盐生草染色体着丝粒卫星DNApBv序列的分离及其应用的制作方法

本发明属于植物科学领域；具体涉及一种盐生草染色体着丝粒卫星DNA pBv序列的分离的方法，及其在分子标记开发和物种鉴定中的应用。

背景技术：

真核生物着丝粒序列由高度重复的卫星DNA序列和着丝粒反转录转座子组成。着丝粒高度重复的卫星DNA序列，是高等植物着丝粒的序列组成之一。在有些物种如大麦中，着丝粒序列组成中占主导地位的是卫星 DNA序列，是主要的结构性因子，以串联形式排列，目前已在多种物种中发现。着丝粒卫星DNA序列的普遍特征是高度异质性，它们可以通过一系列的突变过程，如可移动元件的复制跳跃、不等交换、转座和切除等，使其序列扩张或缩小，或从新的位点重新开始，从而完成序列的异质化。这些卫星DNA有着严格的物种特异性，即使在同一物种的不同染色体上，着丝粒卫星DNA的数量也不尽相同。因此，分析着丝粒区卫星DNA结构及其分布模式等特点，必将有助于从中找出保守的功能与变异的结构关系，从而为真核生物着丝粒的进化研究提供依据，同时，近年来着丝粒高度重复的卫星DNA序列也成为基因克隆，基因功能研究和表达特征分析与生物多样性分析的重要工具。因此，着丝粒高度重复的卫星DNA能够开发成一类分子标记，在植物遗传变异分析中广泛应用。盐生草（Halogeton glomeratus）为藜科（Chenopodiaceae）一年生抗旱耐盐盐生植物，是研究植物抗旱耐盐机理和发掘抗旱耐盐基因的优异材料。然而，针对该物种，目前对其基因组基础研究缺乏，极大地限制了该物种的研究深度和利用价值的开发，为进一步加快盐生草研究进度、拓宽盐生草的利用途径，有必要分析盐生草着丝粒区重复序列的结构及其分布模式。

现有技术存在的问题：现有技术中未见关于盐生植物着丝粒卫星DNA pBv序列分离和应用的报道，尤其是基于PCR特异性扩增分离染色体着丝粒卫星DNA pBv序列的研究。

技术实现要素：

本发明提供了一种盐生植物盐生草着丝粒卫星DNA pBv序列的分离及其应用方法及其在荧光原位杂交中的应用，可用于分析盐生草染色体着丝粒区重复序列结构及其分布模式及其在分子标记开发和物种鉴定中的应用。

为了解决技术问题，本发明所采用的技术方案是：盐生草染色体着丝粒卫星DNA pBv序列的分离及其应用，其具体操作步骤为：

（1）盐生草pBv序列克隆与测序

根据植物中染色体着丝粒卫星DNA pBv序列保守基序设计引物，以盐生草基因组DNA为模板，进行PCR扩增，获得目标片段，然后回收目标片段，并连接到克隆载体，转化大肠感菌，筛选阳性克隆，进行脱氧核苷酸组成测序分析，得到盐生草着丝粒卫星DNA pBv序列序列，具体如SEQ ID No：1所示，为327 bp：

此步骤所用到的引物序列为：

上游引物F: 5’- GGATCCACACAAACCTCTATTTGTA -3’

下游引物R: 5’- TAATAGAGGTTAATGAAAGATCC -3’

所示引物进行PCR扩增的反应体系与具体程序如下：

PCR扩增反应体系为10×Ex Taq Buffer（Mg²⁺Plus）2.5μL，dNTP Mixture（各2.5 mM）2μL，上游引物F（10 uM）1μL，下游引物R（10 uM）1μL，盐生草模板DNA 1μL，Ex Taq酶 0.2 μL，dd H2O 17.3μL，总体积为25 μL。

PCR扩增程序为94℃预变性4 min，94℃变性45s，50.8℃退火30s，72℃延伸1min，进行34个循环，72℃延伸10 min。

（2）制备地高辛标记探针

根据步骤1获得的包含盐生草染色体着丝粒卫星DNA pBv序列质粒DNA用作探针DNA，采用DIG-Nick Translation Mix地高辛标记试剂盒进行标记，其反应体系为探针DNA 1 μL，Nick Translation Mix 4 μL。在15℃恒温水浴中标记1.5 h-2.0 h，然后-20℃避光冷冻。

