本发明涉及药物领域，具体而言，涉及一种特异性卵黄多克隆抗体及其应用。
背景技术
宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤。原位癌高发年龄为30～35岁，浸润癌为45～55岁，近年来其发病有年轻化的趋势。大量研究表明，宫颈癌源自一种人乳头瘤病毒(hpv)，这种病毒的感染在18～28岁之间的青年人中最为常见。人乳头瘤病毒感染没有体征和症状，且可以通过性生活进行传播，具有较大的危害性，所以对于人乳头瘤病毒的防治尤为重要。
现有技术中对于引起宫颈癌炎症的预防多采用抗菌素，不但预防效果甚微，长期使用还容易产生耐药性，并破坏了女性阴道内正常菌群的平衡，导致炎症的反复发作、难以根治。此外，大多数妇女由于体质原因，阴道分泌物显著减少，使用这类抗菌素产品不仅不利于阴道内微生物菌群正常生存，更容易引发阴道干涩等多种妇科杂症。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种特异性卵黄多克隆抗体，其可以针对宫颈癌的主要致病菌人乳头瘤病毒及混合感染的常见五种致病菌进行特异性抑灭，调节阴道微生物菌群的平衡，对宫颈癌具有较好的预防作用。该特异性卵黄多克隆抗体的来源天然，长期使用下无残留、无耐药性、安全性高。
本发明的另一目的在于提供一种上述特异性卵黄多克隆抗体在制备预防宫颈癌的药物中的应用，该特异性卵黄多克隆抗体可以针对宫颈癌的主要致病菌人乳头瘤病毒及混合感染的常见五种致病菌进行特异性抑灭，具有较好的应用价值。
本发明的实施例是这样实现的：
一种特异性卵黄多克隆抗体，该特异性卵黄多克隆抗体是以人乳头瘤病毒、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、白色念珠菌、a簇b型溶血性链球菌这六种致病菌作为抗原制备的。
一种上述特异性卵黄多克隆抗体在制备预防宫颈癌的药物中的应用。
本发明实施例的有益效果是：
本发明实施例提供了一种特异性卵黄多克隆抗体，其以人乳头瘤病毒、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、白色念珠菌、a簇b型溶血性链球菌这六种致病菌作为抗原制备而成。其不仅针对于可导致宫颈癌的人乳头瘤病毒具有较好的抑灭效果，还对于其并发混合感染的五种常见致病菌也具备较佳的抑灭效果。可以较好地调节阴道内微生物菌群的平衡，对宫颈癌具有较好的预防作用，在制备预防宫颈癌的药物中具有较大应用价值。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例的一种特异性卵黄多克隆抗体及其制备方法进行具体说明。
本发明实施例提供了一种特异性卵黄多克隆抗体，该特异性卵黄多克隆抗体是以人乳头瘤病毒、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、白色念珠菌、a簇b型溶血性链球菌这六种致病菌作为抗原制备的。
宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤。原位癌高发年龄为30～35岁，浸润癌为45～55岁，近年来其发病有年轻化的趋势。大量研究表明，宫颈癌源自一种人乳头瘤病毒(hpv)，这种病毒的感染在18～28岁之间的青年人中最为常见。人乳头瘤病毒感染没有体征和症状，且可以通过性生活进行传播，具有较大的危害性，所以对于人乳头瘤病毒的防治尤为重要。另一方面，很多女性均患有不同程度的阴道炎或宫颈糜烂，进一步增加了感染人乳头瘤病毒的几率，对于这部分人群就应当尽早引起重视并采取有效预防措施，防止宫颈癌的发生。
