一株多粘类芽孢杆菌菌株及其应用的制作方法

本发明涉及微生物
技术领域：
，具体涉及一株多粘类芽孢杆菌菌株及其应用。
背景技术：
：大豆疫霉引起的大豆疫病是大豆生产上的毁灭性病害之一，每年造成全球大豆生产近20亿美元的经济损失。大豆疫病在大豆生长各个时期均可发生，表现为幼苗猝死和成株的根腐病，在潮湿多雨季节病害发生尤为严重，易造成大面积流行从而严重影响产量，限制大豆产业发展，造成重大经济损失。目前已报道的疫霉菌有100多种，其中绝大部分是危害农业和自然生态系统的植物病原菌(kroonetal.,2012,thegenusphytophthoraanno2012.)，对多种农作物和经济作物造成不同程度的危害。由于疫霉菌隶属于茸鞭生物界卵菌门，与真菌遗传距离相距甚远，其大多数生化途径、侵染机制、结构特征都和真菌有着显著的差别，这导致许多传统杀真菌剂不能有效地用于疫霉病的防治，防治疫霉病属于重要难题之一。针对大豆疫病的防治方法多以选用抗病品种和化学防治为主。一方面，大豆抗病品种抗性会随着每年大豆疫霉菌群体结构发生巨大变化而逐渐丧失。另一方面，针对疫霉菌病害广泛使用的苯酰胺类化学杀菌剂如甲霜灵，作用靶标非常单一，极易使大豆疫霉菌产生抗药性。此外，化学农药的大量使用还破环了农业生态平衡，对人类的健康造成威胁。因此，发掘具有生防潜力的菌株、研发可代替化学杀菌剂的生物源杀菌剂对大豆疫病的防治有重大意义。生防菌的种类繁多，在生产上广泛应用的主要是一些真菌和细菌。生防细菌包括芽孢杆菌属、游动放线菌属、假单胞菌属、黄单胞菌属、链霉杆菌属、固氮杆菌属、根瘤杆菌属等多个属。芽孢杆菌类因其产生的芽孢具有良好的耐逆性，具有非常强的应用潜力和商业价值，是目前植物病害生物防治研究的重点方向。公开号为cn107151641a的专利公开了一株侧孢短芽孢杆菌snb10无菌发酵滤液对水稻纹枯病菌的盆栽试验防效为75.09%。公开号为cn103173386a的专利公开了一株多粘类芽孢杆菌g1对温室辣椒疫病防效为71.18%。公开号为cn108559716a的专利公开了一株多粘类芽孢杆菌wt3发酵液灌根对辣椒疫病的田间试验防效达85%。虽然目前已筛选出多粘类芽孢杆菌，表现出对多种病原菌的抑制作用，也有对疫霉菌引起的病害如辣椒疫病的防治作用，但是不同菌株对不同病原菌的抑制作用以及对其引起病害的防治存在巨大差异。由此，这些菌株不一定能适用于大豆疫霉菌引起的大豆疫病的生物防治。目前，适用于大豆疫病防治的多粘类芽孢杆菌生防菌株还十分缺乏。技术实现要素：本发明的目的在于提供一株多粘类芽孢杆菌（paenibacilluspolymyxa）菌株yt9及其在抑制大豆疫霉菌中的应用，并提供一种该菌株制成的发酵液、液体菌剂及其制备方法。本发明提供的多粘类芽孢杆菌菌株yt9，分离自山东省烟台市大豆根际土壤中，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2018年6月19日，保藏编号为cgmccno.15958。本发明另提供一种多粘类芽孢杆菌菌株yt9的应用所述应用主要是在抑制大豆疫霉菌中的应用。该菌株是从健康大豆根际土壤分离出来的一株新型多粘类芽孢杆菌，经过试验验证该菌对大豆疫霉菌具有强抑制作用，同时也对辣椒疫霉菌、烟草疫霉菌等植物病原卵菌和小麦纹枯病菌、小麦根腐病菌、花生黑斑病菌、花生褐斑病菌等植物病原真菌均有拮抗作用，无生态毒性，安全性高，抑菌谱广。本发明另提供一种前述多粘类芽孢杆菌菌株制成的发酵液及液体菌剂以及其制备方法。所述发酵液及液体菌剂的制备方法为：将活化后的多粘类芽孢杆菌菌株yt9在lb培养基中30℃，180rpm，振荡培养18-24小时后获得种子液，然后将种子液按照体积比1:100加入到发酵培养基中进行扩大培养，培养条件为30℃，180rpm，48小时；振荡培养48小时后的培养物即为发酵液，发酵液以10000rpm离心10min，收集菌体，以无菌水进行重新悬浮，获得液体菌剂。其中，所述发酵培养基具体为：酵母浸膏5g、蛋白胨5g、硝酸钠6g、氯化钠4g、蔗糖10-20g、玉米浆3-5ml、加蒸馏水定容至1000ml，121℃灭菌20min制得。具体使用时，可以将发酵液一部分留用，一部分继续离心制得液体菌剂后再使用。按照上述制备方法制备得到的发酵液和液体菌剂活菌总浓度均为1.0×108cfu/ml-5.0×108cfu/ml。本发明的应用主要体现在防治大豆疫病中的应用。具体使用方法为：首先按照上述方法制得的液体菌剂以液体菌剂体积/种子质量为10ml/100g的比例处理浸泡后的大豆种子1小时，并在大豆幼苗期将浓度为含菌1.0×108cfu/ml-5.0×108cfu/ml发酵液稀释1000倍后灌根施用。本发明具有如下优点：本发明的多粘类芽孢杆菌yt9分离自健康大豆根际土壤，可以与土壤生态有效和谐相容，无生态毒性、安全性高、稳定性强。本发明以大豆疫霉菌为靶标，从生防细菌的筛选中寻找具有防治大豆疫病作用的生防细菌，为研发新型生物源杀菌剂提供新资源。