（3）盐生草中期染色体制备

将经膨大素处理过的盐生草种子置于培养皿中在黑暗条件下28℃进行培养，当根长至1-1.5cm左右时将根尖取下，在4℃冰水混合物里处理30 h左右。在25℃下固定（固定液为95%乙醇与冰醋酸按照3：1的体积比例配置）12-24 h后，在37℃下酶解60-70 min，最后在显微镜下挑选细胞分裂相较多，染色体清晰，分散效果较好的根尖片子，在液氮液面上空冷冻5min，用薄刀片揭下盖玻片，迅速放在65-70℃加热烘干。

（4）荧光原位杂交预处理及信号检测

将步骤3制好的片子在60℃烘3 h，每张片子上加入100-200 μg/ml RNaseA 70μL，37℃消化1 h，然后在室温下用2×SSC（标准柠檬酸钠），洗涤3次，每次5 min；然后依次经70%、95%、100%的乙醇脱水5min，风干片子。接着片子在2×SSC配制的70%甲酰胺，温度71-72℃条件下变性2 min，再依次置于-20℃的70%、90%、100%的酒精中5 min，最后室温晾干。配置杂交混合液，包括去离子甲酰胺 10 μL，50%硫酸葡聚糖 4 μL，20%硫酸葡聚糖（PH=7.0）2 μL， 10 mg/ml ssDNA 1-3 μL，用去离子水补充至 20 μL。先将杂交混合液沸水浴10 min，后置于冰上10 min。滴加20 μL变性好的杂交液至载玻片上，盖上塑料盖片，37℃杂交6 h以上，将杂交好的片子在42℃条件下分别经过2×SSC，0.1×SSC，2×SSC各处理5 min；然后在室温下经过2×SSC，4×SSC/Tween20 0.2%各处理5 min。 每片加5% BSA（4×SSC/Tween20 0.2%配制）70 μL，加塑料盖片，37℃条件下温浴20-30分钟，接着每片加5% BSA（4×SSC/ Tween20 0.2%配制）稀释100倍的avidin-rhodamine检测 70 μL，加塑料盖片，37℃，水浴60 min；4×SSC/Tween20 0.2%，42℃洗涤2次，每次8 min；每张片子加20μL抗褪色剂（含DAPI）； 加玻璃盖玻片黑暗下染色2-3分钟；最后在荧光显微镜下观察，选染色体分散好的，杂交信号清晰的分裂相，并用CCD（Leica公司）照相机采集图像。

本发明有益效果：

本发明针对盐生草着丝粒卫星DNA pBv序列的分离和其在荧光原位杂交应用而设计，针对性强，PCR产物的特异性高。荧光原位杂交结果显示pBv序列存在于盐生草的个别染色体上，且在染色体臂也出现杂交信号。

本发明中获得盐生草着丝粒卫星DNA pBv序列尚属首次分离，在明确盐生草染色体着丝粒区重复序列结构及其分布模式的同时，更是为以后基于盐生草着丝粒卫星DNA pBv 序列的分析标记开发提供依据，将广泛应用于盐生植物遗传变异与进化分析和物种鉴别的研究。

附图说明

图1为本发明pBv序列序列PCR克隆凝胶电泳图。

图2为本发明pBv序列与盐生草染色体的荧光原位杂交图。

其中，图2图中指向杂交信号。

具体实施方式

为使发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。这些优选实施方式的示例在附图中进行了例示。附图中所示和根据附图描述的本发明的实施方式仅仅是示例性的，并且本发明并不限于这些实施方式。

在此，还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本发明的技术方案，在附图中仅仅示出了与根据本发明的方案密切相关的结构和/或处理步骤，而省略了关系不大的其他细节。