为了抑制人乳头瘤病毒以及其它五种致病菌的繁殖并将其杀灭，恢复阴道内环境平衡，发明人研发了对这六种致病菌有特异性抑灭作用的卵黄多克隆抗体。
进一步地，该特异性卵黄多克隆抗体的制备方法包括：
s1.将经过灭活处理的人乳头瘤病毒、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、白色念珠菌、a簇b型溶血性链球菌混合均匀，制成复合抗原。
其中，按照重量份数计，复合抗原包括灭活后的人乳头瘤病毒32～38份、金黄色葡萄球菌8～13份、大肠杆菌份12～16份、绿脓杆菌21～29份、白色念珠菌8～16份、a簇b型溶血性链球菌15～25份。
优选地，按照重量份数计，复合抗原包括灭活后的人乳头瘤病毒34～36份、金黄色葡萄球菌9～11份、大肠杆菌份13～15份、绿脓杆菌23～25份、白色念珠菌11～14份、a簇b型溶血性链球菌18～22份。
可选地，在制备复合抗原时，需要先对六种致病菌进行培养，培养的具体方法包括：选取人乳头瘤病毒、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、白色念珠菌、a簇b型溶血性链球菌这六种致病菌分别用lb培养基在35～40℃下培养16～20h后，再接种至肉汤培养基中培养20～28h。
可选地，lb培养基包括0.7wt％～1.3wt％的胰蛋白胨、0.3wt％～0.7wt％的酵母提取物、0.8wt％～1.2wt％的氯化钠和1.2wt％～1.8wt％的琼脂。
可选地，肉汤培养基包括0.1wt％～0.5wt％的牛肉提取物、0.7wt％～1.3wt％的胰蛋白胨、0.3wt％～0.7wt％的氯化钠和1.2wt％～1.8wt％的琼脂。
接种到肉汤培养基后，在35～40℃环境下，于恒温双层振荡培养箱中培养20～28h，恒温双层振荡培养箱的转速控制在100～300rpm，培养完成后灭活待用。
进一步地，将经过灭活处理的人乳头瘤病毒、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、白色念珠菌、a簇b型溶血性链球菌混合均匀后，加入到0.05～0.2mol/l的pbs溶液中进行溶解，并加入等体积的弗氏佐剂，均匀搅拌制得乳状全菌复合抗原，将乳状全菌复合抗原在高速匀浆机中粉碎匀化，即可得到所需的复合抗原。
进一步地，该特异性卵黄多克隆抗体的制备方法还包括：
s2.利用复合抗原对禽类进行强化免疫，得到免疫蛋。
进一步地，对禽类进行强化免疫是将复合抗原注射在20～22周大的禽类的胸肌和大腿处，每处分别注射0.5～1ml；然后每隔10天强化注射一次，共免疫四次；首次注射时所用的弗氏佐剂为弗氏不完全佐剂，第二次到第四次所采用的弗氏佐剂为完全弗氏佐剂，在最后一次注射后收集经过强化免疫的禽类所产的蛋。
优选地，进行强化免疫的禽类为鸡，优选为海兰褐鸡、京红鸡、伊莎白鸡和白来航蛋鸡中的任一种。
更为优选地，以鸡为例，进行强化免疫的鸡通过如下方法选择：用人乳头瘤病毒、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、白色念珠菌、a簇b型溶血性链球菌制作复合抗原，并用复合抗原免疫母鸡，每次注射0.5～1ml抗原，在第一次注射后，每隔二周再强化注射一次，共三次；于第一次注射后第7个月，把这些鸡所产的蛋标记后分别提取其中的igy，以elisa法检测所制得的igy的效价；再比较其效价，选出其中能制得igy效价≥1:128的鸡只，再用这批鸡所产的蛋孵出鸡种，待其长大至20～22周，作为进行强化免疫的鸡。
