一种pCasPA/pACRISPR双质粒系统及其应用的制作方法

本发明涉及一种pcaspa/pacrispr双质粒系统及其应用。

背景技术：

铜绿假单胞菌是一种常见的革兰氏阴性菌，它广泛存在于环境中，例如泥土、水、植物和人体中，会引起糖尿病、严重创伤、囊肿纤维化、癌症和艾滋病等患者的感染，是一种常见的临床病原菌。绿脓杆菌的感染很难治疗，这很大程度上是由于其低渗透外膜屏障与耐药结节细胞分化(resistance-nodulation-celldivision，rnd)家族多药耐药外排泵的协同作用，使得铜绿假单胞菌具有较强的多重耐药性。近年来，铜绿假单胞菌的感染情况日益严重，因此迫切需要寻找新型药物靶标和开发新型药物。基因组编辑和基因筛选技术是研究细菌致病性和抗药性的重要手段，对发现新的药物靶标具有重要意义。目前使用的传统铜绿假单胞菌基因组编辑技术主要基于同源重组双交换的方法。但是该方法操作过程复杂，效率低下，是一件非常费时费力的工作，大大限制了基因的研究工作。

近年来最新开发的crisrp/cas9系统是一种新型基因组编辑技术，极具革新生命体中基因组修饰与突变技术的潜力。该系统源于细菌自身的免疫系统，用来抵御病毒等外源dna的侵袭。它主要是由一种核酸内切酶cas9和一种介导rna(sgrna)特异性结合形成复合物，通过sgrna与基因组dna碱基互补配对实现靶向识别并精确定位到基因组特定位点。然后cas9蛋白切割基因组dna造成双链断裂。结合基因重组酶，通过人为提供外源dna修复模板进行同源重组修复，就可以快速准确地在基因组的任何位置实现包括基因敲除以及基因插入在内的靶向编辑。

crispr/cas9基因组编辑技术已经在哺乳动物细胞以及一些模式生物中，例如斑马鱼、酵母、大肠杆菌等，成功实现了高效的基因组编辑。但到目前为止，还没有在铜绿假单胞菌中进行基因组编辑的报道。因此通过对crispr/cas9体系的工程化和改造，使其能够应用于铜绿假单胞菌中的基因组编辑，将极大简化铜绿假单胞菌的遗传学操作，为后续基因生物学功能研究，药物靶标发现，新型药物设计以及基因治疗提供有力的工具。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种pcaspa/pacrispr双质粒系统及其应用。

为了达到上述目的，本发明提供了一种pcaspa/pacrispr双质粒系统，其特征在于，包含pcaspa质粒和pacrispr质粒中的至少一种。

优选地，所述的pcaspa质粒能够表达cas9蛋白和λ-red重组系统，所述的pacrispr质粒能够表达sgrna。

优选地，所述的pcaspa质粒包含包含λ-red重组系统基因片段、cas9蛋白基因片段以及parab启动子dna片段，cas9蛋白和λ-red重组系统都受到阿拉伯糖启动子parab的调控。

优选地，所述的pcaspa质粒包含sacb基因片段。

优选地，所述的pacrispr质粒包含xbai和xhoi酶切位点，用来插入修复模板。

优选地，所述的pacrispr质粒包含两个bsai位点，用来插入spacer片段。

优选地，所述的pacrispr质粒包含sacb反向筛选基因片段。

优选地，所述的pacrispr质粒包含sgrna序列。

优选地，所述的pcaspa质粒的序列为seqidno：1。

优选地，所述的pacrispr质粒的序列为seqidno：2。

优选地，所述的pcaspa质粒和pacrispr质粒配合使用，能够在铜绿假单胞菌中进行基因组编辑，实现基因敲除或基因插入。

本发明还提供了含有上述的pcaspa质粒和pacrispr质粒中的至少一种的菌株。

本发明还提供了含有上述的pcaspa质粒和pacrispr质粒中的至少一种的细胞。

本发明还提供了上述的pcaspa/pacrispr双质粒系统在基因编辑中的作用。

优选地，所述的基因编辑为基因插入或基因敲除。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明能够(1)高效并且快速地敲除铜绿假单胞各种菌株的基因；(2)高效并且快速地在铜绿假单胞各种菌株的基因组上进行基因插入。所述技术在铜绿假单胞菌感染治疗、药物靶标发现、药物开发、铜绿假单胞菌生理研究方面具有广阔地应用前景。

本发明还提供了含有上述pcaspa质粒的大肠杆菌dh5α菌株，分类命名是：大肠埃希氏菌；拉丁文学名：escherichiacoli；保藏单位：中国典型培养物保藏中心(cctcc)；地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号；保藏日期：2018.07.05，保藏号为：cctccm2018450。

本发明还提供了含有上述pacrispr质粒的大肠杆菌dh5α菌株，分类命名是：大肠埃希氏菌；拉丁文学名：escherichiacoli；保藏单位：中国典型培养物保藏中心(cctcc)；地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号；保藏日期：2018.07.05，保藏号为：cctccm2018449。

附图说明

附图1：编辑质粒pcaspa和pacrispr图谱；图a.编辑质粒pcaspa图谱。cas9蛋白和λ-red重组系统都受到阿拉伯糖启动子parab的调控；sacb：反向筛选基因，用于编辑后质粒消除。图b.编辑质粒pacrispr图谱。bsai位点：用于goldengateassembly技术插入spacer片段；xbai和xhoi位点：用于gibsonassembly技术插入目标基因的修复模板；trcpromoter：sgrna表达的启动子；sacb：反向筛选基因，用于编辑后质粒消除。

附图2：pcaspa/pacrispr双质粒系统在铜绿假单胞菌中进行基因组编辑的过程示意图。

附图3：pcaspa/pacrispr双质粒系统在铜绿假单胞菌各种菌株中实现高效基因组编辑；

图a.pcaspa/pacrispr双质粒系统在铜绿假单胞菌中进行基因敲除的示意图，和在pao1菌株中进行rhlr基因敲除的pcr验证，色素实验以及dna测序结果。图b.pcaspa/pacrispr双质粒系统在铜绿假单胞菌中进行基因插入的示意图，和在pao1菌株中进行rpsl启动子插入的pcr验证和dna测序结果。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅用于说明本发明的一部分实施例，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买获得的常规产品。

各实施例中使用的生物材料来源如下：

pkd46质粒(购自武汉淼灵生物科技有限公司，货号：p0098)；

pcassa质粒(购自美国addgene公司，货号：98211)；

pdn19质粒(购自biovectorntcc质粒载体菌种细胞基因保藏中心，货号：pdn19)；

pex18ap质粒(购自biovectorntcc质粒载体菌种细胞基因保藏中心，货号：pex18ap)；

pak1900质粒(购自biovectorntcc质粒载体菌种细胞基因保藏中心，货号：pak1900)；

铜绿假单胞菌pao1菌株(购自美国atcc公司，货号：atcc15692)

