本发明涉及了一种高亲和力且具有功能性的抗人csf1r的单克隆抗体或抗体片段。本发明同时提供了该抗体的编码核酸分子、表达载体、宿主细胞、以及用于表达该抗体的方法。还提供了包括本发明抗体的抗体免疫偶联缀合物、双特异性分子、嵌和抗原受体、药物组合物以及诊断和治疗方法。
背景技术
集落刺激因子1受体(csf-1r)，属于iii型的受体酪氨酸激酶家族，由原癌基因c-fms编码，蛋白结构包含胞内的激酶结构域和胞外由5个免疫球蛋白类似结构组成的配体结合区。cs1r表达在单核吞噬细胞表面，对单核吞噬细胞的存活、增殖、分化起关键作用(felix,etal.,(2015)structure23,1621-1631)。并且csf1r也高表达在许多种肿瘤细胞表面。例如，csf1r表达与肿瘤组织大小和低存活密切相关。kluger,etal.(2004)clinicalcancerresearch.vol.10,no.1,p.173-7；scholl,etal.(1994)journalofthenationalcancerinstitute.vol.86,no.2,p.120-6.).在卵巢癌和子宫内膜癌，northern杂交分析显示绝大多数肿瘤组织共表达csf1和csf1r，而正常的子宫内膜组织csf1r表达很弱(
csf1r的胞外区结合csf-1后，引发csf1r受体二聚化和其胞内的自身磷酸化，从而起始胞内信号传递。异常的受体酪氨酸激酶iii信号传递导致大量炎症疾病和癌症发生提示胞内的rtkiii型在先天和获得性免疫反应中起中心作用。例如，异常的csf1r信号传递通常出现在诸如类风湿关节炎、动脉粥样硬化及肿瘤生长的多种人类疾病病理状态。(chituandstanley,(2006),curr.opin.immunol.18,39-48；mastellerandwong,(2014),drugdiscov.today,19,1212-1216；pollard(2009),nat.rev.immunol.9,259-270；stanleyandchitu,(2014),perspect.biol.6,a021857；verstraeteandsavvides,(2012),nat.rev.cancer.12,753-766)。
csf1r信号也被证实在骨重塑中发挥生理作用。基因敲除csf1或csf1r的动物通常表现为骨硬化表型。长期以来，csf1r抑制剂作为一种癌症、炎症性疾病或骨质疏松疾病的潜在疗法被深入研究。pexidartinib，一种csf1r的抑制剂，在治疗腱鞘巨细胞瘤的3期临床试验中展示出强劲的疗效。另外一种csf1r抑制剂，cabiralizumab,一种靶向肿瘤相关巨噬细胞的单克隆抗体，正进行转移性胰腺癌的早期临床试验。另一种处于临床ii期的药物jnj-40346527，一种口服的csf1r抑制剂，作用机理为抑制巨噬细胞存活、增殖和分化，但对于疾病修复型抗风湿药难治性活动性类风湿关节炎(dmard-refractoryactiverheumatoidarthritis)治疗无效果。
尽管csf1r抗体已有开发，但对于治疗如上疾病的具备更高亲和力和其他药物关键性质的csf1r抑制剂，特别是单克隆抗体还有待深入研究开发。
技术实现要素：
为了克服上述缺陷，本发明的目的是提供一种抗人csf-1r单克隆抗体及用途，该抗体具有高亲和力和功能性，其优于现有的抗人csf-1r单克隆抗体。
为了达到上述目的，本发明提供一种抗人csf-1r单克隆抗体，其特征在于，该抗体包含：重链和轻链；
所述的重链和轻链均包括可变区，该可变区包括互补决定区；
所述重链的互补决定区cdr1、cdr2和cdr3分别用cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3表示；
所述轻链的互补决定区cdr1、cdr2和cdr3分别用cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3表示；
所述的cdr-h1的氨基酸序列为seqidno：3所示；
所述的cdr-h2的氨基酸序列为seqidno：4所示；
所述的cdr-h3的氨基酸序列为seqidno：5所示；
所述的cdr-l1的氨基酸序列为seqidno：6所示；
所述的cdr-l2的氨基酸序列为seqidno：7所示；
所述的cdr-l3的氨基酸序列为seqidno：8所示。
重链可变区氨基酸序列为seqidno：1所示；轻链可变区氨基酸序列为seqidno：2所示。
一种核苷酸分子，该核苷酸分子编码所述的抗人csf-1r单克隆抗体；
该核苷酸分子的序列选自seqidno：9和/或seqidno：10；
序列seqidno：9编码所述的抗体的重链可变区；
序列seqidno：10编码所述的抗体的轻链可变区。
