本发明涉及工程菌领域，特别是指一种枯草芽孢杆菌甘油激酶突变基因glpk及其应用。
背景技术
甘油分子包含有较高的碳含量（52.8%），和高还原性（还原力是葡萄糖的两倍），能够产生更高得率的还原性化合物，因此可以做为微生物发酵工业的一种廉价碳源。微生物发酵甘油可以生产不同的化学品，例如1,3-丙二醇、磷酸二羟丙酮、1,2-丙二醇、丙酸、2,3-丁二醇、乳酸、甲酸、醋酸、乙醇、丁酸、丁醇、琥珀酸、丙酮酸、磷酸烯醇式丙酮酸等化学品。以细菌为宿主菌的基因工程菌具有发酵周期短、原料要求简单、成熟的基因工程技术等优点。在芽孢杆菌属中，包括枯草芽孢杆菌（bacillussubtilis）在内的许多菌株具有可靠的安全性。作为模式菌株，目前对枯草芽孢杆菌生理生化特性及遗传背景已经有了比较深入的了解，相关的分子生物学方法和基因操作技术都比较成熟，也有利于通过理性代谢工程及系统生物学手段来选育高产菌种。
由于枯草芽孢杆菌对于甘油利用存在严谨的调控机制，因此对甘油利用效率不高。胞外甘油在甘油运输协助蛋白（glpf）的帮助下通过协助扩散的方式进入胞内，经过甘油激酶（glpk）的atp磷酸化作用，甘油转化为甘油-3-磷酸。并进一步在甘油-3-磷酸脱氢酶（glpd）的催化下生成二羟丙酮磷酸进入糖酵解途径。而glpf、glpk、glpd等基因的表达则受着dna水平和rna水平上的复杂而严谨调控，因此如何提高甘油代谢途径中重要酶活性成为解决问题关键之一。本发明发现了一种定点突变获得的甘油激酶突变酶，具有提高酶活的优点，可以大幅度提升菌株利用甘油水平。目前，对于采用枯草芽孢杆菌为宿主构建甘油利用工程菌株，尚未有枯草芽孢杆菌甘油激酶突变基因glpk（g810t）用于甘油快速利用菌种的选育的报道。
技术实现要素：
本发明提出一种枯草芽孢杆菌甘油激酶突变基因glpk及其应用，解决了现有技术中枯草芽孢杆菌利用甘油的技术问题。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种枯草芽孢杆菌甘油激酶突变基因glpk，所述突变基因glpk的碱基序列如seqidno：1所示。
所述突变基因glpk编码的氨基酸序列如seqidno：2所示。
一种含有枯草芽孢杆菌甘油激酶突变基因glpk的工程菌的制备方法，步骤如下：
（1）以b.subtilis168基因组为模版、分别以引物对m270i-f-f和m270i-f-b以及引物对m270i-b-f和m270i-b-b为引物进行扩增、经胶回收得到上游同源臂m270i-f片段和下游同源臂m270i-b片段；
（2）上游同源臂m270i-f片段经thermofastdigestbglii和xhoi双酶切回收后与质粒pss连接、转化得到质粒pss-m270i-f；
（3）下游同源臂m270i-b片段经thermofastdigestsali和kpni双酶切回收后与质粒pss-m270i-f连接、转化得到质粒pss-m270i-fb；
（4）将质粒pss-m270i-fb通过spizizen转化法导入枯草芽孢杆b.subtilis168δupp中，经验证得含有枯草芽孢杆菌甘油激酶突变基因glpk的工程菌。
所述步骤（1）中引物对m270i-f-f和m270i-f-b的序列如seqidno：3和seqidno：4所示；引物对m270i-b-f和m270i-b-b的序列如seqidno：5和seqidno：6所示。
所述的含有枯草芽孢杆菌甘油激酶突变基因glpk的工程菌在产核黄素方向的应用。
本发明的有益效果在于：
一、本发明所构建的包含有枯草芽孢杆菌甘油激酶突变基因glpk（g810t）的工程菌生物安全，遗传背景清晰、包含的突变基因glpk（g810t）可以大幅提高枯草芽孢杆菌利用甘油水平，可在甘油基本盐摇瓶培养条件下，提高菌株比生长速率20%以上。
二、本发明所构建的枯草芽孢杆菌工程菌可大幅提高枯草芽孢杆菌合成核黄素的能力，在摇瓶发酵条件下，可提高核黄素积累水平40%以上。
附图说明
图1为为工程菌株b.subtilis168δupp和b.subtilism270i生长曲线对比图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一、原材料及使用方法
本发明所用到的原始菌株b.subtilis168来源为bgsc（bacillusgeneticstockcenter，http://www.bgsc.org/）。本发明所用到的原始质粒puc18购买于生工生物工程（上海）股份有限公司（http://www.sangon.com/）。
本发明所用到的核黄素标准品从sigma公司（http://www.sigmaaldrich.com/sigma-aldrich）购买，所用限制性内切酶、去磷酸化酶、dna连接酶等分子生物学试剂从thermo公司购买（http://www.thermoscientificbio.com/fermentas）。所用其他生化试剂从生工生物工程（上海）股份有限公司购买（http://www.sangon.com/）。
二、培养基的配制
lb液体培养基配方为：10g/l蛋白胨，5g/l酵母提取物，10g/lnacl，调节ph至7.5。0.1mpa压力下灭菌20min。lb固体培养基配方为：在lb液体培养基中加入琼脂粉（终浓度20g/l），0.1mpa压力下灭菌20min。
