一种诱导干细胞定向软骨分化的方法与流程

本发明属于组织工程技术领域，具体涉及一种诱导干细胞定向软骨分化的方法。

背景技术：

关节软骨具有缓冲机械冲击，减轻关节间摩擦，增加关节适应性等作用，其轻微的损伤将导致骨关节炎（oa），由于关节软骨是无神经，无血管的组织，因此，其自我修复能力非常差。目前修复软骨损伤的方法有多种，但各有缺陷，都不能很好的解决这个难题。而且，软骨细胞被细胞外基质包裹，外源性的药物或各种因子都很难对它起作用。因此，关节软骨损伤修复仍是医学难题。

近年来，组织工程的快速发展，提出了一些治疗策略，以求能够通过种子细胞（多采用干细胞）、生物材料、细胞因子等的相互作用进行软骨修复。目前，用于传送生长因子以有效诱导干细胞定向软骨分化的常用办法有：1）外源性添加蛋白类生长因子，不过蛋白类的生长因子价格昂贵并且在体内不稳定，容易被蛋白酶分解，缺乏长期稳定性。2）通过设计及制备生物材料，对生长因子进行负载与控释，但负载过程与条件会对大分子生长因子的特性产生一定的影响。3）通过非病毒载体或病毒载体把生长因子的基因导入种子细胞中，从而可持续表达所需的生长因子。不过非病毒载体虽然可安全操作，但转染效率一直不够理想；而病毒载体虽然转染效率高，但转染过程对种子细胞会有一定的伤害，其安全性仍具争议。

技术实现要素：

为了克服上述现有技术的不足，本发明提出了一种诱导干细胞定向软骨分化的方法，该方法可持续提供稳定活性的生长因子，能防止生长因子被蛋白酶分解，避免基因转染过程中对干细胞可能产生的伤害，从而令干细胞有效进行软骨分化。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

本发明提出一种诱导干细胞定向软骨分化的方法，包括以下步骤：

s1、通过pcr方法在转化生长因子tgf-β3序列两端加上xhol/noti识别位点，然后利用dna重组技术把tgf-β3序列插入到腺病毒载体，构建携带tgf-β3的腺病毒载体，扩增至>10⁹ifu/ml后冻存备用；

s2、软骨细胞的分离和培养：软骨细胞取自猪股骨髁软骨，具体方法为：先将刚宰杀的猪股骨清洗干净，以75%酒精进行消毒，去除多余的软组织（注意避免损伤关节面），然后将关节软骨切下，切成2mm²左右，最后加入浓度为1mg/ml的ii型胶原酶［以高糖dmem培养基（high-glucosedulbecco’smodifiedeagle’smedium）配制］在37℃环境中持续消化6-8小时。收集消化液，以1500rpm的转速离心5分钟，弃上清，用软骨细胞培养液（cm）重悬后移至150cm²培养瓶中培养，2天后换液，并观察细胞贴壁情况，以后每3天换一次液，待细胞长至融合度为70-80%时进行细胞传代，先用2.5g/l胰酶和0.2g/ledta进行消化，待细胞突起逐渐收缩、细胞变圆、细胞间距增大时终止消化，离心后按1：3进行传代培养，传至3代后冻存备用；

其中，软骨细胞培养液（cm）采用高糖dmem配制，包含20%fetalbovineserum（胎牛血清），0.1mmnonessentialamino（非必要氨基酸），0.01m4-(2-hydroxyethyl)-piperazine-1-ethanesulfonicacid（4-（2-羟乙基）哌嗪-1-乙磺酸），0.4mmproline（脯氨酸），0.05%vitaminc（维生素c），10,000units/mlpenicillin（青霉素），10,000ug/mlstreptonycin（链霉素）。

s3、将atdc5细胞传至3代后冻存备用；

s4、将步骤s2中的软骨细胞复苏后用胰酶消化下来，将软骨细胞移入t75培养瓶中，加入10mlcm，过夜后吸走cm，加入5ml无血清高糖dmem，再将步骤s1中携带tgf-β3的腺病毒加入培养瓶中，反应2小时后，吸走培养液，换10ml新鲜cm，至此将步骤s1中携带tgf-β3的腺病毒转染到软骨细胞中；

s5、共培养：将atdc5细胞和步骤s4中转染后的软骨细胞进行混合，加入海藻酸钠溶液，配置成一定细胞密度的细胞悬液，用枪头将该细胞悬液快速打入cacl2溶液中使其生成细胞凝胶，然后将细胞凝胶置于软骨诱导液中进行培养，直至完成定向软骨分化过程。

其中，软骨诱导液采用高糖dmem配制，包含1%its1premix（its1预混液，corning，货号354351），100nmdexamethasone（地塞米松），50μg/mlascorbicacid2-phosphate（抗坏血酸2-磷酸），100μg/mlsodiumpyruvate（丙酮酸钠），40μg/mlproline（脯氨酸），100u/mlpenicillin（青霉素），100μg/mlstreptomycin（链霉素）。