一种表达载体，该表达载体含有所述的核苷酸分子。
一种宿主细胞，该宿主细胞含有所述的表达载体。
一种抗人csf-1r单克隆抗体的制备方法，该制备方法包含如下步骤：
步骤1：制备含有表达所述的抗人csf-1r单克隆抗体的核苷酸分子的表达载体；
步骤2：用步骤1的表达载体转染真核宿主细胞；
步骤3：培养步骤2转染的真核宿主细胞；
步骤4：分离纯化，获得所述的抗体。
本发明还涉及包括前述的抗人csf-1r单克隆抗体的抗体免疫偶联缀合物、双特异性分子、嵌和抗原受体或药物组合物。
本发明还涉及抗人csf-1r单克隆抗体在制备抗肿瘤药物、类风湿关节炎药物、动脉粥样硬化药物或骨重塑药物中的应用。
所述的重链和轻链都还包括恒定区，该恒定区为人igg的恒定区，优选地为igg1的恒定区。
相对于现有技术，本发明具有以下优点：本发明的能特异识别人csf-1r的单克隆抗体，该抗体与人csf-1r结合的亲和力强于现有抗人csf-1r单克隆抗体，序列新颖。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的技术方案做进一步的说明。
一、抗体的获得
实施例1通过融合杂交瘤技术获得特异性抗csf1r的小鼠单克隆抗体
1.1动物免疫
根据文献中(eharlow,d.lane,antibody:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.,1998)通用的方法免疫小鼠。免疫原为c端含有人igg1fc标签的重组人csf1r(氨基酸区间ile20-glu512)蛋白(acrobiosystems,cat#csr-h5258)。使用重组人csf1r带his标签的蛋白(acrobiosystems,cat#csr-h5228)作为测定血清效价和杂交瘤筛选的检测抗原。简要地，取出适量的福氏佐剂到1.5mlep管中，振荡器混匀。用pbs配制抗原蛋白溶液。按照需要量混匀佐剂和蛋白抗原溶液，通过注射器互推充分乳化抗原形成稳定油包水的溶液,而后进行动物注射。根据血清效价测定结果，首次免疫后通常需要进行2到3次加强免疫后才能达到良好的免疫效果。选择血清效价高的免疫小鼠行腹腔注射终免后进行细胞融合。
1.2杂交瘤融合和筛选
细胞融合前，培养小鼠骨髓瘤细胞(sp2/0-ag14,atcc#crl-1581)处于对数生长期。处死免疫后小鼠无菌环境取脾，根据文献中方法使用peg化学融合脾b淋巴细胞和sp2/0骨髓瘤细胞(eharlow,d.lane,antibody:alaboratorymanual,(coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.,1998)；kohlerg,andmilsteinc,"continuousculturesoffusedcellsecretingantibodyofpredefinedspecificity,"nature,256:495-497(1975))。融合后的细胞铺板96孔细胞培养板，通常7到10天后显微镜下可观察到存活的杂交瘤细胞生长出来。细胞铺板两周后，收集各孔培养上清，以elisa方法用人csf1r-his蛋白抗原进行杂交瘤筛选。简述如下，用60ul2ug/ml的人csf1r-his抗原的pbs溶液包被酶标板，4度(本发明中的“度”指摄氏度)过夜。而后pbst洗板4次后，加入200μl/孔的5％脱脂奶粉的pbst溶液置于37度封闭2小时。再次洗板，加入60μl/孔的杂交瘤上清,37度孵育40分钟，而后洗板4次。以100μl/孔加入稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠二抗(jacksonimmunoresearch,cat#115-036-071),37度孵育40分钟，而后洗板4次,拍干。添加100μl/孔的tmb显色底物,室温显色5到15分钟，而后用1m的硫酸溶液终止,测定450纳米处各孔的吸光值。挑出elisa显色阳性的杂交瘤孔细胞，转移到24孔板中，继续培养。并通过elisa方法进行第二轮复筛，筛选出特异识别csf1r抗原且能阻断csf1r/csf1结合的杂交瘤(结果见表1，其中1e4是本发明得到的杂交瘤，该杂交瘤表达本发明所制得的抗人csf-1r单克隆抗体)，通过有限稀释法亚克隆，获得目标单克隆细胞株。而后通过无血清培养小量表达生产这些单克隆抗体，纯化抗体进行下一步的功能测评分析。
表1csf1r小鼠杂交瘤上清的elisa测评
二、体外分析方法
实施例2用于测定csf1r单克隆抗体功能活性的体外分析方法
2.1基于捕获elsia测定抗体的结合能力
