采用离子凝胶法制备淀粉纳米颗粒的方法与流程

本发明属于淀粉纳米颗粒制备技术领域，特别涉及一种采用离子凝胶法制备淀粉纳米颗粒的方法。

背景技术

淀粉，作为碳水化合物主要来源，具有可降解性，无毒性和生物相容性，淀粉纳米颗粒在食品，化妆品和医药领域有较好的应用前景。淀粉纳米颗粒传统的制备方法包括纳米沉淀法，自组装，乳化法和酸水解法，然而，这些方法制得的纳米颗粒有的容易聚集并进一步沉淀，有的还需要用到大量的化学试剂。制备一种分散性好且绿色简单的淀粉纳米颗粒对纳米颗粒的各领域应用有非常重要的意义。

离子凝胶法是制备多糖纳米颗粒的一种很简单绿色的方法，通过静电相互作用物理交联避免了化学试剂的潜在毒性，离子凝胶法已广泛应用于制备壳聚糖，海藻酸钠和果胶等多糖纳米颗粒。壳聚糖带有大量正电荷、海藻酸钠和果胶均带有大量负电荷，但是，淀粉带负电荷很少，能否用这种方法能否来制备淀粉纳米颗粒是亟待研究的一个问题。

技术实现要素：

针对上述问题，本发明提供一种采用离子凝胶法制备淀粉纳米颗粒的方法，通过tempo体系氧化脱支淀粉，脱支淀粉的6位碳羟基氧化为羧基，负电荷增加，与钙离子通过离子凝胶法制备纳米颗粒。

采用离子凝胶法制备淀粉纳米颗粒的方法，包括以下步骤：

(1)将脱支淀粉与水配制成淀粉浆，糊化，冷却至温度为0～5℃；优选淀粉浆的浓度为3～5％，更优选为4％，此浓度范围的淀粉浆有利于充分反应。

(2)按照每脱水葡萄糖单位的脱支淀粉需要0.01～0.03mol的tempo(2,2,6,6-四甲基哌啶-氮-氧化物)计算，称取tempo溶解于蒸馏水中制备成浓度为0.1-0.2wt％的水溶液，加到糊化的淀粉浆中，按照每脱水葡萄糖单位的脱支淀粉需要0.2～0.5mol溴化钠计算，称取溴化钠也加到糊化的淀粉浆中，调节ph值9～11；逐滴加入次氯酸钠，所述次氯酸钠的用量按有效氯计，占所述脱支淀粉干基质量的5～9％，调节ph值为9～11，从加次氯酸钠时起计时氧化反应2～4h；

本发明对淀粉浆与tempo体系的反应装置没有特殊限定，能够维持反应温度的装置均可应用于本发明中。为了保证氧化反应的充分进行，提高氧化效果，本发明优选在反应的过程中进行搅拌。本发明中优选淀粉浆与tempo体系的氧化反应在恒温加热磁力搅拌器中进行。使反应温度控制在0～5℃，更优选为0～2℃。

本发明中，在淀粉浆中加入次氯酸钠，次氯酸钠的添加量按有效氯计，占所述脱支淀粉干基质量的5～9％，更优选为7～9％。

本发明中，淀粉浆与tempo体系的氧化反应在ph值为9～11条件下进行，优选ph值为10；优选使用氢氧化钠作为ph值调节剂。在调整ph值后的淀粉浆中逐滴加入次氯酸钠。在加入次氯酸钠的过程中，溶液的ph上升，此时优选加入适量的酸保持溶液ph值在9～11，优选使用盐酸。次氯酸钠加完后，淀粉纳米颗粒的羟基氧化为羧基，溶液的ph值下降，在溶液中加入碱调整其ph值在9～11，碱优选为氢氧化钠。

本发明中，氢氧化钠优选采用溶液的形式进行添加，优选氢氧化钠溶液的摩尔浓度为0.2～0.4mol/l，更优选为0.3mol/l。盐酸优选用盐酸水溶液的形式进行添加，优选盐酸溶液的摩尔浓度为0.2～0.4mol/l，更优选为0.3mol/l。