感受态大肠杆菌dh5α菌株(购自武汉淼灵生物科技有限公司，货号：p1435)。

含有pcaspa质粒的大肠杆菌dh5α菌株，分类命名是：大肠埃希氏菌；拉丁文学名：escherichiacoli；保藏单位：中国典型培养物保藏中心(cctcc)；地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山；保藏日期：2018.07.05，保藏号为：cctccm2018450。

含有pacrispr质粒的大肠杆菌dh5α菌株，分类命名是：大肠埃希氏菌；拉丁文学名：escherichiacoli；保藏单位：中国典型培养物保藏中心(cctcc)；地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山；保藏日期：2018.07.05，保藏号为：cctccm2018449。

各实施例中使用的lb液体培养基购自生工生物工程(上海)股份有限公司，货号：a507002-0250；lb固体培养基购自生工生物工程(上海)股份有限公司，货号：a507003-0250；盐酸四环素购自生工生物工程(上海)股份有限公司，货号：a100422-0010；羧苄青霉素二钠购自生工生物工程(上海)股份有限公司，货号：a600469-0005；蔗糖购自生工生物工程(上海)股份有限公司，货号：a100335-0250；甘油购自生工生物工程(上海)股份有限公司，货号：a100854-0500。

实施例一：pcaspa质粒构建：

pcaspa质粒的组成如附图1a所示，其序列为seqidno：1。pcaspa质粒的具体构建方法如下：

(1)以pkd46质粒为模板，分别pcr扩增得到λ-red重组系统的dna片段和阿拉伯糖诱导的parab启动子的dna片段；从pcassa质粒中通过pcr扩增得到含有cas9蛋白的基因片段。

用于pcr扩增的引物序列为：

扩增λ-red重组系统5’引物序列(seqidno：3)：

5’-aacgacggccagtgaattcgagctcggtaccctttcctgcgttgtcgac

tgtatttagaaaaataaacaaataggggttcc-3’

扩增λ-red重组系统3’引物序列(seqidno：4)：

5’-gtatgaaaagtctcgagcattctagatccacagcggccgccatggattcttcgtctgtttctactg-3’

扩增parab启动子5’引物序列(seqidno：5)：

5’-cggccgctgtggatctagaatgctcgagacttttcatactcccgccattc-3’

扩增parab启动子3’引物序列(seqidno：6)：

5’-gcctattgagtatttcttatccattttttataacctccttagagctcgaattc-3’

扩增cas9蛋白基因5’引物序列(seqidno：7)：

5’-cgagctctaaggaggttataaaaaatggataagaaatactcaataggcttagat-3’

扩增cas9蛋白基因3’引物序列(seqidno：8)：

5’-gctctaatacgactcactatagggaaagcttctgtccatacccatgggtatttaccac-3’

使用takara公司的primerstarhsdnapolymerase分别扩增上述三个dna片段，反应体系为：34.4μlddh2o，4μldntpmixture(2.5mmeach)，10μl5×primestarbuffer，0.3μl5’primer(50μm)，0.3μl3’primer(50μm)，0.5μl模板dna(100ng/μl)，0.5μlprimerstarhsdnapolymerase。

上述pcr反应体系配好以后进行聚合酶链式反应(pcr)，循环如下：98℃30s；之后98℃10s，55℃30s，72℃5min，共30个循环；最后72℃10min。使用生工生物工程(上海)股份有限公司生产的sanprep柱式pcr产物纯化试剂盒对pcr产物分别进行回收。pcr产物纯化的具体步骤按照试剂盒使用操作手册进行。

(2)使用kpni和hindiii-hf对pdn19质粒进行酶切，其反应体系如下：5μl10×cutsmartbuffer，2μgpdn19质粒，2μlkpni(10units/μl)，2μlhindiii-hf(20units/μl)，最后加入适量ddh2o至总体积为50μl。该反应中所用buffer和酶均由neb公司生产。将反应体系在37℃下反应2～3小时后，使用生工生物工程(上海)股份有限公司生产的sanprep柱式pcr产物纯化试剂盒对双酶切产物进行纯化回收。具体步骤按照试剂盒使用操作手册进行。

(3)将步骤(1)中得到的三个dna片段和步骤(2)中得到的pdn19质粒酶切产物组装成一个质粒。具体的反应体系为：10μlnebuilderhifidnaassemblymastermix(neb公司)，20fmolλ-red重组系统dna片段，20fmolparab启动子dna片段，20fmolcas9蛋白基因片段，20fmol酶切后的pdn19质粒，加入适量ddh2o至总体积为20μl。在50℃下反应1小时。将20μl反应产物转化到大肠杆菌感受态dh5α菌株中，并平铺在含有15μg/ml四环素的lb固体培养平板上。待转化液被固体培养平板吸收后于37℃培养箱倒置培养过夜。将培养平板上长出的转化菌株转接保存，并用生工生物工程(上海)股份有限公司的sanprep柱式质粒dna小量抽提试剂盒抽提质粒用于后续实验，质粒抽提的具体步骤按照试剂盒使用操作手册进行。同时将质粒送到生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序确认。

(4)使用xbai和xhoi对步骤(3)得到的质粒进行酶切，其反应体系如下：5μl10×cutsmartbuffer，2μg步骤(3)得到的质粒，2μlxbai(20units/μl)，2μlxhoi(20units/μl)，最后加入适量ddh2o至总体积为50μl。该反应中所用buffer和酶均由neb公司生产。将反应体系在37℃下反应2～3小时后，使用生工生物工程(上海)股份有限公司生产的sanprep柱式pcr产物纯化试剂盒对双酶切产物进行纯化回收。具体步骤按照试剂盒使用操作手册进行。

(5)以pex18ap质粒为模板，pcr扩增得到反向筛选基因sacb的dna片段。

扩增sacb基因5’引物序列(seqidno：9)：

5’aagaatccatggcggccgctgtggatctagacggcatcagagcagattgta-3’

扩增sacb基因3’引物序列(seqidno：10)：

5’tctgaatggcgggagtatgaaaagtctcgaggcaactttatgcccatgcaaca-3’

