akt的磷酸化明显上调，表明原始卵泡激活比率明显提升。
而在体内处理小鼠卵巢组织，发现卵巢含有更多的生长卵泡，初级卵泡所占的比例明显高于对照组，且体内处理试剂和方式对小鼠无不良影响，并具有促进雌性小鼠生育的作用。
根据上述技术效果，本发明对应提出了一种激活原始卵泡生长的试剂，包括cdc42激活剂，所述cdc42激活剂的浓度为50-200ng/ml，优选为100ng/ml。
在体外处理的激活试剂中，除核心的cdc42激活剂外还包括激活细胞培养液和/或其他已公开的原始卵泡激活药物；在本发明具体实施方式中，所述激活细胞培养液为dmem/f12培养液，其可优选加入its和抗生素，抗生素可选择青霉素和链霉素。更为具体地，所述试剂以dmem/f12为母液，内含100倍的its、10units/ml青霉素和10□g/ml链霉素，以及50-200ng/ml的cdc42激活剂；
在体内处理的激活试剂中，除核心的cdc42激活剂外还包括生物水溶胶和/或其他原始卵泡激活药物，其中生物水溶胶可选择为透明质酸凝胶，更具体地为基质水溶胶matrigel或宫腔用交联透明质酸凝胶。
基于前述信号通路的研究结论，本发明另一方面还提供了cdc42过表达载体在制备激活原始卵泡生长试剂中的应用和/或在体外以非治疗目的激活原始卵泡生长的应用。其中的在体外以非治疗目的激活原始卵泡生长的应用仍是为了进一步研究卵泡后续的生长发育过程，用于基础研究所用，同时由于在体外研究，无法达到治疗目的。
作为优选，所述cdc42过表达载体以市售的可过表达载体为基础，通过基因工程技术接入cdc42编码基因，所述过表达载体为psicor或plvx-ires-zsgreenl。
根据cdc42过表达载体的应用，本发明还提供了一种包括cdc42过表达载体的激活原始卵泡生长的试剂
根据本发明提供的实验能够明确的看到，cdc42激活剂以及cdc42过表达载体通过cdc42信号通路，激活了原始卵泡，可应对卵泡激活发育能力低下的问题。故cdc42激活剂和/或cdc42过表达载体可应用在制备治疗卵泡储备不足引起的疾病的药物中，所述卵泡激活发育能力低下引起的疾病为卵巢早衰或衰老女性卵巢功能障碍。
由以上技术方案可知，本发明采用cdc42通路抑制剂以及过表达载体证实了快速激活cdc42可激活原始卵泡，并促进其发育，为原始卵泡激活和发育提供了一种全新的cdc42信号通路，可将cdc42激活剂以及cdc42过表达载体应用在激活原始卵泡生长发育试剂中和/或在体外以非治疗目的激活原始卵泡生长中。
附图说明
图1所示为抑制cdc42活性导致原始卵泡激活受阻的结果；其中，a为卵母细胞ddx4和细胞核hoechst的免疫荧光结果，b为cdc42表达的免疫印迹结果，c为抑制cdc42后卵巢内激活卵泡数量的结果，横坐标为处理组别，control为对照组，ml141和zcl278为抑制cdc42的实验组，纵坐标为激活的卵泡数量；
图2所示为卵巢过表达cdc42促进原始卵泡激活的结果；其中，a为cdc42表达的免疫印迹结果，b为过表达cdc42后卵巢内激活卵泡的占比结果，横坐标为处理组别，control为对照组，cdc42-oe为过表达cdc42的实验组，纵坐标为激活卵泡的占比，c为卵母细胞ddx4和细胞核hoechst的免疫荧光结果；
图3所示为新生小鼠卵巢经egf培养后的免疫荧光结果；
图4所示为新生小鼠卵巢经egf培养后的免疫印记结果；
图5所示为新生小鼠卵巢经egf培养和肾被膜移植后的苏木精染色结果；
图6所示为新生小鼠卵巢经egf培养和肾被膜移植后的卵泡统计结果，横坐标为处理组别，control为对照组，egffor0.5h为体外培养的实验组，左图纵坐标为生长卵泡的占比，右图纵坐标为卵泡总数的结果；
图7所示为成年小鼠卵巢经egf培养后的免疫印记结果；
图8所示为成年小鼠卵巢经egf培养和肾被膜移植后的卵泡统计结果，横坐标为处理组别，control为对照组，egffor0.5h为体外培养的实验组，纵坐标为生长卵泡的占比；
图9所示为卵巢内注射基质水溶胶存留时间的结果；
图10所示为小鼠卵巢内注射含egf的基质水溶胶的苏木精染色结果；
图11所示为小鼠卵巢内注射含egf的基质水溶胶一周后的卵泡统计结果，左图横坐标为卵泡级别，primordial为原始卵泡，primary为初级卵泡，secondary为次级卵泡，antral为有腔卵泡，纵坐标为各级卵泡的占比，右图横坐标为处理组别，control为对照组，100ng/ml和1000ng/ml的不同浓度处理的实验组，纵坐标为卵泡总数的结果；