用1xpbs配制羊抗小鼠iggfcr特异的二抗(jacksonimmunoresearch,#115-006-071)，使其终浓度为2μg/ml,以100μl/孔加液于96孔酶标板，4度包被过夜。次日，用含0.05％的吐温20的pbs溶液(即1xpbst)洗板4次后，加入200μl/孔的5％脱脂奶粉的pbst溶液置于37度封闭2小时。再次洗板，加入100μl/孔的稀释抗体溶液或杂交瘤上清后,37度孵育40分钟，而后洗板4次。以100μl/孔加入配制的60nm生物素标记人csf1rfc蛋白溶液(在2.5％脱脂奶粉的pbst中),37度孵育40分钟，而后洗板4次。以100μl/孔加入1：10000稀释的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(jacksonimmunoresearch,#016-030-084),37度孵育40分钟，而后洗板4次,拍干。添加100μl/孔的elisa显色底物tmb,室温显色5到15分钟，而后用1m的硫酸溶液终止显色,测定450纳米处各孔的吸光值。
2.2流式细胞术测评抗体结合细胞膜表面csf1r抗原的结合能力
收集处于对数生长期的膜表面过表达人csf1r的293f细胞系，用pbs洗细胞2次后用facs缓冲液(含2％胎牛血清的pbs溶液)重悬细胞。调节密度，以2x105个细胞/孔铺板于96孔u底板中，300g离心5分钟，倾去上清，添加已梯度稀释的csf1r抗体溶液而后置于冰上孵育40分钟。洗细胞2次，添加100μl/孔藻红蛋白荧光标记的羊抗小鼠二抗(jacksonimmunoresearch,cat#115-116-072，1：1000稀释)，4度避光孵育40分钟后，洗细胞3次，而后每孔加100μl的facs缓冲液重悬，吹匀细胞后上机检测。使用bd公司cantoii型号流式细胞仪测定每孔细胞的荧光强度。使用graphpadprism软件进行数据处理，得出抗体结合细胞的ec50浓度值(即达到该抗体最大荧光结合信号50％时对应的抗体浓度值)。
2.3竞争elisa
2.3.1配体受体结合阻断elisa
通过竞争elisa方法测评csf1r抗体对csf1r/csf1结合的阻断能力。简述如下，用1xpbs配制人的csf1-his蛋白(bsi,cat#bs-ta1601154-96)，使其终浓度为2μg/ml,以100μl/孔加液于96孔酶标板，4度包被过夜。次日，用含0.05％的吐温20的pbs溶液(即pbst)洗板4次后，加入200μl/孔的5％脱脂奶粉的pbst溶液置于37度封闭2小时。再次洗板4次。
把csf1r抗体或对照抗体梯度稀释在含有生物素标记的人csf1rfc蛋白溶液中，配好后室温预孵40分钟。而后把已孵育的抗体和csf1rfcbiotin的溶液以100μl/孔加到包被好csf1-his的板上，37度孵育40分钟后，再次洗板4次。而后以100μl/孔加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素,37度孵育40分钟后洗板4次,拍干。添加100μl/孔的tmb显色和50μl/孔的1m硫酸终止反应，测定450纳米处的吸收值。使用graphpadprism软件进行数据处理，得出抗体阻断csf1r/csf1结合的ic50浓度值。
2.3.2参照抗体阻断elisa
通过竞争elisa方法测评csf1r抗体阻断参照抗体/csf1r抗原结合的阻断能力。简述如下，用1xpbs配制参照抗体(cabiralizumab)，使其终浓度为1μg/ml,以100μl/孔加液于96孔酶标板，4度包被过夜。次日，用含0.05％的吐温20的pbs溶液(即pbst)洗板4次后，加入200μl/孔的5％脱脂奶粉的pbst溶液置于37度封闭2小时，再次洗板4次。
把csf1r抗体或对照抗体梯度稀释在含有生物素标记的人csf1rfc蛋白溶液(10nm)中，配好后室温预孵40分钟。而后把已孵育的抗体和csf1rfcbiotin的溶液以100μl/孔加到包被好参照抗体的板上，37度孵育40分钟后，再次洗板4次。而后以100μl/孔加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素,37度孵育40分钟后洗板4次,拍干。添加tmb显色和1m硫酸溶液终止反应，测定450纳米处的吸收值。使用graphpadprism软件进行数据处理，得出抗体阻断参照抗体/csf1r结合的ic50浓度值。
实施例3抗csf1r小鼠单克隆抗体的结合活性
根据实施例2中描述的分析方法，测评csf1r抗体的结合活性总结如表2。其中benchmark(cabiralizumab)作为对照，是现有的未商业化的抗人csf1r单克隆抗体。从表2可知，本发明的抗人csf-1r单克隆抗体与人csf1r抗原的结合活性明显优于benchmark。
表2纯化csf1r小鼠单克隆抗体的结合活性
实施例4功能性阻断实验(参照2.3的分析方法)，得到基于elisa的抗体功能性实验测评数据