优选的，所述猪股骨髁软骨为4到8个月大的猪股骨髁软骨。

优选的，步骤s3中所述的atdc5细胞采用f12培养基［含0.5%fbs（胎牛血清）和1%penicillin-streptomycin青链霉素（双抗）］进行传代培养。

优选的，步骤s4中携带tgf-β3的腺病毒的moi为100。

优选的，所述atdc5细胞和转染后的软骨细胞以3:1的比例进行混合。

优选的，所述细胞悬液的细胞密度为6×10⁶个/ml。

优选的，所述海藻酸钠溶液的质量分数为1.0~1.5%，所述cacl2溶液的摩尔浓度为100~110mm。

优选的，所述细胞凝胶在培养过程中，每三天更换一次软骨诱导液培养。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明基于软骨细胞与干细胞的共培养体系，利用共培养体系巧妙地使软骨细胞与干细胞分工合作，采用腺病毒载体把转化生长因子tgf-β3导入软骨细胞，经转染的软骨细胞向干细胞提供持续的、局部的和过表达的tgf-β3，刺激干细胞定向软骨细胞分化，使tgf-β3不需要外源添加，由转染后的软骨细胞提供，从而防止生长因子被蛋白酶分解，并避免基因转染过程中对干细胞可能产生的伤害，保持干细胞更高的存活率与更好的软骨分化的能力。另外，将软骨细胞与干细胞共培养的方式，有助于干细胞在软骨细胞条件培养液（除了有软骨诱导液外，还有由软骨细胞在培养过程中分泌的一些细胞因子等）中进行定向软骨分化，对生长因子的诱导表现得更敏感，更有助于软骨外基质的分泌。并且能通过软骨细胞的凋亡及时终止生长因子的传送。

附图说明

图1为腺病毒转染软骨细胞后成功转染的细胞显示绿色荧光；

图2为腺病毒转染软骨细胞后成功转染的细胞在一周内分泌tgf-β3的曲线图；

图3为atdc5细胞与转染后的软骨细胞共培养体系形成的细胞凝胶；

图4为共培养过程中细胞凝胶的细胞活性检测结果（cck-8细胞增殖曲线）；

图5为共培养过程中软骨特异基因（aggrecan与ii型胶原）的表达水平（q-pcr结果）；

其中，cartilage是天然软骨，作为阳性对照用。p4是第四代软骨细胞，其代次与参加共培养的软骨细胞一样，作为阴性对照。

图6为共培养过程中培养液中tgf-β3的释放情况；

图7为共培养过程中定向软骨分化标志物sox9的表达情况（westernblot结果）；

图8为共培养过程中软骨细胞外基质蛋白的表达情况（组织切片结果）。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

实施例1将携带tgf-β3的腺病毒转染到软骨细胞中

（1）构建携带转化生长因子tgf-β3的腺病毒载体，

购买adeno-xtmviratraktmzsgreen1expressionsystem2试剂盒，通过pcr方法在转化生长因子tgf-β3序列两端加上xhol/noti识别位点，然后利用dna重组技术把tgf-β3序列插入到腺病毒载体（绿色荧光蛋白腺病毒载体），构建携带tgf-β3的腺病毒载体（ad-t3），ad-t3扩增至>10⁹ifu/ml后冻存备用。具体的构建方法参照以下文献：hao,j.h.,yao,y.c.,varshney,r.r.,wang,l.c.,prakash,c.,li,h.,wang,d.a.,genetransferandlivingreleaseoftransforminggrowthfactor-beta3forcartilagetissueengineeringapplications,tissueengineeringpartcmethods,14(2008),4:273-280。

（2）软骨细胞的分离和培养：软骨细胞取自猪股骨髁软骨，具体方法为：先将刚宰杀的猪股骨清洗干净，以75%酒精进行消毒，去除多余的软组织（注意避免损伤关节面），然后将关节软骨切下，切成2mm²，最后加入浓度为1mg/ml的ii型胶原酶在37℃环境中持续消化8小时。收集消化液，以1500rpm的转速离心5分钟，弃上清，用软骨细胞培养液（cm）重悬后移至150cm²培养瓶中培养，2天后换液，并观察细胞贴壁情况，以后每3天换一次液，待细胞长至融合度为80%时进行细胞传代，先用2.5g/l胰酶和0.2g/ledta进行消化，待细胞突起逐渐收缩、细胞变圆、细胞间距增大时终止消化，离心后按1：3进行传代培养，传至3代（p3）后冻存备用；

