棒状杆菌基因JNy31014在提高L-赖氨酸产量中的应用的制作方法

本发明涉及棒状杆菌基因jny31014在提高l-赖氨酸产量中的应用，属于生物技术技术领域。

背景技术：

赖氨酸是一种必需氨基酸，在维持人体氮平衡中起重要作用，是衡量食物营养价值的重要指标之一。食物中的蛋白质进入人体后经过消化先分解成氨基酸，人体在利用这些氨基酸合成新的人体蛋白质，在各种氨基酸中，赖氨酸是最重要的一种，没有它，其他氨基酸就受到限制或得不到利用，因此科学家称它为人体第一必须氨基酸。赖氨酸功能繁多：主要作用有促进人体发育、增强免疫功能；促进蛋白质、钙质的吸收和利用；提高儿童智力，促进身高和体重的增加；增加食欲，增强体质，改善营养不良；降低血中甘油三酯的水平，预防心血管疾病的发生；提高中枢神经组织功能等。目前主要在谷物、肉、大豆、奶、蛋等食物中获得。

目前，可以通过不同的方法来生产l-赖氨酸，包括微生物发酵法(一步发酵法、两步发酵法)、酶法、蛋白水解法等。最常用的方法是微生物发酵法，是借助微生物具有生物合成自身所必需氨基酸的能力，利用微生物的代谢作用，通过对菌株进行改造，选育出各种氨基酸营养缺陷型和氨基酸结构类似物抗性突变株，从而解除生物合成途径中的反馈阻遏和抑制作用，达到过量积累代谢途径中l-赖氨酸的目的。

用于生产l-赖氨酸的微生物包括多种属，如棒状杆菌(如谷氨酸棒杆菌corynebacteriumglutamicum和钝齿棒杆菌corynebacteriumcrenatum)、短杆菌(如黄色短杆菌breibacteriumflavum和乳酸发酵短杆菌brevibacteriumlactofermentus)、洛卡氏菌、念球菌、假单胞菌、埃希氏菌(如大肠杆菌escherichiacoli)和芽孢杆菌(如浸麻芽孢杆菌bacillusmacerans)、古生菌(如热变形菌thermoprotensneutrophilus)以及真菌中的酵母菌(如隐球酵母cryptococcusneoformans)等。目前，国内外用于工业化生产l-赖氨酸的菌株多为谷氨酸棒杆菌(c.glutamicum)、黄色短杆菌(b.flavum)、乳酸发酵短杆菌(b.lactofermentus)和大肠杆菌(e.coli)的改造型菌株。目前，国内外对l-赖氨酸生产菌种的选育主要通过诱变育种技术和代谢工程育种技术。代谢工程育种是从分子水平上通过最小限度的、最明确的基因改造来优化选育菌株。然而，与野生型菌株相比较，这些菌株存在很大的缺陷，如生长速度缓慢，糖耗速率低，对外界不良环境耐受力差等。随着生物技术的发展及谷氨酸棒杆菌基因组的解析，传统诱变育种获得l-赖氨酸高产菌方法逐渐被代谢工程育种方法所取代。同时大量研究表明，通过基因工程技术获得的基因工程菌，除保留了野生型菌株的一些优点外，还能很大程度上提高l-赖氨酸产量。如中国专利文献cn1539015a(申请号02815446.0)公开了包括accbc、accda、cata、cysd、cyse在内的多个可用于赖氨酸产量提高的基因改进位点。中国专利文献cn101600796a(申请号200780048626.8)、cn1974760a(申请号200610163142.5)、cn103243042a(申请号201310092638.8)分别对基因ncg22534、ncgl1835、ncg21090进行失活获得一系列l-赖氨酸产率提高的谷氨酸棒状杆菌工程菌。

技术实现要素：

本发明针对现有技术的不足，提供棒状杆菌基因jny31014在提高l-赖氨酸产量中的应用。本发明通过改造菌株谷氨酸棒状杆菌实现高产l-赖氨酸，具体策略为使棒状杆菌中的jny31014基因失活，使代谢过程中l-赖氨酸合成的前体物质增多，从而提高l-赖氨酸产率，jny31014基因的核苷酸序列如seqidno.1所示。

在本发明中，“失活”可以通过本领域已知的任何失活方法来诱导。“失活”产生的效果是指内源基因的表达被降低到很低的水平，或者产生不表达基因以及尽管被表达但表达不具有活性或活性降低的产物。