实施例1

该实施例提供盐生草染色体着丝粒卫星DNA pBv序列的分离方法，具体包括如下步骤：

根据植物中染色体着丝粒卫星DNA pBv序列保守基序设计引物，提取盐生草基因组DNA，以基因组DNA为模板，进行PCR扩增，获得目标片段（图1），然后回收目标片段，并连接到pMD19-T克隆载体上，转化大肠感菌DH-5a感受态细胞，筛选阳性克隆，通过PCR菌液检测，提取合适菌液的质粒送至华大基因进行测序分析，得到盐生草着丝粒卫星DNA pBv序列，具体如SEQ ID No：1所示，大小为327 bp（图1）：

此步骤所用到的引物序列为：上游引物F: 5’- GGATCCACACAAACCTCTATTTGTA-3’；下游引物R: 5’- TAATAGAGGTTAATGAAAGATCC-3’。所示引物进行PCR扩增的反应体系与具体程序如下：PCR扩增反应体系为10×Ex Taq Buffer（Mg²⁺Plus）2.5μL，dNTP Mixture（各2.5 mM）2μL，上游引物F（10 uM）1μL，下游引物R（10 uM）1μL，盐生草模板DNA 1μL，Ex Taq酶 0.2 μL，dd H2O 17.3μL，总体积为25 μL。

PCR扩增程序为94℃预变性4 min，94℃变性45s，50.8℃退火30 s，72℃延伸60 s，进行34个循环，72℃延伸10 min。

实施例 2

该实施例提供盐生草染色体着丝粒卫星DNA pBv序列的作为分子标记，在分析物种遗传变异与进化分析中的应用，具体包括如下步骤：

（1）制备地高辛标记探针

根据实施例子1获得包含盐生草着丝粒卫星DNA pBv序列元件质粒DNA用作探针DNA，采用DIG-Nick Translation Mix地高辛标记试剂盒进行标记，其反应体系为探针DNA 1 μL，Nick Translation Mix 4 μL。在15℃恒温水浴中标记1.5 h-2.0 h，然后-20℃避光冷冻。

（2）盐生草中期染色体制备

将经膨大素处理过的盐生草种子置于培养皿中在黑暗条件下28℃进行培养，当根长至1-1.5cm左右时将根尖取下，在4℃冰水混合物里处理30 h左右。在25℃下固定（固定液为95%乙醇与冰醋酸按照3：1的体积比例配置）12-24 h后，在37℃下酶解60-70 min，最后在显微镜下挑选细胞分裂相较多，染色体清晰，分散效果较好、染色体处于有丝分裂中期的根尖片子，用染色体由DAPI衬染后，发现盐生草为2倍体物种，其染色体数目为18，即2n=18。将片子在液氮液面上空冷冻5min，用薄刀片揭下盖玻片，迅速放在65-70℃加热烘干。

（3）荧光原位杂交预处理及信号检测

将步骤3制好的片子在60℃烘3 h，每张片子上加入100-200 μg/ml RNaseA 70 μL，37℃消化1 h，然后在室温下用2×SSC（标准柠檬酸钠），洗涤3次，每次5 min；然后依次经70%、95%、100%的乙醇脱水5min，风干片子。接着片子在2×SSC配制的70%甲酰胺，温度71-72℃条件下变性2 min，再依次置于-20℃的70%、90%、100%的酒精中5 min，最后室温晾干。配置杂交混合液，包括去离子甲酰胺 10 μL，50%硫酸葡聚糖 4 μL，20%硫酸葡聚糖（PH=7.0）2 μL， 10 mg/ml ssDNA 1-3 μL，用去离子水补充至 20 μL。先将杂交混合液沸水浴10 min，后置于冰上10 min。滴加20 μL变性好的杂交液至载玻片上，盖上塑料盖片，37℃杂交6 h以上，将杂交好的片子在42℃条件下分别经过2×SSC，0.1×SSC，2×SSC各处理5 min；然后在室温下经过2×SSC，4×SSC/Tween20 0.2%各处理5 min。 每片加5% BSA（4×SSC/Tween20 0.2%配制）70 μL，加塑料盖片，37℃条件下温浴20-30分钟，接着每片加5% BSA（4×SSC/ Tween20 0.2%配制）稀释100倍的avidin-rhodamine检测 70 μL，加塑料盖片，37℃，水浴60 min；4×SSC/Tween20 0.2%，42℃洗涤2次，每次8 min；每张片子加20μL抗褪色剂（含DAPI）；加玻璃盖玻片黑暗下染色2-3分钟；最后在荧光显微镜下观察，选染色体分散好的，杂交信号清晰的分裂相，并用CCD（Leica公司）照相机采集图像，其荧光原位杂交的典型特征如附图2所示。从附图2箭头所指可以看出，pBv序列并不在盐生草的染色体上均匀分布，而是存在于个别染色体上，且在染色体臂也出现杂交信号，具有物种特异性。由于盐生草染色体较小，杂交信号较弱，在显微镜下观察到的信号比采集到的图片上的信号更为清楚。因此，进一步可采集不同盐生植物材料或不同地域盐生草材料，采用上述荧光原位杂交程序，基于染色上着丝粒卫星DNA pBv序列的有无和分布特征，分析物种遗传变异与进化的特征。