（3）将p3软骨细胞复苏后用胰酶消化下来，得到第四代软骨细胞（p4），将软骨细胞（p4）移入t75培养瓶中，加入10mlcm，过夜后吸走cm，加入5ml无血清高糖dmem，再将moi为100携带tgf-β3的腺病毒加入培养瓶中，反应2小时后，吸走培养液，换10ml新鲜cm，至此将步骤s1中携带tgf-β3的腺病毒转染到软骨细胞中。于转染后24小时，观察绿色荧光蛋白的表达情况以及tgf-β3在一周内的表达情况，结果见图1和图2。

由图1可以看出，腺病毒转染软骨细胞后一天即可观察到明显的绿色荧光；由图2可以看出，腺病毒转染软骨细胞后一周内，tgf-β3的表达量呈先增后降的趋势（后期稳定在1ng/ml上下，实验结果证明能有效促软骨分化）。以上数据证实，携带tgf-β3的腺病毒已成功转染软骨细胞，并有效表达tgf-β3。

实施例2atdc5细胞与转染后的软骨细胞共培养体系（命名为3a1c）的培养过程观察以及定向软骨分化的检测

（1）从abgent(sandiego)公司购买atdc5细胞（该细胞公认为可代替干细胞作模型细胞），采用f12培养基［含0.5%fbs（胎牛血清）和1%penicillin-streptomycin青链霉素（双抗）］将atdc5细胞传至3代后冻存备用；

（2）将atdc5细胞及转染后的软骨细胞消化后收集，计数，按3:1的比例混匀后，加入1.2%的海藻酸钠溶液，制备得到细胞密度为6×10⁶个/ml的细胞悬液。以特制枪头吸取50ul上述细胞悬液，将其快速打入102mm的cacl2溶液中使其形成细胞凝胶（结果图3），10min后用长勺将细胞凝胶捞出置于24孔板上，每孔一粒，每孔内加入1ml软骨诱导液，每三天更换一次培养液。分别于第1、7、14、28、36、42天各取一个细胞凝胶进行cck8检测细胞活性（结果见图4）；第14、28及42天取细胞凝胶提取rna并逆转录为cdna，检测软骨特异基因的表达水平（结果见图5）；于第1、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42天收集培养基测定生长因子的释放（结果见图6）；培养到42天后，取样进行westernblot检测或者组织切片后进行组织学检测（结果见图7和图8）。

实验过程中设置两组只含有atdc5细胞的对照组，一组培养基中外源性添加10ng/mltgf-β3（命名为art），一组以不添加10ng/mltgf-β3的软骨诱导液为培养基（命名为a）。

其中，在检测软骨特异基因的表达水平实验时，以天然软骨（cartilage）作为阳性对照，以第四代软骨细胞（p4）作为阴性对照。

如图3的结果所示，用枪头吸取50ul海藻酸钠混合细胞的悬液快速打入氯化钙溶液后所形成的细胞凝胶呈微球状，微球形态良好，在培养过程中保持完整。如图4的结果所示，3a1c共培养组的细胞从实验之初便逐渐增殖，到第28天时达到高峰，为开始时的3.5倍，而单纯atdc5的两组细胞（art和a）增殖能力明显不足，尤其是没有添加生长因子的实验组（a），呈逐渐下降的趋势。如图5的结果所示，3a1c共培养组中软骨特异基因［aggrecan（聚蛋白多糖）与ii型胶原］的表达明显高于单纯atdc5的两组（art和a），而且表达水平在第42天还高于天然软骨细胞。如图6的结果所示，经携带tgf-β3的腺病毒转染的软骨细胞，在培养过程中能有效释放tgf-β3，释放量在培养的第3天达到高峰，然后迅速下降，此后保持一个低水平直到实验结束（维持1ng/ml左右）。如图7的结果所示，3a1c共培养组出现明显的sox9条带，表明共培养组的atdc5细胞已定向软骨分化。如图8的结果所示，h&e染色（苏木精-伊红染色法）结果可见到3a1c组有更多具“陷窝”结构的软骨细胞，而a组的细胞含量很少，art组介于两者之间；safranino染色（番红o染色法）显示软骨细胞外基质gag（软骨糖胺多糖）的沉积情况，图中可见3a1c组有大量的红染区，而art组可见少量，a组几乎看不到红染区；typeiicollagen染色（ii型胶原免疫组染色法）结果表明，在3a1c组中，可以见到细胞周围有大量褐色ii型胶原沉积，art组亦可见少量，但a组几乎没有；综上可见，3a1c组的软骨细胞外基质相比其他两组，明显分泌得更多。

由以上的分析可见，采用腺病毒载体把转化生长因子tgf-β3导入软骨细胞，将软骨细胞与干细胞进行共培养，此过程中，经转染的软骨细胞能向干细胞提供持续的、局部的和过表达的tgf-β3，刺激干细胞定向软骨细胞分化，使tgf-β3不需要外源添加，可以防止生长因子被蛋白酶分解，并避免基因转染过程中对干细胞可能产生的伤害，保持干细胞更高的存活率与更好的软骨分化的能力。

以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。。