进一步地，该特异性卵黄多克隆抗体的制备方法还包括：
s3.对免疫蛋进行分离、提纯，得到特异性卵黄多克隆抗体。
对免疫蛋进行提取、纯化的步骤包括：将免疫蛋的蛋黄与水混合，调节ph至4.0～6.0后冷却至-4～4℃，静置1～2天后固液分离，将所得液体浓缩后去除脂蛋白，超微膜过滤除菌，再经离子交换柱和凝胶交换柱进行纯化。
具体地，对免疫蛋进行提取、纯化的步骤可以是：将免疫蛋的蛋黄与水按照1:6的比例混合均匀，并调试ph至5.0；然后将其冷却至4℃，静置24小时；然后经高速离心分离机离心分离20min；将分离所得的上清再加入超滤器中进行超滤并浓缩20倍，将质量浓度为14％的硫酸钠溶液加入浓缩后的浆料中，充分搅拌；再经高速离心机离心分离，取上清，去除脂蛋白；将离心分离后的浆料加入超滤机，过超微膜进行过滤除菌；将过滤除菌后的产品用冷冻干燥机进行冷冻干燥，即制得粗提物干粉成品。
进一步地，本发明实施例还提供了一种上述特异性卵黄多克隆抗体在制备预防宫颈癌的药物中的应用。该特异性卵黄多克隆抗体可以针对宫颈癌疾病中常见的六种致病菌进行特异性抑灭，具有较好的应用价值。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步地详细描述。
实施例1
本实施例提供一种特异性卵黄多克隆抗体，其制备方法如下：
s1.选取人乳头瘤病毒、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、白色念珠菌、a簇b型溶血性链球菌这六种致病菌，分别在38℃环境下用lb培养基在三气培养箱中培养18h；然后将上述菌种分离并分接种到肉汤培养基中，在38℃环境下在恒温双层振荡培养箱中培养23h，恒温振荡培养箱的转速为200rpm，然后灭活备用。
将经灭活处理后的六种致病菌按照人乳头瘤病毒32份、金黄色葡萄球菌8份、大肠杆菌16份、绿脓杆菌29份、白色念珠菌8份、a簇b型溶血性链球菌25份混合匀制得菌株混合体。
将混合好的菌株混合体溶解在0.1mol/l的pbs溶液中制得菌株混合体溶液，菌株混合体溶液的浓度为1mg/ml，加入等体积的弗氏佐剂并搅拌均匀，制得乳状全菌复合抗原。将乳状全菌复合抗原放入高速匀浆机中，高速粉碎匀化，制得全菌和菌体成份的复合抗原。
s2.将上述制得的复合抗原注射在20周大的鸡的胸肌和大腿处，每处分别注射0.5ml；然后每隔10天强化注射一次，共免疫四次。首次注射时所用的弗氏佐剂为弗氏不完全佐剂，第二次到第四次所采用的弗氏佐剂为完全弗氏佐剂。在最后一次注射后收集经过强化免疫的鸡所产的鸡蛋。
s3.将免疫蛋的蛋黄与水按照1:6的比例混合均匀，并调试ph至5.0；然后将其冷却至4℃，静置24h；经高速离心分离机离心分离20min；将分离所得的上清再加入超滤器中进行超滤并浓缩20倍，将质量浓度为14％的硫酸钠溶液加入浓缩后的浆料中，充分搅拌；再经高速离心机离心分离，取上清，去除脂蛋白；将离心分离后的上清加入到超滤机，过超微膜进行过滤除菌；将过滤除菌后的产品用冷冻干燥机进行冷冻干燥，即制得粗提物干粉成品。将粗提物干粉成品经离子交换柱和凝胶交换柱进行纯化。
实施例2
本实施例提供一种特异性卵黄多克隆抗体，其制备方法如下：
s1.选取人乳头瘤病毒、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、白色念珠菌、a簇b型溶血性链球菌这六种致病菌，分别在37℃环境下用lb培养基在三气培养箱中培养20h；然后将上述菌种分离并分接种到肉汤培养基中，在37℃环境下在恒温双层振荡培养箱中培养28h，恒温振荡培养箱的转速为300rpm，然后灭活备用。
