本发明涉及具有特异标志免疫细胞扩增,属于细胞免疫领域。
背景技术：
肿瘤免疫治疗就是通过重新启动并维持肿瘤-免疫循环，恢复机体正常的抗肿瘤免疫反应，从而控制与清除肿瘤的一种治疗方法。包括单克隆抗体类免疫检查点抑制剂、治疗性抗体、癌症疫苗、细胞治疗和小分子抑制剂等。过继性细胞免疫治疗根据其发展历程依次为自体淋巴因子激活的杀伤细胞(lymphokine-activatedkiller,lak)、自体肿瘤浸润性淋巴细胞(tumorinfil-tratinglymphocytes,til)、自然杀伤细胞(naturalkillercell,nk)、细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-inducedkiller,cik)、细胞毒性t细胞(cytotoxictlymphocyte,ctl)以及经基因修饰改造的t细胞(car-t、tcr-t)。这些细胞疗法获得的淋巴细胞均需通过体外扩增，但临床试验效果均为取得满意的治疗效果。
当前研究认为免疫细胞存在免疫抑制分子，包括程序性死亡受体1(pd-1，programmeddeath1)，细胞毒性t淋巴细胞抗原4（cytotoxict-lymphocyteantigen4,ctla-4）等。pd-1(programmeddeath1)程序性死亡受体-1：pd-1是表达在t细胞表面的一种重要的免疫抑制跨膜蛋白。pd-1主要限制慢性炎症、感染或癌症中的t细胞活性，pd-1有两个配体，pd-l1和pd-l2。在肿瘤的微环境中，肿瘤细胞能够表达pd-l1或者pd-l2。癌细胞通过配体联接到t细胞的pd-1蛋白上。当配体与pd-1联接以后，t细胞抗肿瘤的功能受到抑制。研究表明通过pd-1抗体将阻断pd-1与pd-l1受体的结合，激活淋巴细胞抗肿瘤的活性。pd1抗体对多种肿瘤起作用，经fda批准的适应症已经超过十种。研究发现抑制pd1蛋白表达的淋巴细胞具有明显的抗肿瘤活性。当前获得这些淋巴细胞技术主要应用基因工程方法，限制在临床应用。
本发明是从外周血、免疫器官以及肿瘤组织获得的淋巴细胞应用体外细胞因子联合方法，体外扩增pd1阴性ｔ淋巴细胞。该方法未见研究报道与专利发明。该方法获得pd1阴性ｔ淋巴细胞可能将为抗肿瘤免疫治疗提供一种新的免疫治疗细胞。
技术实现要素：
本发明提供的是一种体外扩增pd1阴性ｔ淋巴细胞的方法。该方法是将从外周血或组织来源的淋巴细胞在细胞因子白介素2与白介素15联合作用下扩增培养，经流式检测，该淋巴细胞的表型为pd1阴性ｔ淋巴细胞，占90%以上。该技术结合其他免疫细胞扩增技术可能为抗肿瘤免疫治疗提供一种新的免疫治疗细胞。
本发明采取技术方案如下：
1.外周血、免疫器官与肿瘤组织等获取淋巴细胞。
2.分离获取的淋巴细胞置于培养基内进行培养。
3.培养系统内加入细胞因子白介素２与白介素１５。
4.天更换培养基并加入白介素２与白介素１５。
5.21天后，取淋巴细胞进行流式细胞术分析，测定培养细胞表型。
实例1
一、实验实施具体流程
（一）小鼠脾淋巴细胞获得
1.断颈处死小鼠（balb/c），浸入75%的乙醇中浸泡2分钟。
2.在超净台中剪开小鼠的腹部外皮，大头针固定，剪开小鼠的腹腔，用镊子取出小鼠脾脏。
3.在100mm培养皿中放入5ml1640基础培养基，将小鼠脾脏放入200μml滤网中，进行研磨，用培养基不断吹打，直至完全分离。
4.把悬有脾脏细胞的培养基缓慢转移到装有淋巴细胞分离液的15ml离心管中。
5.水平离心机2000转离心20分钟。
6.吸出淋巴细胞层，加入5ml1640培养基洗涤一次，1500转离心10分钟。沉淀为获取小鼠单个核细胞。
（二）淋巴细胞培养扩增
1.将获得单个核细胞以1×106/ml加入到细胞培养瓶，含有小鼠脾细胞培养基，加入刀豆蛋白a(c7642,sigma,usa)浓度为50ng/ml。将上述细胞置于37℃，5%二氧化碳培养箱内培养。
2.培养48小时后，取细胞培养上清，1200转离心10分钟后，计数细胞，取部分细胞进行流式细胞仪检测cd3+与pd1表达，剩余细胞以1×106/ml加入到细胞培养瓶，加入含有小鼠白介素2，终浓度为200ng/ml，小鼠白介素15，终浓度为,20ng/ml的培养基。将上述细胞置于37℃，5%二氧化碳培养箱内培养。
3.培养72小时后，更换培养基。培养方法如步骤2.
4.培养72小时后，细胞传代培养。培养方法如步骤2.
5.培养21天后，收集细胞，计数，取部分细胞进行cd3+与pd1表型的流式细胞仪检测。
二、实施效果：
1.细胞扩增
细胞经过21天扩增，细胞数由原来的1×107扩增至1.5×109，增加150倍左右。
2.流式细胞仪检测
细胞扩增前cd3+细胞数占细胞总数的70%左右，pd1+阳性细胞数为40%左右，而经过扩增后cd3+细胞数占细胞总数的90%左右，pd1+阳性细胞数为1%左右。