图12所示为小鼠卵巢内注射含egf的基质水溶胶两周后的卵泡统计结果，左图横坐标为卵泡级别，primordial为原始卵泡，primary为初级卵泡，secondary为次级卵泡，antral为有腔卵泡，纵坐标为各级卵泡的占比，右图横坐标为处理组别，control为对照组，100ng/ml和1000ng/ml的不同浓度处理的实验组，纵坐标为卵泡总数的结果；
图13所示为小鼠卵巢内注射含egf的基质水溶胶后的生殖力检测结果，左图为处理小鼠生育力的检测结果，横坐标为小鼠的周龄，纵坐标为平均每只雌鼠所生仔数，a表示egf处理组，b表示对照组；右图为处理小鼠所生子代体重结果，横坐标为称重的周龄，纵坐标为体重。
具体实施方式
本发明公开了cdc42信号通路在激活原始卵泡生长发育中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述激活剂、过表达载体及其相关应用已经通过实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述激活剂、过表达载体及其相关应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
在本发明具体实施例中，涉及到对比试验，各试验组除了应有的区别外，其余试验环境和原材料等均保持一致。
以下就本发明所提供的cdc42信号通路在激活原始卵泡生长发育中的应用做进一步说明。
实施例1：本发明所述激活原始卵泡生长发育的试剂(体外)
溶液i：基本激活细胞培养液；
溶液ⅱ：dmem/f12培养液为母液，内含its；
cdc42通路激活剂：egf；
本发明所述试剂可将溶液i、溶液ii和cdc42通路激活剂分别包装，在一同包装在同一包装盒内，其中溶液i和cdc42通路激活剂混合后成为激活原始卵泡试剂，溶液ii在体外激活原始卵泡时用作清洗用；
上述原始卵泡体外激活试剂制备方法，溶液i：基本激活细胞培养液配制方法如下：dmem/f12为母液，内含100倍的its、10units/ml链霉素和10□g/ml青霉素；溶液ii的配制方法如下：dmem/f12培养液为母液，还含有100倍的its，cdc42通路激活剂(egf)工作浓度为50-200ng/ml，具体应用时采用100ng/ml。
试剂使用方法如下：
取小鼠卵巢与5ml溶液ii中，用溶液ii反复清洗三次以上。
取1ml溶液i与试剂混合，用溶液i配制成10ml激活细胞培养液，浓度为50-200ng/ml。
将小鼠卵巢培养于含有细胞培养小室的24-孔板(millipore)，在培养孔中加入400l激活细胞培养液，培养0.5小时，培养条件为37℃，5％co2；
0.5h后，激活过程完成，组织可用于后续操作。
实施例2：本发明所述激活原始卵泡生长发育的试剂(体内)
cdc42通路激活剂：egf；
水溶性凝胶：基质水溶胶matrigel或宫腔用交联透明质酸凝胶，本实施例使用基质水溶胶matrigel。
本发明所述试剂可将cdc42通路激活剂和水溶性凝胶分别包装，在一同包装在同一包装盒内，使用时cdc42通路激活剂(egf)浓度为50-200ng/ml，溶于水溶胶中，具体应用时采用100ng/ml。
试剂使用方法如下：
1)在无菌条件下，将试剂充分混合于可吸收宫腔用交联透明质酸凝胶；
2)在手术过程中，将混有试剂的凝胶通过体内注射方式涂抹在卵巢表面；
3)体内处理后，定期检测卵巢内卵泡的发育状况，带有成熟卵泡后自然受孕或者辅助生殖。
实施例3：cdc42信号通路对原始卵泡激活和生长发育的影响
1、cdc42抑制实验
实验动物：实验所用动物为新生6天c57小鼠。
抑制剂：cdc42通路抑制剂ml141购置于sigma公司，zcl278购置于selleck公司。
利用两种cdc42抑制剂ml141与zcl278对体外培养的新生小鼠卵巢进行处理3天，随后利用组织切片及生殖细胞特异性免疫荧光染色检测卵巢中原始卵泡发育状况，并采用免疫印迹方式检测处理后卵巢中的cdc42活性变化，并通过卵泡计数统计卵泡激活状况。结果见图1。
由图1可知，抑制cdc42活性导致原始卵泡激活受阻。a中结果表明利用两种cdc42抑制剂ml141与zcl278对体外培养的新生小鼠卵巢进行处理，可导致原始卵泡的激活显著抑制；b中结果说明抑制剂处理后卵巢cdc42活性显著下降；c中卵泡计数结果表明cdc42活性抑制后原始卵泡激活比率明显下调。
2、cdc42过表达实验
过表达载体构建
cdc42的过表达载体的引物序列如下：
正向引物，5’-ctcgagatgcagacaattaagtgtgttg-3’；
反向引物，5’-ggatcctagcagcacacacctgcggctc-3’。