最终发明人在试验中分离出一株对大豆疫霉菌有高效稳定抑制作用的菌株，也就是多粘类芽孢杆菌yt9。本发明的多粘类芽孢杆菌yt9培养简单、周期短、稳定性强，在植物病害生物防治中有非常广泛的开发应用前景。本发明提供了yt9菌株发酵培养优化方案，利用lb和牛肉膏蛋白胨培养基等常规细菌培养基进行发酵，yt9菌株生长量约为1.0×104cfu/ml-1.0×105cfu/ml，浓度低且不足以满足施用要求，本发明通过改良培养方案，添加蔗糖、玉米浆等使发酵后菌浓度显著提升。本发明分离出来的菌株，不仅对大豆疫霉菌具有强抑制作用，同时也对辣椒疫霉菌、烟草疫霉菌等植物病原卵菌和小麦纹枯病菌、小麦根腐病菌、花生黑斑病菌、花生褐斑病菌等植物病原真菌均有拮抗作用，抑菌谱广。该菌株对大豆疫霉菌抑菌作用最强，抑菌率高达86.27%±1.62%，该抑菌率显著高于该菌株对同属于疫霉属的辣椒疫霉（抑菌率60.67%±3.06%）以及烟草疫霉（抑菌率74.67%±2.31%）的抑菌率，可见，该菌株对于大豆疫霉菌的抑菌作用具有十分突出的效果。并且发明人还通过试验得出不同的发酵液稀释倍数其防治效果不同，其中，菌浓度为1.0×108cfu/ml-5.0×108cfu/ml的发酵液1000倍稀释液防治效果高达81%，对大豆疫病温室防治效果十分显著。下面将通过具体实施例来对本发明进行进一步的解释，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整地传达给本领域的技术人员。附图说明图1：菌株yt9在lb平板上的菌落形态图；图2：菌株yt9与大豆疫霉菌对峙培养图；图中左侧为yt9与大豆疫霉菌对峙培养3天的情况，右侧为对峙培养30天的情况；图3：菌株yt9无菌滤液对大豆疫霉游动孢子萌发的抑制图；图中，a为对照组，游动孢子在发酵培养基处理条件下的萌发情况，b为处理组，游动孢子在yt9无菌滤液处理条件下的萌发情况；图4：菌种yt9蛋白酶活性图；图5：菌种yt9的纤维素酶活性图。具体实施方式如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。如无特殊说明，本发明所采用的各种材料和试剂均能通过商业方式获得。同样，所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。实施例1多粘类芽孢杆菌菌株yt9的分离与鉴定土壤样品采集：从山东省烟台市不同大豆地块采集5-10cm深处的大豆根围土壤，带回实验室，采用平板稀释涂布法进行分离。菌株的分离培养基：培养基为牛肉膏蛋白胨琼脂（na）培养基:牛肉膏3g、蛋白胨10g、nacl5g、蔗糖15g、琼脂20g，加蒸馏水定容至1000ml，ph7.2-7.4，121℃灭菌20min。采用平板稀释涂布法进行分离：将所采集土壤样品充分混匀，称取10g，装入有适量玻璃珠和90ml无菌水的三角瓶中，将三角瓶置于摇床上，振荡20min，静置5min，10倍梯度稀释法依次进行稀释，取10-4、10-5、10-6土壤稀释液各200µl，均匀涂布于na平板上。每个稀释度3次重复，倒置于30℃恒温培养箱中培养2天后，选取菌落形态不同单菌落进行划线纯化，将纯化后的菌株转接到na斜面培养基上，4℃保存备用。菌株的鉴定：划线纯化后的多粘类芽孢杆菌菌株yt9在na板上划线菌落形态（图1），菌落圆形，乳白色，半透明，菌体杆状，有芽孢。进一步利用16srdna通用引物27f和1492r进行pcr扩增，扩增序列约1500bp构建于pmd18t载体上，送华大基因进行测序，测序得1437bp16srdna部分序列，序列如seqidno.1所示。所得序列与genbank数据库中已知序列进行比对，发现其与多粘类芽孢杆菌16srdna序列的相似性为99%。根据《伯杰细菌鉴定手册》对菌落形态特征和培养特征，确定yt9菌株为多粘类芽孢杆菌（paenibacilluspolymyxa），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2018年6月19日，保藏编号为cgmccno.15958。实施例2多粘类芽孢杆菌yt9对不同病原菌的抑制作用在v8固体培养基平板中央接直径6mm的大豆疫霉、辣椒疫霉、烟草疫霉以及小麦纹枯病菌、小麦根腐病菌、花生黑斑病菌、花生褐斑病菌等不同病原菌菌饼，在菌饼一侧2.5cm处接本发明的多粘类芽孢杆菌菌株yt9，另一侧加空白对照，每个试验菌株5次重复，置于25℃培养箱中黑暗培养。根据病原菌生长速率4-8天后观察测量抑菌带宽度，测定抑菌率，具体结果见表1。抑菌率=（对照侧菌落半径—对峙侧菌落半径）/对照测菌落半径*100%。表1.