实施例3

该实施例提供盐生草染色体着丝粒卫星DNA pBv序列在物种鉴定中的应用，具体包括如下步骤：

（1）盐生草pBv序列克隆与测序

根据植物中染色体着丝粒卫星DNA pBv序列保守基序设计引物，提取盐生草基因组DNA，以基因组DNA为模板，进行PCR扩增，获得目标片段（图1），然后回收目标片段，并连接到pMD19-T克隆载体上，转化大肠感菌DH-5a感受态细胞，筛选阳性克隆，通过PCR菌液检测，提取合适菌液的质粒送至华大基因进行测序分析，得到盐生草着着丝粒卫星DNA pBv序列，具体如SEQ ID No：1所示，大小为327 bp：

此步骤所用到的引物序列为：上游引物F: 5’- GGATCCACACAAACCTCTATTTGTA -3’；下游引物R: 5’- TAATAGAGGTTAATGAAAGATCC -3’。所示引物进行PCR扩增的反应体系与具体程序如下：PCR扩增反应体系为10×Ex Taq Buffer（Mg²⁺Plus）2.5μL，dNTP Mixture（各2.5 mM）2μL，上游引物F（10 uM）1μL，下游引物R（10 uM）1μL，盐生草模板DNA 1μL，Ex Taq酶 0.2 μL，dd H2O 17.3μL，总体积为25 μL。

PCR扩增程序为94℃预变性4 min，94℃变性45s，50.8℃退火30 s，72℃延伸60 s，进行34个循环，72℃延伸10 min。

（2）盐生草着丝粒卫星DNA pBv序列特异性分析和物种鉴定

为了进一步验证着丝粒卫星DNA pBv序列在盐生草中的特异性，提取了与盐生草同科植物的藜麦和甜菜的DNA，采用步骤1中同样的引物序列和PCR反应体系进行扩增pBv序列，发现在藜麦和甜菜中并没有扩增出条带（附图1），因此，可以确定本发明中获得的盐生草pBv序列具有物种特异性，可以用于盐生草物种特异性的鉴定。

该盐生草着丝粒卫星DNA pBv序列经Genebank检索，仅与甜菜卫星pBV1的序列相似，一致性为91%。但上述实验证明该引物序列（上游引物F: 5’- CAAGGAGAAGATGGTGAAGGAAGTA-3’；下游引物R: 5’- GAGCTTCTAGTTTGAGTCTACTTTGTG -3’）仅能扩增该盐生草着丝粒卫星DNA pBv序列。

综上所述，序列表所示该盐生草着丝粒卫星DNA pBv序列具有高度物种特异性，能够用于盐生草物种鉴定和分子标记。

以上所述仅是本申请的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。

序列表

<110> 甘肃农业大学

<120> 盐生草染色体着丝粒卫星DNA pBv序列的分离及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 327

<212> DNA

<213> 盐生草(Halogeton glomeratus)

<400> 1

ggatccacac aaacctctat ttgtaagttc aatgcaatgc actcgaattg ttaaattaaa 60

acactcacac acgtgatttg agggaattag actcacaatc ataataagac ccctatatca 120

ttcaaaaact aaaaaaaaga attatagagc aaatgatgtg tttgtggatc gtaaaatcaa 180

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