一种测定碱性磷酸酶的比率型荧光探针及其合成方法与应用与流程

本发明属于酶活性检测技术领域，涉及一种用于检测细胞内源性碱性磷酸酶的方法策略。更具体地，涉及一种比率型荧光探针及其合成方法和它在检测碱性磷酸酶中的应用。

背景技术

碱性磷酸酶(alp)是最重要和最有效的水解酶之一，广泛存在于各种哺乳动物组织中，如肝脏、骨骼和肠道。它可以催化各种底物(包括蛋白质、核酸和碳水化合物)的水解和转磷酸化。此外，越来越多的证据表明血液中异常升高的碱性磷酸酶水平与各种疾病如癌症、心脏病、骨骼疾病和肝脏疾病有关。因此，开发特异性和灵敏检测碱性磷酸酶活性的探针在临床诊断中有重要的应用。

现今对碱性磷酸酶的检测主要依赖色谱法、电化学发光法、电化学法、表面增强共振拉曼散射方法、比色法和荧光法等手段，上述方法大多需要复杂的仪器，限制了其实际应用。在诸多方法中，光谱分析手段具有较高的灵敏度和选择性，对仪器设备的门槛要求较低，并有较为广阔的商用价值，是目前具有应用价值的碱性磷酸酶分析方法。

因此，如何提供一种高灵敏度、高选择性的荧光探针是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明针对现有技术中存在的问题，提供一种测定碱性磷酸酶的比率型荧光探针。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种测定碱性磷酸酶的比率型荧光探针，所述荧光探针的结构式为：

所述比率型荧光探针以苯并噻唑环作为荧光报告基团，可以通过肉眼对目标物碱性磷酸酶进行可视化鉴别，也可进入活细胞中对细胞内源性碱性磷酸酶进行测定。

本发明的另一目的是提供一种测定碱性磷酸酶的比率型荧光探针的合成方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种测定碱性磷酸酶的比率型荧光探针的合成方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

(1)以甲醇为反应介质，以邻氨基苯硫醇和5-甲基水杨醛为反应物，以碘单质为反应氧化剂，常温反应3～5小时至反应液呈深黄褐色，经抽滤，甲醇洗三次得到灰白色固体2-(2'-羟苯基-5'-甲基)苯并噻唑；

(2)以三氟乙酸作为反应溶剂，将步骤(1)得到的2-(2'-羟苯基-5'-甲基)苯并噻唑加入六次甲基四胺甲酰化，于100℃反应12～24小时，反应完全冷却后用氢氧化钠溶液调节ph为中性，抽滤，滤饼干燥得到甲酰化产物；

(3)向甲酰化产物中加入无水乙醇作为溶剂，再加入吡啶盐，以哌啶作为催化剂，加热回流5～6小时得到黑紫色溶液，经减压蒸馏获得黑紫色固体，纯化即得具有红色荧光的化合物；

(4)将步骤(3)得到的具有红色荧光的化合物溶于干燥的二氯甲烷中，加入三氯氧磷和三乙胺，常温反应结束后减压蒸馏得到固体物质，加冰水水解，析出固体，纯化得到本发明的测定碱性磷酸酶的比率型荧光探针。

以上所述的比率型荧光探针的合成路线，如下所示：

通过采用上述技术方案，本发明的有益效果如下：

本发明以合成的比率型荧光探针用以碱性磷酸酶的识别检测，因其结构上含有碱性磷酸酶的识别位点磷酸基团，该荧光探针具有极好的水溶性，在水溶液中发出黄绿色荧光，在碱性磷酸酶的存在下，此探针去磷酸化后形成具有红色荧光的产物，因此可以通过肉眼对目标物碱性磷酸酶进行可视化鉴别。

优选的，步骤(1)中所述碘单质、邻氨基苯硫醇、5-甲基水杨醛、甲醇的摩尔比为1：(1.5～2.5)：(1.5～2.5)：(15～20)。

优选的，步骤(2)中所述2-(2'-羟苯基-5'-甲基)苯并噻唑、六次甲基四胺、三氟乙酸的摩尔比为1：(2～3)：(15～30)。

优选的，步骤(3)中所述甲酰化产物、吡啶盐、哌啶、无水乙醇的摩尔比为1：(1.5～2.5)：(3～5)：(15～30)。

优选的，步骤(4)中所述具有红色荧光的化合物、三氯氧磷、三乙胺、干燥的二氯甲烷的摩尔比为1：(1.5～2.5)：(3～5)：(15～30)。

针对合成荧光探针反应，发明人通过创造性试验得到各种原料配比，其中三氯氧磷和三乙胺的配比尤为重要，其中三乙胺影响到反应的酸碱调控，关系到反应能否顺利进行；而三氯氧磷的含量直接影响到反应进行的程度，关系到反应完全及过量处理的步骤。

