本发明涉及保健食品及医药技术领域，具体涉及广东虫草多糖ccg-cps及其制备方法与应用。
背景技术
广东虫草(cordycepsguangdongensist.h.li,q.y.lin&b.song)是本发明人所在的研究团队近年发现的一种新的虫草食品资源(linetal.,2008)。研究显示，广东虫草是一种极具华南特色的虫草种类，其子实体具有治疗慢性肾衰竭(yanetal.,2012)、改善由烟熏导致的慢性支气管炎(yanetal.,2014)、抗疲劳和延长寿命(yanetal.,2011；闫文娟等，2013)、提高免疫力等功效(闫文娟等，2014)，它在水解氨基酸和粗多糖与冬虫夏草相近，而其不饱和脂肪酸亚油酸、粗蛋白、腺苷、维生素b1均高于冬虫夏草(凌建亚等，2006；林群英等，2009)。广东虫草子实体已被中华人民共和国卫生部批准为“新食品原料”(卫生部2013年1号公告)，是继蛹虫草之后的第二种虫草新食品资源。目前广东虫草已经实现人工栽培，不仅可以成为人们餐桌上的美食，还兼具着药用价值，具有很大的开发应用前景，可以作为冬虫夏草的替代品(林群英等，2009；linetal.,2010)。
免疫系统是生物体抵抗外来病原物的有效武器，是生物体可以正常生命活动的重要保证。许多物质已被证明可以提高机体的免疫力，比如：螺旋藻、蜂胶、黄芪、香菇和灵芝等(包巍，2008；洪妍等，2017；张京华，2017；huetal.,2017)。因此，摄取可以提高免疫力的食物也是保证机体自身免疫水平的一个良好途径。
多糖是一类大分子物质，不同种类的多糖由于其结构不同使得它们的活性各异。在食用菌多糖中，具有抗肿瘤、免疫调节和抗病毒等多种生物活性的β-型的香菇多糖一直以来都备受学者们的关注和认可，并且目前已实现临床应用(万茜淋等，2018)。冬虫夏草和蛹虫草是探索虫草多糖活性功效中最常用到的研究材料，已有研究已表明冬虫夏草多糖和蛹虫草多糖具有护肾、抗肿瘤和免疫调节活性等功效(陈涛，2009；刘江铠，2009)。冬虫夏草目前仍难以实现大规模的人工栽培，其资源紧缺，而广东虫草不仅已实现大规模人工栽培，并且其安全无毒的特性让其在作为提高免疫功能的食品或药品的开发上有很大的应用前景。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种广东虫草多糖ccg-cps及其制备方法与在制备增强体液免疫功能的保健食品或药物中的应用。
本发明采取的技术方案为如下：
一种广东虫草多糖ccg-cps的制备方法，包括以下步骤：
将干燥的广东虫草子实体粉末加入到石油醚中脱脂直至石油醚溶液呈无色，收集残渣，待残渣中剩余的石油醚挥发，晾干；然后将残渣用水浸提，得到水提取液，水提取液用乙醇进行醇沉，收集沉淀得到粗多糖cps；往粗多糖cps中加入胰蛋白酶酶解，然后再用sevag试剂脱蛋白，残渣去残余sevag试剂后，即得广东虫草多糖ccg-cps。
优选，步骤如下：
1)将干燥至恒重的广东虫草子实体粉碎，得到子实体粉末；
2)按料液比为1:5往步骤1)的子实体粉末加入石油醚，常温脱脂至溶液呈无色，待残渣中剩余的石油醚挥发，晾干；
3)将步骤2)得到的残渣称重，按料液比为1:20～30加入蒸馏水，于85～90℃中浸提，得到水提液；
4)将步骤3)得到的水提液减压浓缩至0.25～1l，然后加入乙醇进行醇沉，离心取沉淀，得到粗多糖cps；
5)将步骤4)得到的粗多糖cps溶于水，按粗多糖水溶液体积加入1％m/v的胰蛋白酶处理30min，然后加入sevag试剂进行多次脱蛋白处理，经减压浓缩去除残余的sevag试剂，即得广东虫草多糖ccg-cps。
上述步骤3)于85～90℃中浸提具体为：于85～90℃的恒温浴中浸提2次，第二次浸提是在第一次浸提后5000rpm离心20min收集上清液后所剩下的残渣的基础上，每次浸提2h，中间每隔30min搅拌一次，第二次浸提后合并上清液。
