两种异喹啉类化合物及其制备方法和应用与流程

本发明属于药物领域，具体涉及异喹啉类化合物，以它们为活性因子成分的药物组合物，以及它们的制备方法和在制备治疗脂肪性肝病等疾病的药物中的应用。

背景技术

脂肪性肝病(fld)是指各种原因引起的肝细胞内过多的脂肪堆积，当脂肪含量超过肝重的5％即称为脂肪肝。fld是一种遗传-环境-代谢应激相关性疾病，大量研究表明，脂肪肝与肝纤维化和肝硬化之间关系密切。无论是何种原因引起的脂肪肝，部分患者最终可发展为肝硬化，因此(fld)为发达国家和地区第一大慢性肝病，对人类健康和社会发展构成严重威胁。

异喹啉生物碱是生物碱类成分的重要组成部分，该类生物碱在植物和微生物中分布较广，结构类型复杂，药用价值大，具有多方面的生理活性，近年的研究表明这类化合物在抗癌、抗虐、抗炎、降脂和治疗心血管疾病等方面有明显的作用，是新药开发的重要资源。

本发明制备的两种新的异喹啉类化合物，对肝脂肪变性有较好的抑制作用，可以作为先导化合物用于对脂肪变性性肝病的治疗。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供两种新的异喹啉类化合物，以它们为活性因子成分的药物组合物，以及它们的制备方法和在制备治疗脂肪性肝病等疾病的药物中的应用。

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

如下结构式所示的异喹啉类化合物1和2，

本发明同时还提供了一种药物组合物，其中含有治疗量的异喹啉类化合物1和/或2，和至少一种药学上可接受的载体，

本发明还提供了所述的异喹啉类化合物1和2的制备方法，该方法以streptomycessp.he-271为发酵菌株，经发酵分离纯化得到产物，发酵前对菌株进行斜面培养、种子培养，

根据所述的异喹啉类化合物1和2的制备方法，所述的发酵培养基组成为：棉籽饼粉20g/l，玉米淀粉30g/l，麦芽糊精30g/l，葡萄糖10g/l，硫酸镁1g/l，酵母提取粉5g/l，caco32g/l，使用去离子水配制，于121℃下灭菌30min，将种子液以5％v/v的移种量接入发酵摇瓶中，发酵摇瓶装液量为50ml/250ml三角烧瓶，于30℃，200rpm旋转式摇床上培养7d；

所述的斜面培养基组成为：斜面培养：培养基组成：大豆粉20g/l，甘露醇20g/l，琼脂粉20g/l，ph7.0～7.2，使用去离子水配制和定容，于121℃下灭菌30min，接菌后置于30℃培养箱中，培养3d；

所述的种子培养基组成为：胰蛋白胨17g/l，植物蛋白胨3g/l,氯化钠5g/l,磷酸氢二钾2.5g/l,葡萄糖2.5g/l，ph7.0～7.2，使用去离子水配制，于121℃下灭菌30min，将成熟平板上的孢子，用灭菌后的接种竹签挖块接种于种子培养摇瓶中，种子摇瓶装液量50ml/250ml，于30℃，200rpm旋转式摇床上培养72h。

根据所述的异喹啉类化合物1和2的制备方法，所述的分离纯化的方法为：发酵液用离心机在4000rpm下离心，上清液用乙酸乙酯进行萃取5-6次，浓缩粗提物后进行硅胶柱层析、c-18柱层析，得化合物。

根据所述的异喹啉类化合物1和2的制备方法，所述硅胶柱层析用到的填料是200～300目的硅胶，流动相为体积比石油醚:乙酸乙酯＝100:0-0:100进行梯度洗脱，流速为50-100ml/min，收集洗脱液，薄层层析检测合并相同组分。

根据所述的异喹啉类化合物1和2的制备方法，所述c-18柱层析，使用c-18反相填料，并且使用的溶剂为体积分数24％乙腈水溶液，进行等度洗脱，流速为3.0ml/min。