使用takara公司的primerstarhsdnapolymerase扩增sacb基因dna片段，反应体系为：34.4μlddh2o，4μldntpmixture(2.5mmeach)，10μl5×primestarbuffer，0.3μl5’primer(50μm)，0.3μl3’primer(50μm)，0.5μl模板dna(100ng/μl)，0.5μlprimerstarhsdnapolymerase。

pcr反应体系配好以后进行聚合酶链式反应(pcr)，循环如下：98℃30s；之后98℃10s，55℃30s，72℃2min30s，共30个循环；最后72℃10min。使用生工生物工程(上海)股份有限公司生产的sanprep柱式pcr产物纯化试剂盒对pcr产物分别进行回收。pcr产物纯化的具体步骤按照试剂盒使用操作手册进行。

(6)将步骤(4)中得到的质粒酶切产物和步骤(5)中得到的sacb基因片段组装成一个质粒。具体的反应体系为：10μlnebuilderhifidnaassemblymastermix(neb公司)，20fmol步骤(4)得到的质粒酶切产物，20fmolsacb基因片段，加入适量ddh2o至总体积为20μl。在50℃下反应1小时。将20μl反应产物转化到大肠杆菌感受态dh5α菌株中，并平铺在含有15μg/ml四环素的lb固体培养平板上。待转化液被固体培养平板吸收后于37℃培养箱倒置培养过夜。将培养平板上长出的转化菌株转接保存，并用生工生物工程(上海)股份有限公司的sanprep柱式质粒dna小量抽提试剂盒抽提质粒用于后续实验，质粒抽提的具体步骤按照试剂盒使用操作手册进行。同时将质粒送到生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序确认。最终得到的质粒命名为pcaspa质粒。含有正确pcaspa质粒的大肠杆菌dh5α菌株已由发明人保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏号为：cctccm2018450。

该pcaspa质粒的特征在于是一种穿梭质粒，能够在大肠杆菌和铜绿假单胞菌中复制传代；在于该质粒在大肠杆菌和铜绿假单胞菌中均为四环素抗性，大肠杆菌中的筛选浓度为15μg/ml，在铜绿假单胞菌中的筛选浓度为100μg/ml；在于该质粒能在铜绿假单胞菌中在阿拉伯糖诱导下表达cas9蛋白和λ-red重组系统；在于该质粒与pacrispr质粒配合使用，能够在铜绿假单胞菌中进行基因组编辑，实现基因敲除、基因插入等功能；在于具有sacb反向筛选基因，通过在蔗糖条件下培养能够实现菌株中的质粒消除。

实施例二：pacrispr质粒构建：

pacrispr质粒的组成如附图1b所示，其序列为seqidno：2。pacrispr质粒的具体构建方法如下：

(1)使用bamhi-hf和hindiii-hf对pak1900质粒进行酶切，其反应体系如下：5μl10×cutsmartbuffer，2μgpak1900质粒，2μlbamhi-hf(20units/μl)，2μlhindiii-hf(20units/μl)，最后加入适量ddh2o至总体积为50μl。该反应中所用buffer和酶均由neb公司生产。将反应体系在37℃下反应2～3小时后，使用生工生物工程(上海)股份有限公司生产的sanprep柱式pcr产物纯化试剂盒对双酶切产物进行纯化回收。具体步骤按照试剂盒使用操作手册进行。

(2)以pex18ap质粒为模板，pcr扩增得到反向筛选基因sacb的dna片段。

扩增sacb基因5’引物序列(seqidno：11)：

5’-gggcgaattcgagctcggtacccggggatcccggcatcagagcagattgta-3’

扩增sacb基因3’引物序列(seqidno：12)：

5’-aacctgattccaatttgagcaaggcgtcgacgcaactttatgcccatgcaaca-3’

使用takara公司的primerstarhsdnapolymerase扩增sacb基因dna片段，反应体系为：34.4μlddh2o，4μldntpmixture(2.5mmeach)，10μl5×primestarbuffer，0.3μl5’primer(50μm)，0.3μl3’primer(50μm)，0.5μl模板dna(100ng/μl)，0.5μlprimerstarhsdnapolymerase。

pcr反应体系配好以后进行聚合酶链式反应(pcr)，循环如下：98℃30s；之后98℃10s，55℃30s，72℃2min30s，共30个循环；最后72℃10min。使用生工生物工程(上海)股份有限公司生产的sanprep柱式pcr产物纯化试剂盒对pcr产物分别进行回收。pcr产物纯化的具体步骤按照试剂盒使用操作手册进行。

(3)在金唯智生物科技有限公司采用常规方法化学合成含有trc启动子和sgrna序列的dna片段，其序列如下(seqidno：13)：

其中加粗的大写部分为trc启动子序列；小写部分为sgrna序列；下划线的大写部分别为两个bsai酶切位点。

(4)将步骤(1)中得到的pak1900质粒酶切产物，步骤(2)中得到的sacb基因片段以及步骤(3)全合成的dna片段组装成一个质粒。具体的反应体系为：10μlnebuilderhifidnaassemblymastermix(neb公司)，20fmol步骤(1)pak1900质粒酶切产物，20fmol步骤(2)sacb基因片段，20fmol步骤(3)全基因合成dna片段，加入适量ddh2o至总体积为20μl。在50℃下反应1小时。将20μl反应产物转化到大肠杆菌感受态dh5α菌株中，并平铺在含有50μg/ml羧苄青霉素的lb固体培养平板上。待转化液被固体培养平板吸收后于37℃培养箱倒置培养过夜。将培养平板上长出的转化菌株转接保存，并用生工生物工程(上海)股份有限公司的sanprep柱式质粒dna小量抽提试剂盒抽提质粒用于后续实验，质粒抽提的具体步骤按照试剂盒使用操作手册进行。同时将质粒送到生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序确认。最终得到的质粒命名为pacrispr质粒。含有正确pacrispr质粒的大肠杆菌dh5α菌株已由发明人保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏号为：cctccm2018449。

该pacrispr质粒的特征在于是一种穿梭质粒，能够在大肠杆菌和铜绿假单胞菌中复制传代；在于该质粒在大肠杆菌和铜绿假单胞菌中均为羧苄青霉素抗性，在大肠杆菌中的筛选浓度为50μg/ml，在铜绿假单胞菌中的筛选浓度为150μg/ml；在于该质粒能在铜绿假单胞菌中稳定表达sgrna；在于该质粒与pcaspa质粒配合使用，能够在铜绿假单胞菌中进行基因组编辑，实现基因敲除、基因插入等功能；在于具有sacb反向筛选基因，通过在蔗糖条件下培养能够实现菌株中的质粒消除；在于含有两个bsai位点，能够用来插入spacer片段；在于含有xbai和xhoi酶切位点，能够用来插入修复模板。