本发明对淀粉浆与tempo体系的反应装置没有特殊限定，能够维持反应温度的装置均可应用于本发明中。为了保证氧化反应的充分进行，提高氧化效果，本发明优选在反应的过程中进行搅拌。本发明中优选淀粉浆与tempo体系的氧化反应在恒温加热磁力搅拌器中进行。使反应温度控制在0～5℃，更优选为0～2℃。

(3)加入乙醇终止反应，调整溶液的ph值至6.0～7.0，离心，无水乙醇洗涤，冷冻干燥后得到tempo体系氧化的脱支淀粉；反应完成后，脱支淀粉中的6位碳羟基氧化为羧基，增加了脱支淀粉的表面负电荷。本发明对离心机的转速没有特殊限定，优选采用7000～10000rpm的转速，更优选为8000～9000rpm。离心的时间优选为5～10min，更优选为6～9min。

(4)将得到的氧化的脱支淀粉配成0.5～2％的悬浊液，糊化，逐滴加到0.05～0.2mol/l的氯化钙溶液中，温度为25～35℃，转速为200～500rpm，反应2～4h，加入无水乙醇，离心，得到的沉淀经无水乙醇洗涤和冷冻干燥，得到淀粉纳米颗粒。优选离心速度为10000～15000rpm,离心时间10～30min。

将离心后得到的沉淀进行醇洗，水洗去掉未反应的试剂等。本发明对醇洗的次数没有特殊限定，优选为3～5次。

将醇后的沉淀进行冷冻干燥。本发明对冷冻干燥的方式没有特殊限定，优选采用真空冷冻干燥。本发明中，优选真空冷冻干燥的真空度优选为5～10pa，更优选为6～9pa；温度优选为-80～-60℃，更优选为-75～-65℃；时间优选为48～72小时。

本发明对脱支淀粉的来源没有特殊限定，采用本领域中的常规脱支淀粉即可。在本发明具体实施例中，优选采用酶解方法制备得到的脱支淀粉。

本发明对淀粉酶解制备脱支淀粉的方法没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的酶解方法即可。

本发明中，所述脱支淀粉的酶解制备方法优选包括以下步骤：

首先制备一定浓度的淀粉乳，优选淀粉乳的质量体积浓度为5～15％，更优选为8～12％，此浓度下酶解较充分。

将淀粉与磷酸盐缓冲液制备淀粉乳，所述磷酸盐缓冲液的ph值优选为4.0～5.5，更优选为4.5～5.0(普鲁兰酶适用ph值4.0-6.5，最适ph值为4.2-4.6，酶解效果较好)。本发明中，优选用磷酸氢二钠与柠檬酸复配制备上述ph范围的缓冲溶液。

将得到的淀粉乳进行糊化。本发明对糊化的方式没有特殊限定，优选采用沸水浴糊化。糊化的时间优选为30～60min，更优选为40～50min，以保证淀粉乳的充分糊化。

将糊化后的淀粉乳用普鲁兰酶进行酶解脱支。本发明中，以淀粉干基计，所述普鲁兰酶的用量优选为10～30aspu/g，更优选为18～26aspu/g。酶解温度优选为50～65℃，更优选为53～62℃。酶解时间优选为6～12h，更优选为8～10h。酶解后得到酶解液中含有脱去支链的直链淀粉。

将得到的酶解液离心，得到的上清液经3～4倍无水乙醇沉淀，洗涤，冻干后得脱支淀粉。

本发明对淀粉的种类没有特殊限定，优选采用蜡质玉米淀粉为原料制备脱支淀粉。将蜡质玉米淀粉脱脂后制备淀粉乳。本发明对脱脂方法没有特殊限定，优选采用甲醇脱脂。

本发明中，优选在离心前，先将得到的酶解液进行灭酶。本发明对灭酶的方式没有特殊限定，能够将酶解液中的普鲁兰酶失活的方式均可。优选采用沸水浴灭酶。优选的，将酶解液进行离心，对得到的上清液进行灭酶。本发明中，对酶解液离心的转速没有特殊限定，优选采用3500～10000rpm的转速，更优选为5000～8000rpm。离心的时间优选为1～3min，更优选为2min。将上清液进行沸水浴灭酶，优选灭酶的时间为10～20min。