所述的异喹啉类化合物1和2在制备降脂类药物中的应用。

所述的异喹啉类化合物1和2在制备治疗脂肪肝和肝硬化的药物中的应用。

本发明还提供了一种上述异喹啉化合物的制备方法，是以streptomycessp.he-271为出发菌株，发酵、分离纯化生产上述化合物。

本发明此外还提供了异喹啉类化合物1和2的具体制备方法，步骤如下：

1)发酵培养streptomycessp.he-271,收集发酵液：

2)将发酵液用乙酸乙酯萃取，将萃取液浓缩后依次进行硅胶柱层析、c-18柱层析、层析后得到该类异喹啉化合物。

本发明的化合物是采用如下具体方法来制备的：

1、发酵

(1)发酵菌种：发酵菌种是streptomycessp.he-271，由东北农业大学生物化工实验室提供。

(2)斜面培养：培养基组成：大豆粉20g/l，甘露醇20g/l，琼脂粉20g/l，ph7.0～7.2，使用去离子水配制和定容，于121℃下灭菌30min，接菌后置于30℃培养箱中，培养5d；

(3)种子培养：种子培养基组成：胰蛋白胨17g/l，植物蛋白胨3g/l,氯化钠5g/l,磷酸氢二钾2.5g/l,葡萄糖2.5g/l，ph7.0～7.2，使用去离子水配制，于121℃下灭菌30min，将成熟平板上的孢子，用灭菌后的接种竹签挖块接种于种子培养摇瓶中，种子摇瓶装液量50ml/250ml，于30℃，200rpm旋转式摇床上培养72h；

(4)发酵：发酵培养基组成：棉籽饼粉20g/l，玉米淀粉30g/l，葡萄糖10g/l，麦芽糊精20g/l，酵母提取粉5g/l，mgso41g/l，调节ph为7.2再加入caco32g/l，使用去离子水配制，于121℃下灭菌30min。将种子液以5％v/v的移种量接入发酵摇瓶中，发酵摇瓶装液量为50ml/250ml三角烧瓶，于30℃，200rpm旋转式摇床上培养7d。

2、发酵液处理

(1)20l发酵液用乙酸乙酯萃取5-6次，将萃取液浓缩后依次进行硅胶柱层析、c-18柱层析后得到该类化合物。

所述的硅胶柱层析用到的填料是200-300目的硅胶，流动相体积比石油醚：乙酸乙酯100：0-0：100进行梯度洗脱(流速为50-100ml/min，每个梯度持续30-40min,每个梯度收集3-4l)，收集洗脱液，薄层层析(tlc)检测合并相同组分。

所述的c-18柱层析，其中使用充满了c-18反相填料，并且使用洗脱溶剂为24％(v/v)的乙腈水溶液进行等度洗脱，流速为3ml/min,收集保留时间为44.8min和51.2min的峰，得到新的化合物。

本发明提供的异喹啉类化合物具有降脂活性，可以作为肝细胞脂肪变药物的先导化合物。

有益效果：采用本发明的方法得到的化合物具有很强的降低脂肪肝细胞脂质含量的活性，具有广泛的应用价值，对我国医药的开发研究具有重要意义。

附图说明：

图1.化合物1和2对hl7702细胞活力的影响。hl7702细胞和化合物1或2培养48个小时然后用mtt检测细胞活力。^*p<0.05，相比对照组。

图2.化合物1或2对hl7702细胞内脂质积累的影响。^##p<0.01，与对照组相比,^*p<0.05，^**p<0.01，与对照组相比。

图3.化合物1或2对细胞内甘油三酯含量的。^##p<0.01，与对照组相比，^**p<0.01，与对照组相比。

图4本发明化合物1的¹h-nmr图谱。

图5本发明化合物1的¹³c-nmr图谱。

图6本发明化合物2的¹h-nmr图谱。

图7本发明化合物2的¹³c-nmr图谱。

具体实施方式：

下面结合附图，用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此来限定本发明。

实施例1：

化合物1和2的制备：

(1)斜面培养：培养基组成(g/l)：大豆粉20g/l，甘露醇20g/l，琼脂粉20g/l，ph7.0～7.2，使用去离子水配制和定容，于121℃下灭菌30min。接菌后置于30℃培养箱中，培养5d。