实施例三：pcaspa/pacrispr双质粒系统实现铜绿假单胞菌株中高效基因敲除：

使用pcaspa/pacrispr双质粒系统可以在铜绿假单胞菌各种菌株中实现对不同基因的高效敲除，其过程如附图2所示。实验中选取rhlr基因为例，在铜绿假单胞菌pao1菌株中进行基因敲除实验。附图3a为采用pcaspa/pacrispr双质粒系统在铜绿假单胞菌中进行基因敲除的示意图，和在pao1菌株中进行rhlr基因敲除的pcr验证，色素实验以及dna测序结果。

(1)先在pao1菌株目标基因上选定某一ngg(n为任意碱基)序列前面20个碱基的dna片段(这20个碱基被称为spacer，ngg不包含在其中)。本步骤的特征在于：为使spacer片段能插入到pacrispr质粒中，需在该单链dna序列的5’端加上gtgg。同时需合成spacer的反补序列，并在反补序列5’端加上aaac。例如实验选定的rhlr基因spacer的dna序列(seqidno：14)为：5’-tcttctggatgttcttgtgg-3’，则具体序列设计如下：

5’-gtggtcttctggatgttcttgtgg-3’(seqidno：15)

3’-ccacaagaacatccagaagacaaa-5’(seqidno：16)

在生工生物工程(上海)股份有限公司常规方法合成上述两条引物，并按实施例六的步骤将spacer插入到实施例二中得到的pacrispr质粒中，得到pacrispr-rhlr_spacer质粒。

(2)使用xbai和xhoi对pacrispr-rhlr_spacer质粒进行酶切反应。其反应体系如下：5μl10×cutsmartbuffer，2μgpacrispr-rhlr_spacer质粒，2μlxbai(20units/μl)，2μlxhoi(20units/μl)，最后加入适量ddh2o至总体积为50μl。该反应中所用buffer和酶均由neb公司生产。在37℃下反应2～3小时后，使用生工生物工程(上海)股份有限公司生产的sanprep柱式pcr产物纯化试剂盒对双酶切质粒产物进行纯化回收。具体步骤按照试剂盒使用操作手册进行。

(3)扩增要敲除的目标基因上下游各～500bp的dna片段。本步骤的特征在于：在目标基因上游的5’引物上需添加5’-ttttgagatctgtccatacccatggtctaga-3’序列(seqidno：17)，而在目标基因下游的3’引物上需添加5’-tctgaatggcgggagtatgaaaagtctcgag-3’序列(seqidno：18)；同时扩增目标基因上游的3’引物与扩增下游的5’引物之间有20～50个碱基的重叠互补区域。以rhlr基因为例，扩增其上下游片段所需的引物分别为：

rhlr基因上游5’引物序列：5’-agctcccagaccgacggatcgct-3’(seqidno：19)

rhlr基因上游3’引物序列：5’-ctgggtctcatctgaagcgca-3’(seqidno：20)

rhlr基因下游5’引物序列：5’-tgcagtaagccctgatcgataaaatg-3’(seqidno：21)

rhlr基因下游3’引物序列：5’-ggagccttgctgccatcgtg-3’(seqidno：22)

那么在实验中具体设计时，引物的实际序列为：

rhlr基因上游5’引物序列(seqidno：23)：

5’-ttttgagatctgtccatacccatggtctagaagctcccagaccgacggatcgct-3’

rhlr基因上游3’引物序列(seqidno：24)：

5’-cattttatcgatcagggcttactgcactgggtctcatctgaagcgca-3’

rhlr基因下游5’引物序列(seqidno：25)：

5’-tgcgcttcagatgagacccagtgcagtaagccctgatcgataaaatg-3’

rhlr基因下游3’引物序列(seqidno：26)：

5’-tctgaatggcgggagtatgaaaagtctcgagggagccttgctgccatcgtg-3’

使用takara公司的primerstarhsdnapolymerase对rhlr基因上下游片段分别进行扩增，反应体系为：34.4μlddh2o，4μldntpmixture(2.5mmeach)，10μl5×primestarbuffer，0.3μl5’primer(50μm)，0.3μl3’primer(50μm)，0.5μl模板dna(100ng/μl)，0.5μlprimerstarhsdnapolymerase。使用生工生物工程(上海)股份有限公司生产的ezup柱式细菌基因组dna抽提试剂盒抽提铜绿假单胞菌pao1菌株的基因组，作为pcr模板，具体步骤按照试剂盒使用操作手册进行。

体系配好以后进行聚合酶链式反应(pcr)，循环如下：98℃30s；之后98℃10s，55℃30s，72℃40s，共30个循环；最后72℃10min。使用生工生物工程(上海)股份有限公司生产的sanprep柱式pcr产物纯化试剂盒对pcr产物分别进行纯化回收。具体步骤按照试剂盒使用操作手册进行。

(4)将上述步骤(3)得到的rhlr基因上下游片段插入到步骤(2)酶切后的pacrispr-rhlr_spacer质粒的xbai/xhoi位点中，得到pacrispr-rhlr质粒。具体的反应体系为：10μlnebuilderhifidnaassemblymastermix(neb公司)，20fmolrhlr基因上游片段，20fmolrhlr基因下游片段，20fmol酶切后的pacrispr-rhlr_spacer质粒，加入适量ddh2o至总体积为20μl。在50℃下反应1小时。将20μl反应产物转化到大肠杆菌感受态dh5α菌株中，并平铺在含有50μg/ml羧苄青霉素的lb固体培养平板上。待转化液被固体培养基吸收后于37℃培养箱倒置培养过夜。将培养平板上长出的转化菌株转接保存，并用生工生物工程(上海)股份有限公司的sanprep柱式质粒dna小量抽提试剂盒抽提pacrispr-rhlr质粒用于后续实验，同时将质粒送到生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序确认。

(5)将构建的pacrispr-rhlr质粒转入实施例七制备的含有pcaspa质粒的pao1菌株电转感受态中。具体操作如下：取一管实施例七中制备的含有pcaspa质粒的pao1菌株电转感受态细菌，在冰上放置5～10分钟后，加入1～2μg质粒。混合均匀后转入1mm电转杯(bio-rad公司)，室温下在genepulserxcell电击仪(bio-rad公司)中进行电击。电击参数为：2100v，200ω，25μf。电击后立即加入1mllb培养液，混合均匀后转入干净的ep管中，在37℃摇床中振摇1～2个小时。将ep管以6000rpm转速在室温下离心1.5分钟，弃去～900μl上清，将剩余的菌液(～150μl)混合均匀后平铺在含有150μg/ml羧苄青霉素和100μg/ml四环素的lb固体培养平板上。待菌液被固体培养基吸收后，于37℃培养箱倒置培养过夜，只有成功转入质粒的细菌能在培养基上生长。