将灭酶后的酶解液离心，弃去絮状失活酶。将得到的上清液经3～4倍无水乙醇沉淀，洗涤。优选乙醇体积为3.5～4倍，洗涤沉淀所用乙醇体积为200～500ml，优选为300～400ml，洗涤次数为2～6次，优选为3～5次。

将无水乙醇洗后的沉淀产物进行冻干。本发明对冻干的方式没有特殊限定，采用本领域中的常规冻干方式即可。在本发明具体实施例中，优选采用真空冷冻干燥。真空冷冻干燥的真空度优选为5～10pa，更优选为6～9pa；温度优选为-80～-60℃，更优选为-75～-65℃；时间优选为48～72小时。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明公开的淀粉纳米颗粒的制备方法，利用tempo体系氧化脱支淀粉，将脱支淀粉中的6位碳羟基定向氧化为羧基，使脱支淀粉的负电荷增加，得到的氧化脱支淀粉通过静电作用与钙离子形成纳米颗粒。本发明的淀粉纳米颗粒的制备过程绿色环保，制备方法简单、高效。本发明的淀粉纳米颗粒有望作为纳米载体包埋输送营养物质、活性物质和药物。

附图说明

图1为实施例1-4不同有效氯含量(0，5，7，9％)时脱支淀粉的电位图，a,b,c,d分别代表脱支淀粉与5,7,9％有效氯氧化的脱支淀粉；

图2为实施例4中氧化脱支淀粉(9％有效氯)与0.2，0.1，0.05mol/l的钙离子形成的纳米颗粒的透射电镜和扫描电镜图(a，b，c分别为0.2，0.1，0.05mol/l的钙离子的纳米颗粒的透射电镜图，d，e，f分别为0.2，0.1，0.05mol/l的钙离子的纳米颗粒的扫描电镜图)；

图3为实施例4中氧化脱支淀粉(9％有效氯)与0.2，0.1，0.05mol/l的钙离子形成的纳米颗粒的粒径分布图，a,b,c分别表示9％有效氯氧化的脱支淀粉与0.2，0.1，0.05mol/l的钙离子形成的纳米颗粒；

图4为实施例4中氧化脱支淀粉(9％有效氯)与0.2，0.1，0.05mol/l的钙离子形成的纳米颗粒的电位图。

具体实施方式

下面结合具体实施例及附图对本发明做进一步详细说明。

实施例1

(1)脱支淀粉的制备：蜡质玉米淀粉经甲醇脱脂后，酶解制得脱支淀粉。用浓度为28.4g/l的无水磷酸氢二钠与浓度为19.2g/l柠檬酸配成ph为4的磷酸盐缓冲液。称取10g脱脂蜡质玉米淀粉，加缓冲液调成5％淀粉乳(m/v)，沸水浴30min使其糊化完全，边沸边搅拌，粘稠过后可间断搅拌，糊化完成后冷却至50℃，加入普鲁兰酶(10aspu/g)进行脱支，水浴6h。脱支后3500rpm离心2min，弃去下层沉淀得到上清液，20min沸水浴灭酶，再次离心弃去絮状失活酶。加3倍无水乙醇沉出脱支淀粉，沉淀再加200ml无水乙醇洗涤2次，得到的沉淀在8pa、-80℃下冻干50小时，得到脱支淀粉。

(2)5％有效氯氧化氧化脱支淀粉的制备：称取5g脱支淀粉于200ml烧杯中，加去离子水到总重100g，配成3％的淀粉浆，糊化5min，冷却，置于恒温加热磁力搅拌器中，温度设为0℃，tempo(0.01mol/每脱水葡萄糖单位的脱支淀粉)溶解于蒸馏水中，再加到淀粉浆中，溴化钠(0.2mol/每脱水葡萄糖单位的脱支淀粉)也加到淀粉浆中，首先用0.2mol/l的naoh调淀粉浆ph至9，次氯酸钠2.5g(0.25g有效氯/5g淀粉，有效氯为5％；次氯酸钠含有效氯为10％)，缓慢加到淀粉浆中，加0.2mol/lhcl保持ph为9，次氯酸钠加完之后，随氧化反应的进行，羟基氧化为羰基和羧基，ph下降，再加naoh调ph至9。从加次氯酸钠时起计时，氧化2h，然后加入6ml无水乙醇，用hcl调ph6.0终止反应，7000rpm离心5min得沉淀，醇洗3次，8pa、-80℃下冻干50小时，得到有效氯为5％的氧化脱支淀粉。