另外，发明人分别通过核磁共振氢谱、碳谱、磷谱、红外光谱等手段进行表征，表明所述比率型荧光探针合成成功。

优选的，合成的比率型荧光探针的最佳反应浓度为10μmol·l^-1。

需要说明的是，在检测过程中，若使用的荧光探针的浓度高于10μmol·l^-1，其荧光会自猝灭，无法达成比率型检测的实验设想；若使用的荧光探针浓度低于10μmol·l^-1，探针自身发光及其响应信号较弱，在一定程度上可能削弱检测灵敏度。

优选的，碱性磷酸酶与比率型荧光探针反应的最适条件是在37℃下于ph为8的tris-hcl缓冲溶液中共同孵育60分钟。

该比率型荧光探针在tris-hcl缓冲溶液体系中能够高效选择性识别碱性磷酸酶，且对碱性磷酸酶具有很高的灵敏度。

本发明还有一个目的，就是提供比率型荧光探针在检测碱性磷酸酶中的具体应用。

优选的，所述碱性磷酸酶在人宫颈癌细胞中过渡表达，合成的荧光探针可进入活细胞对细胞内源性碱性磷酸酶进行检测。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明提供了一种比率型荧光探针的合成方法及其检测细胞内源性碱性磷酸酶的应用。本发明公开的荧光探针含有碱性磷酸酶的识别基团，由于其本身在水溶液中具有黄绿色荧光，在加入碱性磷酸酶后，探针的磷酸基团被切割，形成的化合物具有红色荧光，通过探针黄绿色荧光强度降低，去磷酸化后的化合物红色荧光强度增强这一过程的对比，达到比率型检测碱性磷酸酶的目的。并且本发明所公开的用于检测碱性磷酸酶的方法策略极具市场应用与推广价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明荧光探针的¹hnmr图谱。

图2附图为本发明荧光探针的¹³cnmr图谱。

图3附图为本发明荧光探针的³¹pnmr图谱。

图4附图为本发明荧光探针与碱性磷酸酶反应前后的紫外吸收(a)及荧光发射(b)光谱。

图5附图为相对吸光度值a496nm/a358nm与碱性磷酸酶活性的线性响应曲线。

图6附图为相对荧光强度值i514nm/i650nm与碱性磷酸酶活性的线性响应曲线。

图7附图(a)为本发明荧光探针对人宫颈癌细胞内源性碱性磷酸酶的荧光成像,图(b)为本发明荧光探针对矾酸钠预处理的人宫颈癌细胞内源性碱性磷酸酶的荧光成像。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例公开了一种高灵敏度、高选择性的测定碱性磷酸酶的比率型荧光探针及其合成方法与应用。

为更好地理解本发明，下面通过以下实施例对本发明作进一步具体的阐述，但不可理解为对本发明的限定，对于本领域的技术人员根据上述发明内容所作的一些非本质的改进与调整，也视为落在本发明的保护范围内。

本发明公开了一种测定碱性磷酸酶的比率型荧光探针，所述荧光探针的结构式为：

下面，将结合具体实施例，对本发明的技术方案进行进一步的说明。

实施例1

荧光探针的合成

1.合成步骤：

(1)将邻氨基苯硫醇(10mmol,1.25g)和5-甲基水杨醛(10mmol,1.36g)加入到10ml甲醇中，加入碘单质(5mmol,1.26g)，常温反应3小时至溶液呈深黄褐色，抽滤，用甲醇洗三次得到灰白色固体2-(2'-羟苯基-5'-甲基)苯并噻唑，反应过程如式(1)所示，产率为31.86％；

(2)将步骤(1)得到的2-(2'-羟苯基-5'-甲基)苯并噻唑(1.7mmol，0.41g)溶于15ml三氟乙酸中，加入六次甲基四胺(5.0mmol，0.55g)，于100℃下反应24小时，冷却至室温，用氢氧化钠溶液调节ph为中性，抽滤除溶剂，滤饼用去离子水洗3次，干燥得到黄色固体甲酰化产物，反应过程如式(2)所示，产率为75.2％；

(3)将甲酰化产物(0.5mmol，0.1312g)溶于10ml无水乙醇，加入吡啶盐(0.5mmol，0.1245g)，加入哌啶(0.005mmol，0.5ml)作为催化剂，加热回流5小时得到黑紫色溶液，经减压蒸馏得到黑紫色化合物，反应过程如式(3)所示，产率为33.74％；

(4)将得到的黑紫色化合物(0.2mmol，0.1g)溶于10ml干燥的二氯甲烷中，常温下搅拌，滴加三氯氧磷(2mmol，186μl)和三乙胺(4.4mmol，0.93ml)，反应2小时后减压蒸馏，加冰水(30ml)搅拌水解，得到比率型荧光探针的黄色纯产物，反应过程如式(4)所示，产率为44.54％。