cdc42基因mrna序列中cds(编码区)序列，以胚胎期小鼠卵巢的cdna为模板利用上述引物扩增目的片段，通过琼脂糖凝胶电泳确定扩增的目的基因片段的大小，通过琼脂糖凝胶回收并测量回收后的dna浓度，根据选择的酶切位点选用不同的酶做双酶切并对酶切产物进行纯化。将纯化后的酶切产物连接到载体，将连接后的产物转化到感受态细胞中，根据实验要求吸取不同体积的已转化的感受态细胞，加到含有相应抗生素的lb琼脂培养基上，过夜培养12-16h。
向离心管中加入1ml的lb液体培养基，向培养基中加入抗生素，挑单菌落放入到培养基中，200rpm/min，37℃摇床上摇8-10h。通过菌液pcr检测dna片段大小是否符合预期的大小。之后通过测序的方法确定目的基因的序列与设计的完全相符，将合格的菌液添加50％的甘油溶液至终浓度为25％，-80℃冻存，通过无内毒质粒大提的方法获得过表达载体并转染小鼠卵巢用于激活卵泡。
过表达载体通过转染的方式对体外培养的新生小鼠卵巢进行处理4天，后利用组织切片及生殖细胞特异性免疫荧光染色检测卵巢中原始卵泡发育状况，并采用免疫印迹方式检测处理后卵巢中的cdc42表达变化，并通过卵泡计数统计卵泡激活状况。
由图2结果可知，卵巢过表达cdc42促进原始卵泡激活。a中结果表明通过cdc42过表达载体的转染，对体外培养的新生小鼠卵巢进行cdc42过表达处理，免疫印迹检测表明cdc42过表达显著提升了cdc42蛋白在卵巢中的表达量。b中卵泡计数结果表明cdc42过表达处理后原始卵泡激活比率明显上调；c中组织学检测表明cdc42过表达处理后激活卵泡显著增多。
综合两方面的结果可以证明，cdc42信号通路对激活原始卵泡并促进生长发育有正向相关性。
实施例4：cdc42通路激活剂体外促进小鼠原始卵泡的激活和发育
采用实施例1的试剂和使用方法对新生6天小鼠(c57小鼠)的全卵巢培养以及35日龄小鼠(c57小鼠)卵巢进行处理并检测，结果见图3-8；
1、新生6天小鼠的实验
新生6天的小鼠卵巢用cdc42通路激活剂egf短时间处理0.5小时并培养12小时后，将卵巢固定并进行卵母细胞激活标志分子的免疫荧光检测。如图3，左侧为对照，右侧为激活后的卵巢。结果表明egf处理后可致使原始卵泡中卵母细胞的foxo3a出核比例显著提升。
同时，如图4，westernblot结果显示foxo3、akt的磷酸化明显上调，说明原始卵泡激活。
将激活剂处理0.5小时的新生6天卵巢移植到受体鼠肾被膜，2周后取出组织，如图5，左侧为对照组，右侧为激活后的卵巢。而后对原始卵泡和生长卵泡的数量和比率进行统计，如图6，结果发现处理组的生长卵泡比原始卵泡的比率大于对照组，并且对照的和处理组的卵泡总数无显著差异。说明cdc42通路激活剂egf的短时间处理对新生6天的小鼠原始卵泡有激活作用。
2、35日龄小鼠实验
将出生35天的小鼠卵巢切成4块，用cdc42通路激活剂egf处理0.5小时并培养12小时，如图7，westernblot结果显示foxo3、akt的磷酸化明显上调，说明原始卵泡激活。将激活剂处理0.5小时的出生35天卵巢移植到受体鼠肾被膜，1周后取出组织，对其进行石蜡切片和he染色。而后对原始卵泡和生长卵泡的数量和比率进行统计，如图8，结果发现处理组的生长卵泡比原始卵泡的比率大于对照组。说明cdc42通路激活剂egf的短时间处理对出生35天的小鼠原始卵泡有激活作用。
实施例5：cdc42通路激活剂体内促进小鼠原始卵泡的激活和发育
采用实施例2的试剂和使用方法对4周龄或6周龄c57小鼠，通过手术方式将水溶性凝胶显微注射于卵巢囊，结果见图9-13；
6周小鼠卵巢囊注射基质水溶胶后，检测凝胶吸收情况，如图9，在不同时间点收样检测，实验表明凝胶可较长时间存在于卵巢囊中，是合适的卵巢局部给药药物载体。
对4周雌性小鼠卵巢囊注射含有cdc42通路激活剂egf的基质水溶胶，分别在注射后1周和注射后2周收取卵巢，对卵巢组织进行连续切片，观察卵巢内各级卵泡的情况，如图10，发现含有cdc42激活剂egf的处理组小鼠卵巢含有更多的生长卵泡。统计卵巢内卵泡的数量，计算生长卵泡占总卵泡的比值后发现，在处理1周后，如图11，处理组的初级卵泡所占的比例明显高于对照组。在处理2周后，如图12，差异主要体现在次级卵泡。并对6周小鼠卵巢囊注射含有egf的基质胶后，小鼠生育及发育后续情况检测，如图13，实验表明卵巢囊注射含有egf的基质胶无不良影响，并具有促进雌性小鼠生育的作用。说明cdc42通路激活剂egf利用水溶基质胶为载体体内注射的方式，对4周小鼠的原始卵泡有激活作用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。