(3)纳米颗粒的制备：称取0.05g5％有效氯氧化脱支淀粉于10ml超纯水中，糊化，逐滴加到10ml0.2mol/l的氯化钙溶液中，温度为25℃，转速为200rpm，反应2h，加入20ml无水乙醇，10000rpm离心10min，所述离心得到的沉淀经无水乙醇洗涤，8pa、-80℃下冻干50小时，得到淀粉纳米颗粒。

实施例2

(1)脱支淀粉的制备：用浓度为28.4g/l的无水磷酸氢二钠与浓度为19.2g/l柠檬酸配成ph为4.5的磷酸盐缓冲液。称取10g脱脂蜡质玉米淀粉，加缓冲液调成10％淀粉乳(m/v)，沸水浴40min使其糊化完全，边沸边搅拌，粘稠过后可间断搅拌。糊化完成后冷却至55℃，加入普鲁兰酶(20aspu/g)进行脱支，水浴8h。脱支后5000rpm离心2min，弃去下层沉淀得到上清液，20min沸水浴灭酶，再次离心弃去絮状失活酶。加3.5倍无水乙醇沉出脱支淀粉，沉淀再加200ml无水乙醇洗涤3次，10pa、-70℃冷冻干燥60h得到脱支淀粉。

(2)6％有效氯氧化氧化脱支淀粉的制备：称取5g脱支淀粉于200ml烧杯中，加去离子水到总重100g，配成4％的淀粉浆，糊化6min，置于恒温加热磁力搅拌器中，温度设为1℃，tempo(0.02mol/每脱水葡萄糖单位的脱支淀粉)溶解于蒸馏水中，再加到淀粉浆中，溴化钠(0.3mol/每脱水葡萄糖单位的脱支淀粉)也加到淀粉浆中。用0.3mol/l的naoh调淀粉浆ph至9.5，次氯酸钠3g(0.3g有效氯/5g淀粉，有效氯为6％)，缓慢加到淀粉浆中，加0.3mol/lhcl保持ph为9.5，次氯酸钠加完之后，随氧化反应的进行，羟基氧化为羰基和羧基，ph下降，再加naoh调ph至9.5。从加次氯酸钠时起计时，氧化3h，然后加入8ml无水乙醇，用hcl调ph6.5终止反应，8000rpm离心5min得沉淀，醇洗3次，10pa、-70℃冷冻干燥60h。

(3)淀粉纳米颗粒的制备：称取0.1g6％有效氯氧化脱支淀粉于10ml超纯水中，糊化，逐滴加到10ml0.1mol/l的氯化钙溶液中，温度为30℃，转速为300r，反应2.5h，加入20ml无水乙醇，11000r离心15min，所述离心得到的沉淀经无水乙醇洗涤，10pa、-70℃冷冻干燥60h，得到1.0％的氧化脱支淀粉浓度与0.1mol/l的钙离子制备的纳米颗粒。

实施例3

(1)脱支淀粉的制备：用浓度为28.4g/l的无水磷酸氢二钠与浓度为19.2g/l柠檬酸配成ph为5的磷酸盐缓冲液。称取10g脱脂蜡质玉米淀粉，加缓冲液调成15％淀粉乳(m/v)，沸水浴50min使其糊化完全，边沸边搅拌，粘稠过后可间断搅拌。糊化完成后冷却至60℃，加入普鲁兰酶(30aspu/g)进行脱支，水浴10h。脱支后6000rpm离心2min，弃去下层沉淀得到上清液，20min沸水浴灭酶，再次离心弃去絮状失活酶。加4倍无水乙醇沉出脱支淀粉，沉淀再加300ml无水乙醇洗涤3次，将沉淀在5pa、-60℃下冻干72小时得到得到脱支淀粉。