在本发明中，“失活”可以通过基因工程手段在内源基因中插入一个或多个碱基对，或者缺失该内源基因中的一个或多个碱基对，或者由基因内部序列转换或颠换获得。

本发明技术方案如下：

棒状杆菌基因jny31014在影响棒状杆菌胞内氨基酸向胞外转运过程中的应用，所述棒状杆菌基因jny31014核苷酸序列如seqidno.1所示。

棒状杆菌基因jny31014在影响棒状杆菌胞内氨基酸产量中的应用，所述棒状杆菌基因jny31014核苷酸序列如seqidno.1所示。

棒状杆菌基因jny31014在提高棒状杆菌l-赖氨酸产量中的应用，所述棒状杆菌基因jny31014核苷酸序列如seqidno.1所示。

根据本发明优选的，所述应用，通过失活棒状杆菌中的基因jny31014实现。

根据本发明优选的，上述应用，所述棒状杆菌为谷氨酸棒状杆菌；进一步优选的，所述棒状杆菌为谷氨酸棒状杆菌(corynebacteriumglutamicum)cicc23604。该菌株购自于中国工业微生物菌种保藏管理中心。

一株高产l-赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌，所述谷氨酸棒状杆菌的棒状杆菌基因jny31014失活，所述棒状杆菌基因jny31014核苷酸序列如seqidno.1所示。

根据本发明优选的，所述谷氨酸棒状杆菌为谷氨酸棒状杆菌(corynebacteriumglutamicum)cicc23604。

上述高产l-赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌的构建方法，步骤如下：

(1)提取谷氨酸棒状杆菌(corynebacteriumglutamicum)23604基因组dna，pcr扩增，制得棒状杆菌基因jny31014的同源臂序列；

所述pcr扩增的引物核苷酸序列如下：

f1:cgcgaattccacttatcagcctcaacactcc

r1:aggccagcaaaagtttcttatgcaacgcccacc；

(2)制备抗性标签cm^r片段，然后将步骤(1)制得的同源臂序列与抗性标签cm^r片段链接，制得融合基因片段；

(3)制备谷氨酸棒状杆菌(corynebacteriumglutamicum)23604感受态细胞；

(4)将步骤(2)制得的融合基因片段转化步骤(3)制得的感受态细胞，经复苏、筛选，即得。

根据本发明优选的，所述步骤(2)中，cm^r片段来源于穿梭质粒pht01。

有益效果

1、本发明首次公开了棒状杆菌基因jny31014为棒状杆菌的细胞膜上的转运蛋白表达的控制基因，负责氨基酸类成分的转运，从而为基因改造谷氨酸棒状杆菌奠定了基础；

2、发明人通过失活棒状杆菌基因jny31014发现可以显著提高l-赖氨酸的产率，通过研究发现，改造后的菌株由于内源基因失活引起其他氨基酸的转运速率明显降低，与野生型相比，该菌株更有利于生产高浓度的l-赖氨酸，能够进一步降低以corynebacteriumglutamicum菌株为生产菌株的生产成本。

附图说明

图1为本发明构建的jny31014基因敲除片段示意图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。

生物材料来源

实施例中所述谷氨酸棒状杆菌(corynebacteriumglutamicum)cicc23604，购自于中国工业微生物菌种保藏管理中心；

穿梭质粒pht01购自杭州宝赛生物科技有限公司；

培养基

lbg培养基，组份如下：

葡萄糖5g/l，蛋白胨10g/l，酵母膏5g/l，nacl10g/l；

发酵培养基，组份如下：

葡萄糖100g/l，蛋白胨20g/l，玉米浆30ml，尿素5g/l，(nh4)2so425g/l，l-亮氨酸0.34g/l，kh2po42g/l，mgso4·7h2o1.5g/l，生物素0.001g/l。

实施例1：基因敲除片段构建

1)(i)提取corynebacteriumglutamicum23604基因组dna为模板，进行pcr扩增，得到jny31014基因中约500bp片段ncg2；

所述的pcr引物序列如下：

f1:cgcgaattccacttatcagcctcaacactcc

r1:aggccagcaaaagtttcttatgcaacgcccacc

所述的pcr扩增体系为：

所述的pcr扩增程序如下：

95℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存；

琼脂糖凝胶电泳检验pcr产物，长度约为550bp，使用sanprep柱式dna胶回收试剂盒(上海生工)进行胶回收，回收产物-20℃保存，备用；

(ii)提取穿梭质粒pht01(购自杭州宝赛生物科技有限公司)的dna，以dna为模板，进行pcr扩增，得到cm^r片段；

所述的pcr引物序列如下:

f2:ttgcataagaaacttttgctggccttttgctca

r2:gcggaattctagtgactggcgatgctgtcggaat

所述的pcr扩增体系为：

所述的pcr扩增程序如下：

95℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min30sec，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存；