(2)种子培养：种子培养基组成(g/l)：胰蛋白胨17g/l，植物蛋白胨3g/l,氯化钠5g/l,磷酸氢二钾2.5g/l,葡萄糖2.5g/l，ph7.0～7.2，使用去离子水配制，于121℃下灭菌30min。将成熟平板上的孢子，用灭菌后的接种竹签挖块接种于种子培养摇瓶中，种子摇瓶装液量50ml/250ml，于30℃，200rpm旋转式摇床上培养72h。

(3)发酵：发酵培养基组成(g/l)：棉籽饼粉20g/l，玉米淀粉30g/l，葡萄糖10g/l，mgso41g/l，酵母提取粉5g/l，ph7.2再加caco32g/l，使用去离子水配制，于121℃下灭菌30min。将种子液以5％(v/v)的移种量接入发酵摇瓶中，发酵摇瓶装液量为250ml三角烧瓶，于30℃，200rpm旋转式摇床上培养7d。

(4)化合物分离：20l发酵液经离心机(4000rpm)后得到上清液。上清液用用乙酸乙酯萃取，得到粗提物4.0g。粗提物过硅胶，得到10个组分，经hplc分析发现，主要成分主要集中在100％乙酸乙酯1g，用c-18半制备柱hplc分离得到异喹啉类化合物1和2各10mg，6mg。hplc条件如下：

液相系统：hitachichromaster5430半制备高效液相色谱仪

色谱柱：ymc-triartc-18型色谱柱(250×10mmi.d,5μm)

洗脱剂：乙腈/水＝24：76(v/v)流速3ml/min

检测波长：190-700nm

收集保留时间为44.8min和51.2min的两个化合物。

通过1d、2dnmr和ms等波谱分析确定两个化合物的结构为：

2、核磁分析。

表1本发明化合物1的核磁共振谱的结果图

表2本发明化合物2的核磁共振谱的结果图

实施例2

实施例1中的化合物1和2的药理活性试验及结果(图1、图2、图3)。

图1证明了化合物1对hl7702细胞无细胞毒，化合物2在低浓度下(≤1μm)对hl7702细胞无细胞毒、在高浓度下(＞1um)对hl7702细胞有细胞毒。图2证明了化合物1和2明显降低了脂肪变性肝细胞脂质的积累。图3证明化合物1和2明显降低了脂肪变性肝细胞中内在甘油三酯的含量。

实施例3：

胶囊剂：化合物1或210mg，乳糖187mg，硬脂酸镁3mg。

制备方法：将化合物1或2与助溶剂混和，过筛，均匀混合，把得到的混合物装入硬明胶胶囊，每个胶囊重200mg，活性成分含量为10mg。

实施例8：

片剂：将化合物1或210mg，加入乳糖180mg，淀粉55mg等辅料混合均匀，并用水将其润湿后制成颗粒并干燥，再加入硬脂酸镁5mg混匀后压片，每片约重250mg。

实施例9：

安瓿剂：将化合物1或22mg，氯化钠10mg，溶解于适量的注射用水中，过滤所得溶液，在无菌条件下装入安瓿瓶中。

实施例10：

注射用冻干剂：将化合物1或210mg，碳酸氢钠2mg，甘露醇252mg。

制备方法：将碳酸氢钠、甘露醇，加注射用水溶解，加活性炭吸附30min除热原，过滤去除活性炭，在滤液中加入化合物或其盐，超声处理使溶解，用1n盐酸调节ph为5.0-7.0，微孔滤膜滤过，加注射用水，分装，冷冻干燥，上塞，轧盖，即得。

实施例11：

胶囊剂：将化合物1或210mg，乳糖187mg，硬脂酸镁3mg。

制备方法：将化合物1或2与助溶剂混合，过筛，均匀混合，把得到的混合物装入硬明胶胶囊，每个胶囊重200mg，活性成分含量为10mg。