如下表3，汇总了抗csf1r小鼠单克隆抗体的功能性测评结果。
表3纯化csf1r小鼠单克隆抗体的功能性测评
表3中抗体对人csf1/csf1r的竞争elisa实验表明，本发明的1e4抗体可特异阻断csf1r结合其配体csf1，其阻断能力与benchmark相当；同时抗体对benchmark/humancsf1r的竞争elisa实验表明，1e4抗体可阻断bm结合人csf1r抗原,表明1e4结合的抗原表位近似但不同于benchmark抗体。
实施例5dna克隆和测序，抗csf1r小鼠单克隆抗体的可变区蛋白测序
使用trizol试剂(invitrogen,catalog#15596-018)从培养的小鼠单克隆细胞株中提取总rna。过程简述如下，离心收集5x106的细胞到1.5ml离心管中，吸干上清。添加1ml的trizol试剂并反复吹打数次后室温放置5分钟用于裂解细胞。紧接着，每管加入0.2ml的氯仿溶液，剧烈震荡15秒后室温放置3分钟。而后，离心管4度12000g离心10分钟，取出离心管，吸取上层水相溶液到新的1.5ml离心管中，再加入0.4ml的异丙醇用于从水相中沉淀rna。手动混匀ep管并放置室温10min后，4度12000g离心10分钟，弃上清。加入1ml75％的乙醇，再次4度7500rpm离心5min，弃上清。管底rna沉淀于室温干燥10分钟后，加入30到50ul的无菌depc处理水溶解rna样品。
紧接着，选用taraka的逆转录cdna试剂盒(catalog#6110a)把总rna变为cdna。实验体系配制如下，5μl的总rna+0.5μloligo(dt)+8.5μlrnase-free水(共14ul)先置于65度5min预变性，而后放冰上2分钟。进一步加入4μl的5x缓冲液+1μl的dntp混合物+0.5μl的rnase抑制剂+1μl逆转录酶(总共20.5ul体系)，配好后混匀，使用pcr仪运行40度50分钟，70度10min，完成cdna合成。
cdna进一步在3’端加polyg，反应体系配制如下：5μl的cdna样品+33.5μl的ddh2o+5μl的10xtdt缓冲液+5μl的cocl2+1μl的dgtp+0.5μl的末端脱氧核苷酸转移酶(总体积50ul),配好后混匀，使用pcr仪运行37度30分钟，70度10min，完成polyg加尾。
进一步，以加尾的cdna为模板进行抗体可变区的基因扩增。对于扩增抗体重链可变区序列，配制pcr反应体系：10xtaq酶缓冲液5μl+通用polyc引物(正向引物)0.5μl+小鼠igg1反向引物0.5μl+dntp1μl+taq聚合酶1μl+cdna1μl+ddh2o41μl。对于扩增抗体轻链可变区序列，配制pcr反应体系：10xtaq酶缓冲液5μl+通用polyc引物(正向引物)0.5μl+小鼠iggkappa链反向引物0.5μl+dntp1μl+taq聚合酶1ul+cdna1μl+ddh2o41μl。抗体重链和轻链可变区pcr扩增的温度循环如下(其中步骤2到4，重复25个循环)：
1-预变性95℃.5min.
2-变性95℃.20sec.
3-退火56℃.20sec.
4-延伸72℃.30sec.
5-保存25℃.60min。
pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析，切出对应大小的dna区段条带(vh的约600bp，vkappa轻链约500bp)，用qiagen的凝胶dna回收试剂盒(catalog#28704)进行dna的抽提。简述如下：凝胶称重，加3倍凝胶体积的qg缓冲液，而后50度孵育10分钟直到凝胶完全溶解。加入1倍胶体积的异丙醇混匀后，样品移至qia纯化柱，离心13000rpm1分钟。加入750ul的pe缓冲液到柱中，而后13000rpm离心1分钟。并再次13000rpm离心1分钟去除柱中液体残留。加入30ul的水洗脱柱离心1分钟，获得制备的dna样品，纯化的pcr产物经测序获得抗体的可变区序列如表4所示，csf1r小鼠单克隆抗体的氨基酸全长序列如表5所示，csf1r小鼠单克隆抗体的核苷酸序列如表6所示。
表4csf1r小鼠单克隆抗体的可变区氨基酸序列和cdr区
表5csf1r小鼠单克隆抗体的氨基酸全长序列
表6csf1r小鼠单克隆抗体的dna编码序列
综上所述，本发明的能特异识别人csf-1r的单克隆抗体，该抗体与人csf-1r结合的亲和力强，序列新颖。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。
序列表
<110>博奥信生物技术(南京)有限公司
<120>抗人csf-1r单克隆抗体及用途
<130>xhx2018071803
<141>2018-07-18
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