步骤4)加入乙醇进行醇沉具体为：加入水提液3倍体积的95％乙醇，于4℃下醇沉16～18h。
步骤5)的sevag试剂为正丁醇和氯仿以1:5的体积比组成。
步骤5)脱蛋白处理的条件为：加入粗多糖水溶液1/5倍体积的sevag试剂，于200rpm的摇床下震荡30～40min。
本发明通过上述制备方法获得广东虫草子实体多糖的ccg-cps成分，利用溶血空斑试验考察了不同剂量的ccg-cps成分对抗体产生的b细胞的生成量影响，结果显示，低、中、高剂量的ccg-cps试验组的溶血空斑数均高于阴性对照组(纯净水处理)，呈剂量依赖性，且高剂量ccg-cps试验组的溶血空斑数与阴性对照组的呈显著差异性(p<0.05)，并与阳性对照组(转移因子口服液处理)的溶血空斑数相当，说明高剂量的ccg-cps可增加正常小鼠的抗体产生细胞b细胞的生成量。
同时，本发明还考察了不同剂量的ccg-cps成分对血清溶血素的生成量的影响，结果显示，低、中、高剂量的ccg-cps试验组的总抗体体积数均高于阴性对照组(纯净水处理)，呈与剂量正相关性，虽然高剂量ccg-cps试验组的抗体体积数略低于阳性对照组(转移因子口服液处理)，但是高剂量ccg-cps试验组与阴性对照组比较，具有统计学上的显著差异性(p<0.05)，说明高剂量的ccg-cps可促进正常小鼠体内血清溶血素的产量。
以上结果表明，ccg-cps成分可以增加正常小鼠的抗体产生细胞b细胞的生成量，并可提高正常小鼠的抗体体积数及抗体的水平，对正常小鼠的体液免疫功能具有增强效果。这意味着广东虫草多糖ccg-cps在增强免疫力中将呈现明显的积极作用，可用于制备增强体液免疫功能的保健食品或药物。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1广东虫草多糖ccg-cps的制备
1)将在50℃下烘干至恒重的广东虫草子实体粉末用万能高速搅拌机粉碎，并过60目筛，得到子实体粉末；
2)按料液比为1:5，往步骤1)的子实体粉末加入石油醚，常温脱脂至溶液呈无色，待残渣中剩余的石油醚挥发，晾干；
3)将步骤2)中所得到的残渣称重，按料液比为1:20加入蒸馏水，于90℃的恒温浴中浸提2次，第二次的浸提是在第一次浸提后5000rpm离心20min收集上清液后所剩下的残渣的基础上，每次浸提2h，中间每隔30min搅拌一次，第二次浸提后合并上清液，得到水提液；
4)将步骤3)得到的水提液在52℃，100kpa减压浓缩至1l，然后加入水提液3倍体积的95％乙醇，于4℃下醇沉16h，5000rpm离心15min，取沉淀，得到粗多糖cps；
5)将步骤4)得到的粗多糖cps溶于水，按粗多糖水溶液体积加入1％m/v的胰蛋白酶处理30min，然后加入粗多糖水溶液1/5倍体积的sevag试剂(正丁醇：氯仿＝1:5v/v)于200rpm的摇床下震荡35min进行除蛋白处理，静置，取上清液，再加入上清液1/5倍体积的sevag试剂重复除蛋白处理，sevag试剂除蛋白共三次，最后经减压浓缩去除残余的sevag试剂，即得广东虫草多糖ccg-cps。
实施例2广东虫草多糖ccg-cps对正常小鼠抗体生成细胞的影响
1.仪器与材料
试验动物为100只spf级雄性balb/c小鼠，分两次购买，体重分别为17.4～20.2g、17.9～20.2g和5只spf雄性hartley豚鼠，体重为383.2～402.1g，试验动物均由广东省医学实验动物中心提供。动物饲养在广东省医学实验动物中心spf级动物房，试验动物使用许可证号分别为：44007200048688、44007200049681、44007200048777。动物饲养条件：5只/箱，群养；饲养温度与湿度：20℃～26℃，40％～70％，采用12h/12h昼夜间断照明。
供试的样品为广东虫草多糖ccg-cps成分。