(6)挑取单克隆菌落到10μlddh2o中，在95℃下加热10min使细菌裂解，作为pcr模板扩增rhlr基因部分。反应体系为34.4μlddh2o，4μldntpmixture(2.5mmeach)，10μl5×primestarbuffer，0.3μl5’primer(50μm)，0.3μl3’primer(50μm)，0.5μlpcr模板，0.5μlprimerstarhsdnapolymerase。pcr产物在1％琼脂糖凝胶上进行凝胶电泳。成功进行基因敲除的菌株单克隆，其pcr产物会比正常菌株的pcr产物长度短，因此可以通过琼脂糖凝胶上dna片段的大小来判断基因敲除是否成功。

本步骤的特征在于进行pcr验证的引物位于rhlr基因上下游的外侧，不在pacrispr-rhlr质粒中，这样就避免了pacrispr-rhlr质粒对pcr结果的干扰。

rhlr基因敲除的pcr验证引物序列为：

5’primer：5’-gcaggctggaccagaatatc-3’(seqidno：27)

3’primer：5’-aactgcaacgctttctcgat-3’(seqidno：28)

将pcr产物送到生工生物工程(上海)股份有限公司测序验证，测序引物为：5’-ccttccagcgattcagagag-3’(seqidno：29)。

实验结果发现，在选取的12个菌落中，所有12个都基因敲除成功。

(7)铜绿假单胞菌pao1菌株中的rhlr基因与细菌的色素生产相关。当rhlr基因失去功能时，会使菌株失去色素生产能力。将步骤(6)中选取的12个单克隆菌落，在3mlppb液体培养基中于37℃摇床振摇培养过夜(ppb液体培养基配方：1升ppb液体培养基中含有20g蛋白胨，1.4gmgcl2，10gk2so4，20ml甘油；ph7.0)。同时选取一个野生型pao1菌落在相同的条件下培养作为对照。第二天，野生型菌株的ppb菌液显示为绿色，而rhlr基因敲除成功的12个菌落则显示为黄色。

(8)对已经确认基因敲除成功的铜绿假单胞菌各菌株，按实施例五的操作过程消除菌株中的质粒。

实施例四：pcaspa/pacrispr双质粒系统实现铜绿假单胞菌株中高效基因插入：

使用pcaspa/pacrispr双质粒系统可以在铜绿假单胞菌各种菌株中实现对不同基因的高效插入，其过程如附图2所示。实验中选取rhla基因启动子作为插入位点，以rpsl启动子作为插入基因，在铜绿假单胞菌pao1菌株中进行基因插入实验。附图3b为采用pcaspa/pacrispr双质粒系统在铜绿假单胞菌中进行基因插入的示意图，和在pao1菌株中将rpsl启动子插入rhla基因启动子位点的pcr验证和dna测序结果。

(1)设计用于rpsl启动子插入的spacer片段序列，选定的spacerdna序列(seqidno：30)为：5’-acggcagacaagtaactcag-3’，则具体序列设计如下：

5’-gtggacggcagacaagtaactcag-3’(seqidno：31)

3’-ctgagttacttgtctgccgtcaaa-5’(seqidno：32)

在生工生物工程(上海)股份有限公司合成上述两条引物，并按实施例六的步骤将spacer插入到实施例二中得到的pacrispr质粒中，得到pacrispr-rpsl_spacer质粒。

(2)使用xbai和xhoi对pacrispr-rpsl_spacer质粒进行酶切反应，并纯化酶切产物。其步骤与实施例三步骤(2)相同。

(3)扩增要插入的目标位点上下游各～500bp的dna片段，并扩增rpsl启动子。与实施例三步骤(3)相比，本步骤的特征在于：增加了rpsl启动子片段，而且扩增rpsl启动子的5’引物和3’引物分别与扩增目标位点上游的3’引物和扩增目标位点下游的5’引物之间有30～40个碱基的重叠互补区域。以rpsl启动子为例，在实验设计时，引物的具体序列为：

rpsl启动子插入位点上游5’引物序列(seqidno：33)：

5’-ttttgagatctgtccatacccatggtctagacttcgacgagaaaagcttcgtc-3’

rpsl启动子插入位点上游3’引物序列(seqidno：34)：

5’-cggggcttgtcgttgatgcgattggcgtccgtgttcacg-3’

rpsl启动子5’引物序列(seqidno：35)：

5’-cgtgaacacggacgccaatcgcatcaacgacaagccccg-3’

rpsl启动子3’引物序列(seqidno：36)：

5’-aacagactttcgcgccgcatctatagctccactgattgtcttacg-3’

rpsl启动子插入位点下游5’引物序列(seqidno：37)：

5’-cgtaagacaatcagtggagctatagatgcggcgcgaaagtctgtt-3’

rpsl启动子插入位点下游3’引物序列(seqidno：38)：

5’-tctgaatggcgggagtatgaaaagtctcgagcatgtgctgatggttgctgg-3’

使用takara公司的primerstarhsdnapolymerase对rpsl启动子插入位点上下游片段以及rpsl启动子分别进行扩增，反应体系为：34.4μlddh2o，4μldntpmixture(2.5mmeach)，10μl5×primestarbuffer，0.3μl5’primer(50μm)，0.3μl3’primer(50μm)，0.5μl模板dna(100ng/μl)，0.5μlprimerstarhsdnapolymerase。

其中扩增rpsl启动子插入位点上下游片段以及rpsl启动子的模板dna为铜绿假单胞菌pao1菌株的基因组dna，由生工生物工程(上海)股份有限公司生产ezup柱式细菌基因组dna抽提试剂盒从pao1菌株中抽提得到。具体步骤按照试剂盒使用操作手册进行。体系配好以后进行聚合酶链式反应(pcr)，循环如下：98℃30s；之后98℃10s，55℃30s，72℃40s，共30个循环；最后72℃10min。使用生工生物工程(上海)股份有限公司生产的sanprep柱式pcr产物纯化试剂盒对pcr产物分别进行纯化回收。具体步骤按照试剂盒使用操作手册进行。