琼脂糖凝胶电泳检验pcr产物，长度约为1250bp，使用sanprep柱式dna胶回收试剂盒(上海生工)进行胶回收，回收产物-20℃保存，备用；

(iii)将步骤(i)制得的ncg2片段与步骤(ii)制得的cm^r片段进行重叠pcr，制得ncg2-cm^r片段；

所述的重叠pcr的扩增体系为：

所述的重叠pcr的第一阶段扩增程序如下：

95℃预变性5min；94℃变性30sec，54℃退火30sec，72℃延伸2min，5个循环；72℃延伸10min；

所述的重叠pcr的第二阶段扩增程序如下：

95℃预变性5min；94℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸4min，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存；

琼脂糖凝胶电泳检验pcr产物，长度约为1800bp，使用sanprep柱式dna胶回收试剂盒(上海生工)进行胶回收，回收产物-20℃保存，备用；

实施例2：制备棒状杆菌感受态

(i)挑取新鲜lbg固体培养基表面的谷氨酸棒状杆菌(corynebacteriumglutamicum)23604单菌落，接种于10mllbg培养基中，30℃、200r/min，过夜培养；

(ii)取1ml上述菌液转接到100mlepo液体培养基，37℃、220r/min培养至od600＝0.9；

(iii)将菌液转移至100ml离心管，冰浴15-20min，使菌体停止生长；

(iv)冰浴后4℃、5000g、5min离心，收集菌体；

(v)离心后的菌体用预冷的电转缓冲液(lbhis)洗涤2-3次；

(vi)洗涤结束后，使用1000ul电转缓冲液重悬菌体；

(vii)将制备好的感受态细胞分装100μl每管，-80℃保存，备用。

其中，epo：lb+0.5mtween80+3m甘氨酸

lbhis：lb+1m山梨醇+0.5m脑心浸出液+10％甘油

实施例3：ncg2-cm^r片段电转化谷氨酸棒状杆菌(corynebacteriumglutamicum)23604

(i)将ncg2-cm^r片段用限制性内切酶ecori酶切；

酶切体系(40μl)如下：

(ii)浓缩纯化酶切产物

(1)加入1/10体积3m醋酸钠和2.5倍体积无水乙醇，置于-20℃冰箱20min；

(2)12000r/min，离心5min得沉淀；

(3)300μl75％乙醇重悬沉淀；

(4)12000r/min，离心5min，除去乙醇，37℃风干30min；

(5)加入15-18μlddh2o重悬dna，并置于-20℃保存。

(iii)电转化

首先利用核酸超微量分光光度计测定ncg2-cm^r片段浓度，达到合适浓度后进行电转化，得到的细胞复苏后取100μl涂布在含氯霉素的lb固体培养基上，在32℃培养1-2天，筛选具有卡那霉素抗性的转化子。

实施例4：阳性重组菌的培养及鉴定

挑取上述阳性重组菌落，接种到含卡那霉素抗性的液体lbg培养基中32℃培养过夜，培养完成后，使用上海生物工程有限公司提供的试剂盒提取重组菌dna，并以获得的基因组为模板，f1和r2为引物进行pcr扩增，扩增产物利用琼脂糖凝胶电泳进行验证；

所述的pcr引物序列如下:

f1:cgcgaattccacttatcagcctcaacactcc

r2:gcggaattctagtgactggcgatgctgtcggaat

所述的pcr扩增体系为20μl：

所述的pcr扩增程序如下：

95℃预变性5min；94℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸4min，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存，琼脂糖凝胶电泳检验pcr产物，结果显示，使用引物f1和r2能够扩增出一条特异性基因条带，大小约为1800b，与理论值1792bp接近，表明目的基因已成功整合到谷氨酸棒状杆菌基因组上。

实施例5：l-赖氨酸发酵测试

将制备的谷氨酸棒状杆菌(corynebacteriumglutamicum)23604jny31014基因敲除菌株接种至100mllbg培养基中220rpm30℃下进行种子培养20h，其后按2％接种量接种至100ml发酵培养基发酵培养36h，并通过sba-40d生物传感分析仪测定发酵液中l-赖氨酸的含量。结果显示jny31014基因敲除后发酵液中l-赖氨酸的产量由40g/l提升至49.6g/l。

由以上结果可以看出由于棒状杆菌基因jny31014可以影响l-赖氨酸在菌株胞外的积累量。这表明在棒状杆菌基因jny31014失活以后，改造后的菌株由于内源基因失活引起其他氨基酸的转运速率降低，导致胞内产生其他氨基酸合成受阻，从而促进了l-赖氨酸的合成及向胞外的转运。