(2)7％有效氯氧化脱支淀粉的制备：称取5g脱支淀粉于200ml烧杯中，加去离子水到总重100g，配成5％的淀粉浆，糊化6min，置于恒温加热磁力搅拌器中，温度设为2℃，tempo(0.02mol/每脱水葡萄糖单位的脱支淀粉)溶解于蒸馏水中，再加到淀粉浆中，溴化钠(0.3mol/每脱水葡萄糖单位的脱支淀粉)也加到淀粉浆中。用0.4mol/l的naoh调淀粉浆ph至10，次氯酸钠3.5g(0.35g有效氯/5g淀粉，有效氯为7％)，缓慢加到淀粉浆中，加0.4mol/lhcl保持ph为10，次氯酸钠加完之后，随氧化反应的进行，羟基氧化为羰基和羧基，ph下降，再加naoh调ph至10。从加次氯酸钠时起计时，氧化4h，然后加入10ml无水乙醇，用hcl调ph6.5终止反应，9000rpm离心10min得沉淀，醇洗4次，5pa、-60℃下冷冻干燥72小时。

(3)淀粉纳米颗粒的制备：称取0.1g7％有效氯氧化脱支淀粉于10ml超纯水中，糊化，逐滴加到10ml0.05mol/l的氯化钙溶液中，温度为30℃，转速为300r，反应3h，加入30ml无水乙醇，12000r离心20min，所述离心得到的沉淀经无水乙醇洗涤，5pa、-60℃下冷冻干燥72小时，得到1.0％的氧化脱支淀粉浓度与0.05mol/l的钙离子制备的纳米颗粒。

实施例4

(1)脱支淀粉的制备：用浓度为28.4g/l的无水磷酸氢二钠与浓度为19.2g/l柠檬酸配成ph为5.5的磷酸盐缓冲液。称取10g脱脂蜡质玉米淀粉，加缓冲液调成15％淀粉乳(m/v)，沸水浴60min使其糊化完全，边沸边搅拌，粘稠过后可间断搅拌。糊化完成后冷却至60℃，加入普鲁兰酶(30aspu/g)进行脱支，水浴12h。脱支后7000rpm离心2min，弃去下层沉淀得到上清液，20min沸水浴灭酶，再次离心弃去絮状失活酶。加4倍无水乙醇沉出脱支淀粉，沉淀再加300ml无水乙醇洗涤4次，将沉淀在8pa、-70℃下冻干48小时到得到脱支淀粉。

(2)9％有效氯氧化淀粉纳米颗粒的制备：称取5g脱支淀粉于200ml烧杯中，加去离子水到总重100g，配成5％的淀粉浆，糊化5min，置于恒温加热磁力搅拌器中，温度设为3℃，tempo(0.01mol/每脱水葡萄糖单位的脱支淀粉)溶解于蒸馏水中，再加到淀粉浆中，溴化钠(0.2mol/每脱水葡萄糖单位的脱支淀粉)也加到淀粉浆中。首先用0.4mol/l的naoh调淀粉浆ph至10.5，次氯酸钠4.5g(0.45g有效氯/5g淀粉，有效氯为9％)，缓慢加到淀粉浆中，加0.4mol/lhcl保持ph为10.5，次氯酸钠加完之后，随氧化反应的进行，羟基氧化为羰基和羧基，ph下降，再加naoh调ph至10.5。从加次氯酸钠时起计时，氧化4h，然后加入15ml无水乙醇，用hcl调ph7.0终止反应，10000rpm离心15min得沉淀，醇洗4次，将沉淀在8pa、-70℃下冻干48小时得到9％有效氯氧化的脱支淀粉。

(2)淀粉纳米颗粒的制备：称取0.1g9％有效氯氧化的脱支淀粉于10ml超纯水中，糊化，逐滴加到0.05mol/l的氯化钙溶液中(10ml)，温度为25℃，转速为400r，反应4h，加入30ml无水乙醇，12000r离心30min，所述离心得到的沉淀经无水乙醇洗涤，8pa、-70℃下冻干48小时,得到淀粉纳米颗粒。