(4)将上述纯化得到的rpsl启动子插入位点上下游片段以及rpsl启动子插入到步骤(2)酶切后的pacrispr-rpsl_spacer质粒的xbai/xhoi位点中，得到pacrispr-rpsl质粒。具体的反应体系为：10μlnebuilderhifidnaassemblymastermix(neb公司)，20fmolrpsl启动子插入位点上游片段，20fmolrpsl启动子插入位点下游片段，20fmolrpsl启动子片段，20fmol酶切后的pacrispr-rpsl_spacer质粒，加入适量ddh2o至总体积为20μl。在50℃下反应1小时。将20μl反应产物转化到大肠杆菌感受态dh5α菌株中，并平铺在含有50μg/ml羧苄青霉素的lb固体培养平板上。待转化液被固体培养基吸收后于37℃培养箱倒置培养过夜。将培养基上长出的转化菌株转接保存，并用生工生物工程(上海)股份有限公司的sanprep柱式质粒dna小量抽提试剂盒抽提pacrispr-rpsl质粒用于后续实验，同时将质粒送到生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序确认。

(5)将构建的pacrispr-rpsl质粒按实施例三步骤(5)的操作步骤转入铜绿假单胞菌pao1菌株中。

(6)挑取单克隆菌落到10μlddh2o中，在95℃下加热10min使细菌裂解，作为pcr模板扩增rpsl启动子插入位点。反应体系为34.4μlddh2o，4μldntpmixture(2.5mmeach)，10μl5×primestarbuffer，0.3μl5’primer(50μm)，0.3μl3’primer(50μm)，0.5μl模板dna，0.5μlprimerstarhsdnapolymerase。pcr产物在1％琼脂糖凝胶上进行凝胶电泳。与实施例三步骤(6)相比，本步骤的特征之处在于使用了不同的验证引物，其中5’引物位于rpsl启动子上，而3’引物则位于rpsl启动子插入位点下游的外侧。这样成功进行基因插入的菌株能够得到pcr扩增条带，而没有发生基因插入的菌株则不能得到pcr扩增条带。将pcr产物在1％琼脂糖凝胶上进行凝胶电泳。可以通过琼脂糖凝胶上是否具有明显dna条带来判断基因插入是否成功。该引物设计同时也避免了pacrispr-rpsl质粒对pcr结果的干扰。

rpsl启动子插入的pcr验证引物序列为：

5’primer：5’-ttttgtaccccgaaaattgg-3’(seqidno：39)

3’primer：5’-agctgccgttgatgaaatgc-3’(seqidno：40)

此外，扩增rpsl启动子插入位点的dna片段。反应体系为34.4μlddh2o，4μldntpmixture(2.5mmeach)，10μl5×primestarbuffer，0.3μl5’primer(50μm)，0.3μl3’primer(50μm)，0.5μl模板dna，0.5μlprimerstarhsdnapolymerase。将pcr产物送到生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序验证。

rpsl启动子插入位点的pcr扩增引物序列为：

5’primer：5’-gtgatttcctacggggtgtc-3’(seqidno：41)

3’primer：5’-agctgccgttgatgaaatgc-3’(seqidno：40)

测序引物为：5’-gcgtttcgacaccggaaacc-3’(seqidno：42)

实验结果发现，在选取的12个菌落中，有11个基因插入成功。

(7)对已经确认基因敲除成功的铜绿假单胞菌各菌株，按实施例五的操作过程消除菌株中的质粒。

实施例五：金黄色葡萄球菌中pcaspa质粒和pacrispr质粒的消除：

从基因编辑成功的含有pcaspa和pacrispr质粒的铜绿假单胞菌中挑取一个单克隆，接种到3ml含有150μg/ml羧苄青霉素和含有100μg/ml四环素的lb液体培养基中，在37℃下振摇过夜。第二天，取3μl菌液，以1∶1000比例稀释到3ml新鲜的lb液体培养基中，在37℃下振摇培养至菌液浑浊。用新鲜的lb液体培养基将菌液稀释10000倍，取100μl稀释后的菌液平铺在含有5％w/v蔗糖的lb固体培养平板上。待转化液被固体培养平板吸收后于37℃培养箱倒置培养过夜。由于pcaspa质粒和pacrispr质粒中含有sacb基因，使得质粒在蔗糖条件下会产生对细菌有害物质，造成细菌死亡，从而在培养平板上长出来的菌落都是不含质粒的。从含有5％w/v蔗糖的lb固体培养平板上挑取单克隆菌落，接种在10μllb液体培养基中，分别在lb固体培养平板、含有100μg/ml四环素的lb固体培养平板以及含有150μg/ml羧苄青霉素的lb固体培养平板上划线。能在lb固体培养基生长，但是不能在含有100μg/ml四环素的lb固体培养平板和含有150μg/ml羧苄青霉素的lb固体培养平板上生长的菌落，即为消除了pcaspa质粒和pacrispr的菌落，对其进行培养与保种。

实施例六：将spacer片段插入pacrispr质粒：

首先将设计合成的两个spacer引物进行磷酸化，具体反应体系如下：5μl10×t4dnaligasebuffer(neb公司)，2μlspacer5’primer(50μm)，2μlspacer3’primer(50μm)，1μlt4polynucleotidekinase(takara公司)，40μlddh2o。在37℃下反应1小时。向反应产物中加入2.5μl1mnacl，在95℃加热5min，然后在1～2小时内缓慢地降低到室温，使磷酸化的两条单链引物通过碱基配对形成双链dna。然后用ddh2o将得到的产物稀释20倍。

将上述得到的双链dna插入pacrispr质粒的bsai位点，具体反应体系为：1μl10×t4dnaligasebuffer，1μl上述20倍稀释的磷酸化双链dna，20fmol实施例二中得到的pacrispr质粒，0.5μlt4dnaligase(400units/μl)，0.5μlbsai-hf(20units/μl)，最后加入适量ddh2o至总体积为10μl。该反应中所用buffer和酶均由neb公司生产。在pcr仪中进行反应，循环如下：37℃2min；16℃5min，共25个循环；然后50℃5min，80℃15min。

将该10μl反应产物转化到大肠杆菌感受态dh5α菌株中，并平铺在含有50μg/ml羧苄青霉素的lb固体培养平板上。待转化液被固体培养平板吸收后于37℃培养箱倒置培养过夜。将培养基上长出的转化菌株转接保存，同时抽提质粒并送到生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序验证。

实施例七：制备含有pcaspa质粒的铜绿假单胞菌电转感受态

(1)将实验室保种的铜绿假单胞菌pao1菌株在lb固体培养平板上划线，于37℃培养箱倒置培养过夜。挑取培养平板上长出的一个单克隆菌落，接种到3mllb液体培养基中，在37℃摇床中以250rpm转速振摇过夜。第二天取1ml菌液接种到100ml新鲜的lb培养基中，在37℃摇床中继续振摇。当菌液的od600达到1.0～1.5时，将菌液放在冰上冷却十分钟。在4℃离心机中以6000rpm转速离心5分钟收菌，弃去培养基上清，将底部的细菌沉淀用20ml10％v/v甘油(高压灭菌，并在冰上预冷)重悬。以同样的转速离心，弃去上清，将底部的细菌沉淀再次用20ml10％v/v甘油重悬。以同样的转速再一次离心，弃去上清后用1ml10％v/v甘油重悬底部的细菌沉淀。将得到的细菌电转感受态分装到ep管中，每管50μl菌液。将分装的菌液先在液氮中快速冷冻，然后放入-80℃冰箱中保存。需要注意的是，在重悬时动作要轻柔，可以使用移液枪轻轻吹打的方式使细菌重悬。