试剂和药品：bht、vc、氨苄青霉素、潮霉素-b(广州恒硕生物科技公司)；无菌脱纤维绵羊血(广州鸿泉生物科技有限公司)；氯化钠、氯化钾、葡萄糖、磷酸氢二钠和硫酸镁(广东光华科技股份有限公司)；磷酸二氢钾、硫酸镁和氯化镁(天津市福晨化学试剂厂)、无水氯化钙(广州化学试剂二厂)；巴比妥酸(上海科丰化学试剂有限公司)；巴比妥钠(阿拉丁)；氯化钠注射液(贵州天地药液有限责任公司)；hank’s液(genview公司)；rpmi1640培养基(gibco公司)、红细胞裂解液(sigma-aldrich公司)。
仪器：thermomultiskango酶标仪、jea3001型电子天平(上海浦春计量仪器有限公司，感量：0.1g)；yp3001n型电子天平(上海精密科学仪器有限公司，感量：0.01g)；kdc-2046型冷冻离心机(科大创新股份有限公司中佳分公司)、ccl-170b-8型co2培养箱(新加坡esco)、ckx41倒置显微镜(日本奥林巴斯公司生产)。
2.方法
剂量设计依据：根据广东虫草前期的口径毒理试验剂量和《保健食品检验与评价技术规范(2003年版)》。
剂量设计与分组：供试品日常用量为3.0g/人日(体重按60kg计算)，以该剂量的10、20、40倍作为小鼠的低、中、高剂量，即分别为0.5、1.0、2.0g/kg体重。阳性对照品选用转移因子口服液(南京瑞尔医药有限公司)，剂量为20mg/kg。动物检疫合格后，按体重随机分为阴性对照组、阳性对照组、ccg-cps低、中、高剂量组，10只/组。
供试品的配制：称取1.4gccg-cps粉末，用适量的纯净水搅拌溶解至14ml，得0.1g/ml高剂量溶液。量取6ml高剂量溶液，用纯净水稀释至12ml并混匀，得0.05g/ml中剂量溶液。量取4ml中剂量溶液，用纯净水稀释至8ml，得0.025g/ml低剂量溶液。对照品无需配制，直接使用。
给药：动物检疫合格、分组后开始给予受试物。阳性对照组动物灌胃给予转移因子口服液，ccg-cps低、中、高剂量组动物分别灌胃相应浓度的ccg-cps溶液，阴性对照组动物灌胃纯净水，灌胃体积为20ml/kg体重，1次/d，连续30d。
一般临床观察：试验期间，每天观察动物的存活、体形、被毛、皮肤、粪便、肌肉张力、步态、精神、呼吸等状况1次。
体重称量：动物每周称重1次，结束试验前称重1次。
补体的制备：试验结束前5只豚鼠腹主动脉取血，室温放置约40min，3000rpm离心15min，取上层血清。将1ml压积srbc(绵羊红细胞)加入到5ml的豚鼠血清中，4℃冰箱放置30min，经常震荡，离心取上清，分装，-70℃保存。用时以sa缓冲液按1:8稀释。
玻片涂膜：在清洁玻片上刷上一薄层的0.5％琼脂糖，自然晾干后可长期保存备用。
免疫动物：给药第26d，取脱纤维绵羊血，用氯化钠注射液洗涤3次，每次离心(2000r/min)10min，压积srbc(绵羊红细胞)用氯化钠注射液配成2％(v/v)的细胞悬液，各组小鼠腹腔注射0.2ml/只。
脾细胞悬液制备：末次给药24h后，各组动物无菌取脾，置于盛有适量无菌hank’s液平皿中，轻轻将脾磨碎，经200目筛网过滤，1000rpm，离心10min，弃上清，按1:1(v:v)加入红细胞裂解液，裂解红细胞后，1000rpm，离心10min，弃上清，将细胞悬浮于3ml的完全培养液中，台盼蓝染色计数活细胞数，调整细胞浓度为5×106个/ml。
抗体生成细胞的检测：将表层培养基(1g琼脂糖加双蒸水至100ml)加热溶解后，放45～50℃水浴保温，与等量ph7.2～7.4，2倍浓度的hank’s液混合，分装小试管，每管0.5ml，再向管内加50μl10％srbc(v/v，用sa缓冲液配制)，25μl脾细胞悬液，迅速混匀，倾倒于已刷琼脂糖薄层的玻片上，待琼脂凝固后，将玻片水平扣放在片架上，放入二氧化碳培养箱中孵育1.5h，然后用sa缓冲液稀释的补体(1:8)加入到玻片架凹槽内，继续温育1.5h后，计数溶血空斑数。溶血空斑数＝空斑数/全脾细胞。结果见表1。