实施例5

对实施例1步骤(1)得到的脱支淀粉与实施例1、3、4得到的5～9％有效氯氧化的脱支淀粉进行性能分析

(1)羧基与羰基含量的检测：羧基与羰基含量通过滴定法来测定。结果见表1。

表1脱支淀粉中羰基与羧基的含量

通过tempo体系氧化反应，脱支淀粉6位碳羟基转化为羧基与羰基，有效氯用量直接影响两者的生成量。随着有效氯的增加，羰基和羧基含量逐渐增加(p<0.05)，羧基含量增加较快并且高于羰基含量。

(2)电位分析：准确称量5mg样品于离心管中，加入10ml超纯水(稀释度0.05％)，超声3min使其分散均匀，测粒径和电位。图1是不同有效氯(0,5,7,9％)氧化脱支淀粉不同ph值时的电位图，a,b,c,d分别代表脱支淀粉与实施例1、3、4得到的5,7,9％有效氯氧化的脱支淀粉。电位随有效氯增加而增加。ph值为碱性时，电位绝对值显著增加，酸性时，由于羧基质子化电位绝对值降低。

(3)差式扫描量热仪分析：样品(脱支淀粉与氧化脱支淀粉)1:2加水于小坩埚中，室温平衡4h以上，得到起始糊化温度to，峰值糊化温度tp，终止糊化温度tc，焓值δh和重扫焓值δhre。结果见表2。

表2脱支淀粉的热特性参数值

由表2可知，脱支淀粉氧化后有序性降低，需要的热焓值降低，降温快速回生时，氧化脱支淀粉由于高羧基含量，不能快速回生，氧化脱支淀粉间的静电斥力使双螺旋的重新形成变得困难分子重排，因此热焓值δhre较低。

(4)纳米颗粒的形貌：参考实施例5步骤(2)中样品的稀释方法，进行透射电镜观察。滴一滴样品悬浮液(0.2％，w/v)于液体导电碳胶上，红外灯下烘干，真空喷金，进行扫描电镜观察。图3是9％有效氯氧化的脱支淀粉(1％的浓度)，0.05～0.2mol/l钙离子浓度时制备的纳米颗粒透射电镜图和扫描电镜图，a、b、c分别是钙离子浓度为0.2mol/l，0.1mol/l和0.05mol/l钙离子浓度的透射电镜图，d、e、f分别是钙离子浓度为0.2mol/l，0.1mol/l和0.05mol/l钙离子浓度的扫描电镜图。图3a淀粉纳米颗粒粒径约50nm，图3b淀粉纳米颗粒粒径约40nm，图3c淀粉纳米颗粒粒径约30nm，粒径随钙离子浓度降低而减小。纳米颗粒是由于带负电的脱支淀粉与钙离子通过静电作用形成，之前有报道海藻酸钙纳米颗粒约150nm，与之相比，本发明的纳米颗粒粒径较小；与自组装制得的淀粉纳米颗粒相比，分散较均匀。总体来说，离子凝胶法制得的纳米颗粒的粒径，形貌与分散性都较好，有望应用于包埋装载营养成分，活性物质和药物。

(5)纳米颗粒粒径与电位测定

参考实施例5步骤(2)中样品的稀释方法，进行粒径与电位测定。图3中a，b，c分别表示9％有效氯氧化的脱支淀粉(1％浓度)与0.2mol/l，0.1mol/l，0.05mol/l钙离子制备的纳米颗粒的粒径分布图，由图3可知，粒径随钙离子浓度降低而降低。图4为9％有效氯氧化的脱支淀粉(1％浓度)与0.2mol/l，0.1mol/l，0.05mol/l钙离子制备的纳米颗粒的电位图，钙离子浓度为0.05mol/l时，电位约为-12.5mv，钙离子浓度为0.2mol/l时，电位约为-7.5mv，纳米颗粒的电位随钙离子浓度增加而降低。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。