(2)取一管步骤(1)中制备的铜绿假单胞菌pao1菌株电转感受态，在冰上放置5～10分钟后，加入1～2μg实施例一中制备的pcaspa质粒。混合均匀后转入1mm电转杯(bio-rad公司)，室温下在genepulserxcell电击仪(bio-rad公司)中进行电击。电击参数为：2100v，200ω，25μf。电击后立即加入1mllb液体培养基，混合均匀后转入干净的ep管中，在37℃摇床中振摇1～2个小时。将ep管以6000rpm转速在室温下离心1.5分钟，弃去～900μl上清，将剩余的菌液(～150μl)混合均匀后平铺在含有100μg/ml四环素的lb固体培养平板上。待菌液被固体培养平板吸收后，于37℃培养箱倒置培养过夜，只有成功转入质粒的细菌能在含有四环素的培养平板上生长。挑取一个单克隆菌落，在3ml含有100μg/ml四环素的lb液体培养基中于37℃摇床中以250rpm转速振摇过夜。第二天取650μl细菌菌液，与350μl80％v/v甘油(高压灭菌)混合均匀后，保存于-80℃冰箱中进行保种用于后续实验。

(3)将步骤(2)中保种的含有pcaspa质粒的铜绿假单胞菌pao1菌株在含有100μg/ml四环素的lb固体培养平板上划线，于37℃培养箱倒置培养过夜。挑取培养平板上长出的一个单克隆菌落，接种到3ml含有100μg/ml四环素的lb液体培养基中，在37℃摇床中以250rpm转速振摇过夜。第二天取1ml菌液接种到100ml含有100μg/ml四环素的lb培养基中，在37℃摇床中继续振摇。当菌液的od600达到1.0～1.5时，加入1ml20％w/vl-阿拉伯糖诱导λ-red重组系统和cas9蛋白的表达。在37℃摇床中继续振摇2小时后，将菌液放在冰上冷却十分钟。在4℃离心机中以6000rpm转速离心5分钟收菌，弃去培养基上清，将底部的细菌沉淀用20ml10％v/v甘油(高压灭菌，并在冰上预冷)重悬。以同样的转速离心，弃去上清，将底部的细菌沉淀再次用20ml10％v/v甘油重悬。以同样的转速再一次离心，弃去上清后用1ml10％v/v甘油重悬底部的细菌沉淀。将得到的细菌电转感受态分装到ep管中，每管50μl菌液，用于后续电转。需要注意的是，该电转感受态需要现配现用，在-80℃冰箱冻存会严重降低电转效率。

序列表

<110>上海科技大学

<120>一种pcaspa/pacrispr双质粒系统及其应用

<160>42

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>17653

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>1

gaccctttccgacgctcaccgggctggttgccctcgccgctgggctggcggccgtctatg60

gccctgcaaacgcgccagaaacgccgtcgaagccgtgtgcgagacaccgcggccgccggc120

gttgtggatacctcgcggaaaacttggccctcactgacagatgaggggcggacgttgaca180

cttgaggggccgactcacccggcgcggcgttgacagatgaggggcaggctcgatttcggc240

cggcgacgtggagctggccagcctcgcaaatcggcgaaaacgcctgattttacgcgagtt300

tcccacagatgatgtggacaagcctggggataagtgccctgcggtattgacacttgaggg360

gcgcgactactgacagatgaggggcgcgatccttgacacttgaggggcagagtgctgaca420

gatgaggggcgcacctattgacatttgaggggctgtccacaggcagaaaatccagcattt480

gcaagggtttccgcccgtttttcggccaccgctaacctgtcttttaacctgcttttaaac540

caatatttataaaccttgtttttaaccagggctgcgccctgtgcgcgtgaccgcgcacgc600

cgaaggggggtgcccccccttctcgaaccctcccggcccgctaacgcgggcctcccatcc660

ccccaggggctgcgcccctcggccgcgaacggcctcaccccaaaaatggcaggacaactg720

gtgagtctggatctgaagttcattgttgtcatggatgatctggaccgactggagccatcc780

caggtggcggaagtgttcaggcttgtgagtgcagtagccgatctgccccgctttacccat840

attctctgttatgacaggcagattatcactcatgccgttgaacatgcgctgaatatcgaa900

gatggcagccgttatctccagaaaatcattcagcttagttttaaattaccccgacctgaa960

gcctttgatttacgtaatgaatttcgccagcgggctgaggctctatatcagcaaattaat1020

aatcaaccgccagactctggaatggtaagggatctcatcgcggtgactgatacctatggt1080

gccgcactttcgacgccacgggaaatccatcaggccattaattccctgatttttctttat1140

ccggggatgcgggattttgtttatttccctgatttgtgcctgcttcagcttatacgggtg1200

acaaacccggctctgtatgactggacagagcattacctgacagaacggtccgtgattgaa1260

accggtcagggtatgctttctgacggagagaaagcagacttccgggaggggcttatcaga1320

tgtatgaagacgttcagggcatcaaatgcagactcgtttctgacacttgcagactggatc1380

tatctcatctgcgcaaggcagaacgtgaagacggccgccctggacctcgcccgcgagcgc1440

caggcgcacgaggccggcgcgcggacccgcgccacggcccacgagcggacgccgcagcag1500

gagcgccagaaggccgccagagaggccgagcgcggccgtgaggcttggacgctagggcag1560

ggcatgaaaaagcccgtagcgggctgctacgggcgtctgacgcggtggaaagggggaggg1620

gatgttgtctacatggctctgctgtagtgagtgggttgcgctccggcagcggtcctgatc1680

aatcgtcaccctttctcggtccttcaacgttcctgacaacgagcctccttttcgccaatc1740

catcgacaatcaccgcgagtccctgctcgaacgctgcgtccggaccggcttcgtcgaagg1800

cgtctatcgcggcccgcaacagcggcgagagcggagcctgttcaacggtgccgccgcgct1860

cgccggcatcgctgtcgccggcctgctcctcaagcacggccccaacagtgaagtagctga1920

ttgtcatcagcgcattgacggcgtccccggccgaaaaacccgcctcgcagaggaagcgaa1980

gctgcgcgtcggccgtttccatctgcggtgcgcccggtcgcgtgccggcatggatgcgcg2040

cgccatcgcggtaggcgagcagcgcctgcctgaagctgcgggcattcccgatcagaaatg2100

agcgccagtcgtcgtcggctctcggcaccgaatgcgtatgattctccgccagcatggctt2160

cggccagtgcgtcgagcagcgcccgcttgttcctgaagtgccagtaaagcgcccgctcct2220

ttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaat2280

cgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaactt2340

gattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttg2400

acgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaac2460

cctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggtta2520

aaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgcttaca2580

atttccattcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctctt2640

cgctattacgccagctggcgaaagggggatgtgctgcaaggcgattaagttgggtaacgc2700

cagggttttcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtgaattcgagctcggtaccc2760

tttcctgcgttgtcgactgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttc2820

cccgaaaagtgccacctgcatcgatttattatgacaacttgacggctacatcattcactt2880

tttcttcacaaccggcacggaactcgctcgggctggccccggtgcattttttaaataccc2940

gcgagaaatagagttgatcgtcaaaaccaacattgcgaccgacggtggcgataggcatcc3000

gggtggtgctcaaaagcagcttcgcctggctgatacgttggtcctcgcgccagcttaaga3060

cgctaatccctaactgctggcggaaaagatgtgacagacgcgacggcgacaagcaaacat3120

gctgtgcgacgctggcgatatcaaaattgctgtctgccaggtgatcgctgatgtactgac3180

aagcctcgcgtacccgattatccatcggtggatggagcgactcgttaatcgcttccatgc3240

gccgcagtaacaattgctcaagcagatttatcgccagcagctccgaatagcgcccttccc3300

cttgcccggcgttaatgatttgcccaaacaggtcgctgaaatgcggctggtgcgcttcat3360

ccgggcgaaagaaccccgtattggcaaatattgacggccagttaagccattcatgccagt3420

aggcgcgcggacgaaagtaaacccactggtgataccattcgcgagcctccggatgacgac3480

cgtagtgatgaatctctcctggcgggaacagcaaaatatcacccggtcggcaaacaaatt3540

ctcgtccctgatttttcaccaccccctgaccgcgaatggtgagattgagaatataacctt3600

tcattcccagcggtcggtcgataaaaaaatcgagataaccgttggcctcaatcggcgtta3660

aacccgccaccagatgggcattaaacgagtatcccggcagcaggggatcattttgcgctt3720

cagccatacttttcatactcccgccattcagagaagaaaccaattgtccatattgcatca3780

gacattgccgtcactgcgtcttttactggctcttctcgctaaccaaaccggtaaccccgc3840

ttattaaaagcattctgtaacaaagcgggaccaaagccatgacaaaaacgcgtaacaaaa3900

gtgtctataatcacggcagaaaagtccacattgattatttgcacggcgtcacactttgct3960

atgccatagcatttttatccataagattagcggatcctacctgacgctttttatcgcaac4020

tctctactgtttctccatacccgtttttttgggaattcgagctctaaggaggttataaaa4080

aatggatattaatactgaaactgagatcaagcaaaagcattcactaaccccctttcctgt4140

tttcctaatcagcccggcatttcgcgggcgatattttcacagctatttcaggagttcagc4200

catgaacgcttattacattcaggatcgtcttgaggctcagagctgggcgcgtcactacca4260

gcagctcgcccgtgaagagaaagaggcagaactggcagacgacatggaaaaaggcctgcc4320

ccagcacctgtttgaatcgctatgcatcgatcatttgcaacgccacggggccagcaaaaa4380

atccattacccgtgcgtttgatgacgatgttgagtttcaggagcgcatggcagaacacat4440

ccggtacatggttgaaaccattgctcaccaccaggttgatattgattcagaggtataaaa4500

cgaatgagtactgcactcgcaacgctggctgggaagctggctgaacgtgtcggcatggat4560

tctgtcgacccacaggaactgatcaccactcttcgccagacggcatttaaaggtgatgcc4620

agcgatgcgcagttcatcgcattactgatcgttgccaaccagtacggccttaatccgtgg4680

acgaaagaaatttacgcctttcctgataagcagaatggcatcgttccggtggtgggcgtt4740

gatggctggtcccgcatcatcaatgaaaaccagcagtttgatggcatggactttgagcag4800

gacaatgaatcctgtacatgccggatttaccgcaaggaccgtaatcatccgatctgcgtt4860

accgaatggatggatgaatgccgccgcgaaccattcaaaactcgcgaaggcagagaaatc4920

acggggccgtggcagtcgcatcccaaacggatgttacgtcataaagccatgattcagtgt4980

gcccgtctggccttcggatttgctggtatctatgacaaggatgaagccgagcgcattgtc5040

gaaaatactgcatacactgcagaacgtcagccggaacgcgacatcactccggttaacgat5100

gaaaccatgcaggagattaacactctgctgatcgccctggataaaacatgggatgacgac5160

ttattgccgctctgttcccagatatttcgccgcgacattcgtgcatcgtcagaactgaca5220

caggccgaagcagtaaaagctcttggattcctgaaacagaaagccgcagagcagaaggtg5280

gcagcatgacaccggacattatcctgcagcgtaccgggatcgatgtgagagctgtcgaac5340

agggggatgatgcgtggcacaaattacggctcggcgtcatcaccgcttcagaagttcaca5400

acgtgatagcaaaaccccgctccggaaagaagtggcctgacatgaaaatgtcctacttcc5460

acaccctgcttgctgaggtttgcaccggtgtggctccggaagttaacgctaaagcactgg5520

cctggggaaaacagtacgagaacgacgccagaaccctgtttgaattcacttccggcgtga5580

atgttactgaatccccgatcatctatcgcgacgaaagtatgcgtaccgcctgctctcccg5640

atggtttatgcagtgacggcaacggccttgaactgaaatgcccgtttacctcccgggatt5700

tcatgaagttccggctcggtggtttcgaggccataaagtcagcttacatggcccaggtgc5760

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ttgacgagatcgtgccggagttcatcgaaaaaatggacgaggcactggctgaaattggtt5940

ttgtatttggggagcaatggcgatgacgcatcctcacgataatatccgggtaggcgcaat6000

cactttcgtctactccgttacaaagcgaggctgggtatttcccggcctttctgttatccg6060

aaatccactgaaagcacagcggctggctgaggagataaataataaacgaggggctgtatg6120

cacaaagcatcttctgttgagttaagaacgagtatcgagatggcacatagccttgctcaa6180

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gtggatctagacggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccataatcggcattttct6300

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