2.测试分析：

图1为探针的¹hnmr图谱，具体谱峰值为：δ8.90(d,j＝5.2hz,2h),8.32(d,j＝16.3hz,1h),8.15(d,j＝6.3hz,2h),8.09(d,j＝7.9hz,2h),8.03(d,j＝8.1hz,1h),7.89(s,1h),7.53(t,j＝7.7hz,1h),7.49(d,j＝16.5hz,1h),7.45(t,j＝7.6hz,1h),4.53–4.45(m,2h),2.40(s,3h),1.51(t,j＝8.4hz,3h)，其与探针基团相对应，可证明探针合成成功。

图2为探针的¹³cnmr图谱，具体谱峰值为：δ163.62,153.35,152.24,146.61,144.60,135.93,135.75,135.05,132.55,129.80,129.55,127.95,126.66,125.67,125.59,124.46,124.15,122.98,122.38,55.81,20.70,16.57碳的数目及出峰位置与探针一一对应，进一步证实该探针结构正确。

图3为探针的³¹pnmr图谱，只有一个位于-5.01的磷信号峰，说明化合物仅含一个磷酸酯结构。综上从¹hnmr、¹³cnmr和³¹pnmr证明了该探针的化学结构。

实施例2

荧光探针在缓冲溶液中与碱性磷酸酶反应能力测试

将合成的荧光探针制成2.0mmol·l^-1的水溶液，取10μl加入到含有2mltris-hcl缓冲溶液(10mmol·l^-1，ph＝8)的离心管中，加入1μl碱性磷酸酶(0.2u·μl^-1)，使其最终浓度为0.1u·ml^-1，60分钟后检测紫外吸收光谱和荧光发射光谱变化。

图4为荧光探针与碱性磷酸酶反应前后的紫外吸收(a)和荧光发射(b)光谱。其中，a表示荧光探针(10μmol·l^-1)，b表示荧光探针(10μmol·l^-1)和碱性磷酸酶(0.1u·ml^-1)的混合液。

由图4(a)可知，反应前后溶液的最大紫外吸收光谱由358nm转移至310nm，且在496nm处出现新的吸收峰。同时，通过图4(b)发现，由于碱性磷酸酶的加入，最大荧光发射峰由514nm移至650nm，且在476nm处出现新的发射峰。

由此说明碱性磷酸酶可与荧光探针反应，经过去磷酸化形成具有红色荧光的化合物。

实施例3

荧光探针对碱性磷酸酶最低检测限的测定

在37℃时，通过紫外吸收和荧光发射光谱，根据碱性磷酸酶对荧光探针的滴定实验，通过3sb/s计算，得到荧光探针对碱性磷酸酶的最低检测限达0.095mu·ml^-1，说明合成的荧光探针对碱性磷酸酶的检测灵敏度高，表明该探针在水溶液中对碱性磷酸酶高效检测方面有潜在的应用价值。并且通过图5表明荧光探针的相对吸光度值a496nm/a358nm与alp的浓度在0～70mu·ml^-1范围内线性相关(r²＝0.99059)，通过图6表明荧光探针的相对荧光强度i514nm/i650nm与alp的浓度在0～60mu·ml^-1范围内线性相关(r²＝0.98638)。

实施例4

荧光探针对于人宫颈癌细胞内源性碱性磷酸酶的检测

将本发明用于hela细胞中内源性碱性磷酸酶的荧光成像应用，具体步骤如下：将荧光探针(10μmol·l^-1)加入到育有hela细胞的培养液中，在二氧化碳培养箱中培养30分钟后用共聚焦显微镜进行成像。作为对照，首先在hela细胞中加入矾酸钠抑制剂，抑制细胞内碱性磷酸酶的活性，孵育30分钟后，加入荧光探针(10μmol·l^-1)培养30分钟，用共聚焦显微镜观察荧光成像情况。

图7为荧光探针对细胞内源性碱性磷酸酶的荧光成像图。其中图7(a)为探针浓度为5μmol·l^-1加入到hela细胞中培养30分钟后的荧光成像图。图7(b)为先加入矾酸钠抑制剂(100μmol·l^-1)到hela细胞中培养30分钟，再加入5μmol·l^-1探针到细胞中培养30分钟后荧光成像图。

由图7可以看出，当hela细胞内的碱性磷酸酶被抑制剂矾酸钠所抑制后，探针几乎不显荧光。当不含抑制剂时，探针与细胞中的内源性碱性磷酸酶特异性反应产生红色荧光。结果表明此荧光探针可用于检测细胞内源性碱性磷酸酶。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。