菌株yt9对不同植物病原菌的抑菌率病原菌抑菌率（%）大豆疫霉p.sojae86.27±1.62a辣椒疫霉p.capsici60.67±3.06e烟草疫霉p.nicotianae74.67±2.31c小麦纹枯病菌r.niasolani80.67±3.06b小麦根腐病菌f.graminearum78.67±4.62bc花生黑斑病菌c.personatum68.67±3.06d花生褐斑病菌c.arachidicola78.00±3.46bc注：数据后的不同字母表示0.05水平差异显著。从表1可以看出，yt9菌株抑菌谱广，对多株病原菌均有抑菌作用，抑制率在60%-87%之间，但对不同菌的抑制效果存在显著差异，其中对大豆疫霉菌的抑制作用最强，继续培养30天后，观察抑菌作用的持久性和稳定性（图2）。试验结果表明本发明的yt9菌株能够强烈抑制大豆疫霉菌的生长，并且抑菌效果持久、稳定。实施例3多粘类芽孢杆菌菌株yt9无菌发酵滤液对大豆疫霉菌游动孢子活性的影响将菌株yt9活化后，接种至装有50ml发酵培养基的250ml三角瓶内，在30℃转速180rpm的摇床上振荡培养2天的发酵原液，12000rpm离心5min后，用0.22μm的细菌过滤器进行过滤，得无菌发酵滤液。新鲜活化的大豆疫霉菌株在10%v8液体中培养两天后换水诱导游动孢子大量产生(104个/ml)。一组取450μl游动孢子+450μl无菌滤液+100μlv8（处理组）；另一组取450μl游动孢子+450μl发酵培养基+100μlv8（对照组），25℃放置3小时后进行显微观察，并各取200μl混合液分别涂布于v8平板上，25℃培养3天后观察。实验结果表明：25℃放置3小时后显微镜下对照组中游动孢子正常萌发，处理组中游动孢子大量破裂，萌发数量显著降低。v8平板上培养3天后显示，处理组菌落数显著低于对照组（图3）。表明yt9发酵滤液对大豆疫霉菌游动孢子的正常萌发造成影响。实施例4：多粘类芽孢杆菌菌株yt9菌剂的制备将本发明多粘类芽孢杆菌菌株yt9在lb平板上活化后的单菌落接种于装有lb培养基的三角瓶中，30℃，180rpm条件下振荡培养18-24小时，得到种子液。然后测定yt9种子液浓度od值为0.5时进行扩大培养。将其以1:100体积比加入发酵培养基中扩大培养，30℃，180rpm条件下振荡培养。其中发酵培养基具体配方为：酵母浸膏5g、蛋白胨5g、硝酸钠6g、氯化钠4g、蔗糖10-20g、玉米浆3-5ml，加蒸馏水定容至1000ml。振荡培养48小时，获得发酵液，以10000rpm离心10min，收集菌体，以无菌水进行重新悬浮，获得菌剂。实施例5：多粘类芽孢杆菌菌株yt9对大豆疫病的防治效果试验将按照实施例4方法制备得到的浓度为1.0×108cfu/ml-5.0×108cfu/ml的液体菌剂，以10ml/100g(菌剂体积/种子质量)的比例处理浸泡吸水12小时后的大豆种子1小时，以清水处理为对照。将处理过的大豆每盆10颗种于15cm花盆中，出苗后将浓度为1.0×108cfu/ml-5.0×108cfu/ml的yt9发酵液分别稀释10、100、1000倍采用10ml/棵苗加至大豆苗根部，3天后灌根接种法接种大豆疫霉游动孢子悬浮液（104个/ml）10ml，每个处理4次重复。待长出两片真叶后调查病情指数，并计算防治效果，结果见表2。大豆疫病病情分级：0级：不发病；1级：接种部位产生病斑，病斑长度不超过茎部长度1/4；2级：病斑长度为茎部长度1/4-1/2；3级：病斑长度超过茎部长度1/2；4级：全株发病，萎蔫或枯死。病情指数（%）=∑（各级病株数×该病级值）/（调查总株数×最高级值）×100%防治效果（%）=（对照病情指数—处理病情指数）/对照病情指数×100表2yt9发酵液对大豆疫病的防治效果处理病情指数（%）防治效果（%）yt9发酵液10倍稀释37.50±2.0455.22yt9发酵液100倍稀释27.50±4.5667.16yt9发酵液1000倍稀释15.63±3.1581.34清水83.75±3.22——从表2的实验结果表明，yt9发酵液处理能够显著降低大豆疫霉菌的病情指数。本实验还确定了苗期大豆施用浓度为1.0×108cfu/ml-5.0×108cfu/ml的yt9发酵液的1000倍稀释液防治效果高达81%。该实验结果说明，多粘类芽孢杆菌菌株yt9对大豆疫病的防治展现出良好的应用潜力。实施例6：本发明多粘类芽孢杆菌yt9的胞外酶活性测定（1）蛋白酶活性测定：在蛋白酶测定平板上（a:脱脂奶粉8g，溶于300ml水中，115℃灭菌10分钟；b:琼脂8g，定容至300ml，121℃灭菌20分钟，a与b分别灭菌后在超净台内无菌混合后倒板）接菌，30℃培养3d后观察。（2）纤维素酶活性测定：把准备好的菌株接到纤维素酶活性测定平板上（蛋白胨10g，酵母粉10g，羟基纤维素钠10g，氯化钠5g，磷酸二氢钾1g，琼脂18g，ph=7.0），30℃培养3d后，用1g/l的刚果红染1h后，倒掉染液，再用1m的nacl溶液浸泡1小时，观察透明圈有无。