将经灭活处理后的六种致病菌按照人乳头瘤病毒38份、金黄色葡萄球菌13份、大肠杆菌12份、绿脓杆菌21份、白色念珠菌16份、a簇b型溶血性链球菌15份混合匀制得菌株混合体。
将混合好的菌株混合体溶解在0.2mol/l的pbs溶液中制得菌株混合体溶液，菌株混合体溶液的浓度为1mg/ml，加入等体积的弗氏佐剂并搅拌均匀，制得乳状全菌复合抗原。将乳状全菌复合抗原放入高速匀浆机中，高速粉碎匀化，制得全菌和菌体成份的复合抗原。
s2.将上述制得的复合抗原注射在20周大的鸡的胸肌和大腿处，每处分别注射1ml；然后每隔10天强化注射一次，共免疫四次。首次注射时所用的弗氏佐剂为弗氏不完全佐剂，第二次到第四次所采用的弗氏佐剂为完全弗氏佐剂。在最后一次注射后收集经过强化免疫的鸡所产的鸡蛋。
s3.将免疫蛋的蛋黄与水按照1:6的比例混合均匀，并调试ph至4.0；然后将其冷却至4℃，静置24h；经高速离心分离机离心分离20min；将分离所得的上清再加入超滤器中进行超滤并浓缩20倍，将质量浓度为14％的硫酸钠溶液加入浓缩后的浆料中，充分搅拌；再经高速离心机离心分离，取上清，去除脂蛋白；将离心分离后的上清加入到超滤机，过超微膜进行过滤除菌；将过滤除菌后的产品用冷冻干燥机进行冷冻干燥，即制得粗提物干粉成品。将粗提物干粉成品经离子交换柱和凝胶交换柱进行纯化。
实施例3
本实施例提供一种特异性卵黄多克隆抗体，其制备方法如实施例1所示，其区别在于，本实施例中，复合抗原由人乳头瘤病毒34份、金黄色葡萄球菌10份、大肠杆菌14份、绿脓杆菌25份、白色念珠菌11份、a簇b型溶血性链球菌20份混合制备得到。
实施例4
本实施例提供一种特异性卵黄多克隆抗体，其制备方法如实施例1所示，其区别在于，本实施例中，复合抗原由人乳头瘤病毒35份、金黄色葡萄球菌8份、大肠杆菌13份、绿脓杆菌28份、白色念珠菌9份、a簇b型溶血性链球菌23份混合制备得到。
试验例
选取200例患有宫颈炎、宫颈糜烂的患者，分成5组，按照表1中的药物，在每组患者的病灶处擦拭实施例1～4所提供的特异性卵黄多克隆抗体膏剂，每天早晚各一次，分别于第1天、第2天、第4天、第8天和第10天，擦拭患者宫颈灶处对人乳头瘤病毒(hpv)、金黄色葡萄球菌(sa)、大肠杆菌(ec)、绿脓杆菌(pa)、白色念珠菌(ca)、a簇b型溶血性链球菌(gsa)的增长率进行检测，结果如表1所示。
表1六种致病菌的增长率检测结果(％)
由表1可以看出，本申请实施例1～4所提供的特异性卵黄多克隆抗体制剂对于人乳头瘤病毒(hpv)、金黄色葡萄球菌(sa)、大肠杆菌(ec)、绿脓杆菌(pa)、白色念珠菌(ca)、a簇b型溶血性链球菌(gsa)均表现出明显的抑制作用，4天时间能够将细菌增长率抑制到15％以下，到了第8天，更是能抑制到2％以下，到了第10天，显现完全抑制作用，抑制效果明显。
综上所述，本发明实施例提供了一种特异性卵黄免疫球蛋白多克隆抗体，其以人乳头瘤病毒、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、白色念珠菌、a簇b型溶血性链球菌这六种致病菌作为抗原制备而成。其不仅针对于可导致宫颈癌的人乳头瘤病毒具有较好的抑灭效果，还对于阴道内另外五种常见致病菌也具备较佳的抑灭效果。可以较好地调节阴道内微生物菌群的平衡，对宫颈癌具有较好的预防作用，在制备预防宫颈癌的药物中具有较大应用价值。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。