m9甘油基本盐液体培养基配制方法为：配制1mol/lmgso4、1mol/lcacl2、200ml蒸馏水中溶解na2po4·7h2o12.8g、kh2po43.0g、nacl0.5g、nh4cl1.0g，配制5×m9盐溶液，121℃灭菌15分钟备用。按照以下配比配制1lm9液体培养基：200ml5×m9盐溶液，2ml1mol/l的mgso4，20ml20%的甘油溶液，0.1ml1mol/l的cacl2，无菌条件下加灭菌双蒸水至1000ml，即为m9甘油基本盐液体培养基。m9甘油基本盐固体培养基是在m9甘油基本盐液体培养基中加入琼脂粉（终浓度20g/l），0.1mpa压力下灭菌20min。对于基本盐培养基，每100ml培养基需加入1ml0.5%色氨酸以满足枯草芽孢杆菌工程菌株生长需求。
5fu负筛选培养基配方见表1：
表15fu负筛选培养基配制表
表1中成分的百分比浓度均为质量体积百分比。
表1中的10×spizizen基本盐成分为：2.0g/l(nh4)2so4，18.3g/lk2hpo4，6.0g/lkh2po4，12.0g/lc6h5na3o7.2h2o，ph7.2，0.1mpa压力下灭菌20min。
表1中的1000×微量元素成分为：27.0g/lfecl3•6h2o，2.0g/lzncl2•4h2o，2.0g/lcacl2•2h2o，2.0g/lna2moo4•2h2o，1.9g/lcuso4•5h2o，0.5g/lh3bo3ph7.2，0.1mpa压力下灭菌20min。
其中，抗生素筛选平板为加入抗生素的lb固体培养基，氯霉素筛选平板为添加有5μg/ml（终浓度）氯霉素。
实施例
步骤1：无抗生素标记筛选枯草芽孢杆菌系统出发菌株b.subtilis168δupp和基础操作质粒pss的构建
本发明中所用到的枯草芽孢杆菌出发菌株b.subtilis168δupp来源于b.subtilis168，基础操作质粒pss来源于puc18，二者详细构建过程可参考shi,t.,wang,g.,wang,z.,fu,j.,chen,t.,zhao,x.,2013.establishmentofamarkerlessmutationdeliverysysteminbacillussubtilisstimulatedbyadouble-strandbreakinthechromosome.plosone.8,e81370。
本发明对该基础操作质粒pss的构建方法以及抗性基因的选择不做限定。
步骤2：工程菌株b.subtilism270i构建过程
（1）向菌株b.subtilis168δupp基因组上无痕引入基因突变glpk（g810t）操作流程如下：
利用m270i-f-f、m270i-f-b为引物，b.subtilis168基因组为模版，使用kod-plus高保真dna聚合酶扩增得到大小为789bp的上游同源臂m270i-f。利用m270i-b-f、m270i-b-b为引物，b.subtilis168基因组为模版，使用kod-plus高保真dna聚合酶扩增得到大小为836bp的下游同源臂m270i-b。m270i-f的pcr片段经切胶回收后，使用thermofastdigestbglii和xhoi双酶切，连接、转化质粒pss后得到质粒pss-m270i-f。m270i-b的pcr片段经切胶回收后，使用thermofastdigestsali和kpni双酶切，连接、转化质粒pss-m270i-f后得到这质粒pss-m270i-fb。将测序结果正确的质粒通过spizizen转化法导入枯草芽孢杆b.subtili168δupp中，用含有氯霉素lb固体培养基中筛选重组成功的阳性克隆，并用菌落pcr验证。挑出的转化子接种于5mllb液体培养基中，200rpm震荡培养6h（od600约为2），并在五氟尿嘧啶基本培养基上挑出菌落，使用引物m270i-f-f、m270i-b-b进行菌落pcr和测序验证，得到glpk（g810t）正确引入的阳性菌株b.subtilism270i。其中枯草芽孢杆菌甘油激酶突变基因glpk（g810t）和甘油激酶突变基因glpk（g810t）所编码的氨基酸序列分别用seqidno：1和seqidno：2所示。
效果实施例
工程菌株b.subtilism270i和b.subtilis168δupp生长能力对比
1)采用lb培养基，37℃，240rpm条件下，将菌体培养至对数生长期中期。
2)取适量的菌体培养液，6000rpm，4℃离心1min。弃上清后，采用0.9%nacl溶液洗涤菌体，重复一次。
3)按初始od=0.02接种量转洗涤后的菌液至50mlm9甘油基本盐液体培养基，37℃，200rpm进行菌体培养，并测定菌株生长曲线（od600）。
从两株工程菌株生长对比曲线可以看出，相对于出发菌株b.subtilis168δupp，甘油激酶突变基因glpk（g810t）提高了菌株b.subtilism270i在甘油基本盐培养基上比生长速率提升11%以上（m270i比生长速率μ=0.358），延滞期缩短2~4个小时，最大菌体生物量提升16%以上（见图1），说明该突变基因可以大幅度提升菌株b.subtilism270i利用甘油的能力，具有较好的应用前景。
本发明的菌株的构建，其步骤的前后顺序不限定，本领域的技术人员按本发明公开的内容达到本发明的目的均属于本发明的保护范围。
本发明中的菌株代号如b.subtilism270i等是为了方便描述，但不应理解为对本发明的限定。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
<110>郑州轻工业学院
<120>一种枯草芽孢杆菌甘油激酶突变基因glpk及其应用
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<211>496
<212>prt
<213>人工序列
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