表1ccg-cps成分对正常小鼠体重及抗体生成细胞b细胞数量的影响
注：体重数据采用重复测量资料方差分析；溶血空斑数采用方差分析，组建比较采用lsd法。与阴性对照组比较，*p＜0.05；表中溶血空斑数代表抗体生成细胞b细胞的个数。
结果显示，在每一个称重的时间点，阴性对照组、阳性对照组、广东虫草多糖ccg-cps成分的低、中和高剂量组的动物平均体重均无明显差别(p>0.05)，由此可知，阳性药物和广东虫草多糖样品在试验的各个阶段对动物本身体重的增长无影响。在试验结束时测得广东虫草多糖ccg-cps成分的低、中和高剂量组的溶血空斑数均高于阴性对照组，并且呈剂量依赖性，其中，高剂量ccg-cps组的溶血空斑数与阴性对照组比较，具有显著差异性(p<0.05)，并与阳性对照组的溶血空斑数相当，表明高剂量的ccg-cps可增加正常小鼠的抗体产生细胞b细胞的生成量。
实施例3广东虫草多糖ccg-cps对正常小鼠血清溶血素的影响
1、动物的选择、剂量与分组参照上述实施例2。
2、试验方法：
供试品的配制、给药、一般临床观察和体重称量参照上述实施例2。
免疫动物：给药第26d，动物腹腔注射2％(v/v)压积srbc悬液，0.2ml/只。
取材：给药第31d(即末次灌胃次日、免疫后第5d)，动物摘眼球取血于离心管，放置约1h，将凝固血与管壁剥离，使血清充分析出，2000rpm离心10min，收集血清。
凝集反应测定：用氯化钠注射液将血清倍比稀释，将不同稀释度的血清分别置于微量血凝试验板内，100μl/孔，再加入100μl0.5％(v/v)的srbc悬液，混匀，装入湿润的平盘内加盖，与37℃孵育3h，观察血球凝集程度，并按下列公式计算抗体水平。血清稀释时要充分混匀，最后一个稀释度应不出现凝集现象。
抗体水平＝(s1+2s2+3s3……nsn)
式中1、2、3……n代表对倍稀释的指数；s代表凝集程度的级别：0级：红细胞全部下沉，集中在孔底部形成致密的圆点状，四周液体清晰；ⅰ级：红细胞大部分沉集在孔底成圆点状，四周有少量凝集的红细胞；ⅱ级：凝集的红细胞在孔底形成薄层，中心可明显见到一个疏远的红点；ⅲ级：凝集的红细胞均匀铺散在孔底成薄层，中心隐约可见一个小红点；ⅳ级：凝集的红细胞均匀地铺散在孔底成一薄层，凝块有时成卷折状。
3、统计
数据采用(x±s)表示，应用spss21.0软件进行统计分析。校验水平α＝0.05。
4、结果
试验结果见表2。
表2ccg-cps成分对正常小鼠体重及血清溶血素的影响
注：体重数据采用重复测量资料方差分析；抗体体积数采用方差分析，组建比较采用lsd法；与阴性对照组比较，*p＜0.05,**p＜0.01。
结果显示，在每一个称重的时间点，阴性对照组、阳性对照组、广东虫草多糖ccg-cps成分的低、中和高剂量组的动物平均体重均无明显差别(p>0.05)，由此可知，阳性药物和广东虫草多糖样品在试验的各个阶段对动物本身体重的增长无影响。第30d试验结束时测得广东虫草多糖ccg-cps成分的低、中和高剂量组的总抗体体积数均高于阴性对照组，呈与剂量正相关性，虽然高剂量ccg-cps组的抗体体积数略低于阳性对照组，但高剂量ccg-cps组与阴性对照组比较，具有统计学上的显著差异性(p<0.05)，说明高剂量组的广东虫草多糖ccg-cps成分可提高小鼠体内血清溶血素的生成量。
体液免疫是由b细胞分泌的免疫分子抗体介导的免疫反应，本研究通过检测广东虫草多糖ccg-cps成分对抗体生成细胞的影响和对血清溶血素的影响，结果显示，广东虫草多糖ccg-cps成分可以促进b细胞产生抗体，并且其高剂量组作用程度与阳性对照相当，ccg-cps成分还可以提高正常小鼠血清溶血素的数量，且高剂量组与阴性对照组相比有显著差异性，证明高剂量(0.1g/l)ccg-cps组具有显著提高机体体液免疫的功能。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。