结果表明多粘类芽孢杆菌菌株yt9在蛋白酶测定平板上接菌点周围产生明显的透明圈，说明该菌株可产生蛋白酶（图4）；该菌株在纤维素酶平板上接菌点周围产生明显的透明圈，说明该菌株可产生纤维素酶（图5）。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。序列表<110>鲁东大学<120>一种多粘类芽孢杆菌菌株及其应用<160>1<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1511<212>dna<213>paenibacilluspolymyxa<400>1gagtttgatcctggctcaggacgaacgctggcggcgtgcctaatacatgcaagtcgagcg60gggttatttagaagcttgcttctacataacctagcggcggacgggtgagtaacacgtagg120caacctgcccacaagacagggataactaccggaaacggtagctaatacccgatacatcct180tttcctgcatgggagaaggaggaagacggagcgatctgtcacttgtggatgggcctgcgg240cgcattagctagttggtggggtaatggcctaccaaggcgacgatgcgtagccgacctgag300agggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagta360gggaatcttccgcaatgggcgaaagcctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggtt420ttcggatcgtaaagctctgttgccagggaagaacgtcttgtagagtaactgctacaagag480tgacggtacctgagaagaaagccccggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgta540gggggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagcgcgcgcaggcggctctttaagtc600tggtgtttaatcccgaggctcaacttcgggtcgcactggaaactggggagcttgagtgca660gaagaggagagtggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacacc720agtggcgaaggcgactctctgggctgtaactgacgctgaggcgcgaaagcgtggggagca780aacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgaatgctaggtgttaggggt840ttcgatacccttggtgcgcgaagttaacacattaagcattccgcctggggagtacggtcg900caagactgaaactcaaaggaattgacggggacccgcacaagcagtggagtatgtggttta960attcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatccctctgaccggtctagagat1020aggcctttcctacgggacagaggagacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgt1080gagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatgcttagttgccagcaggtca1140agctgggcactctaagcagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaa1200atcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtactacaatggccggtacaacgggaa1260gcgaagccgcgaggtggagccaatcctagaaaagccggtctcagttcggattgtaggctg1320caactcgcctacatgaagtcggaattgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaat1380acgttcccgggtcttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttacaacacccgaagt1440cggtgaggtaaccgcaaggagccagccgccgaaggtggggtagatgattggggtgaagtc1500gtaacaaggta1511当前第1页12