本发明属于生物技术领域，特别涉及一种标准曲线法荧光定量pcr鉴定牛转基因拷贝数的方法及引物。
背景技术：
转基因动物是通过各种实验方法，将已知的外源性基因导入动物基因组内并使之整合到染色体上，且外源性基因能稳定地遗传给后代的动物。外源基因拷贝数定量检测是了解和评价转基因动物的重要内容之一。通过对转基因动物进行早期检测，及时了解转基因动物的基本特征，为转基因动物的后期培育和开发利用提供评价基础，避免人力、物力、财力的浪费。传统外源基因拷贝数的检测方法是southernblot，但耗时、费力、并需要大量基因组dna。实时荧光定量pcr技术是近年来迅速发展的dna/rna定量技术，与southernblot相比具有高特异性、高信噪比、高安全性、高效率、高通量、低成本等优点，已被广泛应用于转基因外源基因拷贝数的检测。
王晓建(2007)等报道，利用实时荧光定量pcr检测cark转基因小鼠，整个过程在2h内即可完成，3只小鼠的外源基因拷贝数分别为1，17和45，与southern杂交的结果完全一致，3次重复实验的△ct非常稳定，sd仅为0.15～0.46。杨继山(2010)等报道利用实时荧光定量pcr检测抗凝血酶iii转基因山羊外源基因拷贝数，通过对外源基因atiii和内参基因gapdh作标准曲线，分别得到atiii和gapdh的标准曲线方程，计算出转atiii基因山羊外源基因拷贝数。李振林(2013)等报道利用实时荧光定量检测nestin-gfp转基因小鼠外源基因整合拷贝数，转基因小鼠gfp基因和nestin基因表达一致，通过实时荧光定量pcr检测转基因小鼠gfp基因拷贝数，得到转基因小鼠外源基因拷贝数分别为3和4。taverniers(2005)报道，利用实时荧光定量pcr检测4种转基因动物，发现该方法的准确性完全可与southern杂交结果相匹配。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种标准曲线法荧光定量pcr鉴定牛转基因拷贝数的方法及引物。它是利用实时荧光定量pcr法，以已经构建完成的转牛源四因子oct4、sox2、klf4、cmyc牛体细胞(转基因型)及未转牛源4因子oct4、sox2、klf4、cmyc牛体细胞(野生型)为检测对象。所转入的oct4、sox2、klf4、cmyc基因属牛本身的基因，故在检测引物设计时加上一段外源载体基因序列，则可直接检测是否转入牛源四因子oct4、sox2、klf4、cmyc基因及其转基因拷贝数。本发明采用标准曲线法荧光定量pcr先做出牛源四因子oct4、sox2、klf4、cmyc转基因拷贝数标准曲线。分别检测已转牛源四因子oct4、sox2、klf4、cmyc牛体细胞(转基因型)及未转牛源4因子oct4、sox2、klf4、cmyc牛体细胞(野生型)，可直接检出待测样品其是否转入牛源4因子oct4、sox2、klf4、cmyc基因及其转基因拷贝数。为转基因牛遗传稳定性筛选实验奠定基础。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种标准曲线法荧光定量pcr鉴定牛转基因拷贝数的引物，包括内参基因gapdh荧光定量pcr反应使用的引物对seqidno.1和seqidno.2、待测基因oct4、sox2、klf4、cmyc荧光定量pcr反应使用的引物对seqidno.3～seqidno.10，引物设计参数为引物长度18-25bp，tm55-65℃，其中每对检测引物的上游引物tm值和下游引物tm值相差不大于4℃，产物大小为100-300bp。
一种标准曲线法荧光定量pcr鉴定牛转基因拷贝数的方法，包括以下步骤：
(1)提取转基因型——已转牛源四因子oct4、sox2、klf4、cmyc牛体细胞及野生型——未转牛源4因子oct4、sox2、klf4、cmyc牛体细胞的基因组dna；
(2)提取已经构建完成的牛源四因子oct4、sox2、klf4、cmyc转基因质粒dna；
(3)测定已转牛源四因子牛体细胞及未转牛源4因子牛体细胞样品基因组dna质量和浓度，统一稀释成同一浓度50ng/ul；
(4)根据内参基因gapdhdna基因片段设计并合成引物对seqidno.1和seqidno.2；根据待测牛源四因子oct4、sox2、klf4、cmyc转基因质粒dna基因片段设计并合成引物对seqidno.3～seqidno.10；
(5)标准曲线法荧光定量pcr；
(6)溶解曲线分析确定其唯一性：溶解曲线若为单峰，说明在荧光定量pcr扩增过程中没有出现非特异性扩增，由此推断荧光定量pcr扩增所获得的数据是可靠的；
(7)分析荧光定量pcr数据，确定转基因拷贝数n。
所述步骤(5)包括以下步骤：
(1)测定牛源四因子oct4、sox2、klf4、cmyc转基因质粒dna质量和浓度，将提取的牛源四因子oct4、sox2、klf4、cmyc转基因质粒dna统一10x稀释5个梯度，分别为100,10-1,10-2,10-3,10-4倍，分别以不同稀释度的转基因质粒dna为标准品模板；
(2)用待测基因oct4、sox2、klf4、cmyc引物seqidno.3～seqidno.10及内参基因gapdh引物seqidno.1和seqidno.2对100,10-1,10-2,10-3,10-4倍不同稀释度的转基因质粒dna标准品模板进行荧光定量pcr反应，根据转基因质粒dna标准品荧光定量pcr反应实验检测结果绘制出△ct值对应的log2n(n代表拷贝数)的标准曲线，计算公式为：log2n＝a*△ct+bn代表拷贝数，△ct＝ct(待测基因)-ct(gapdh)；
(3)用待测基因oct4、sox2、klf4、cmyc引物seqidno.3～seqidno.10及内参基因gapdh引物seqidno.1和seqidno.2对已转牛源四因子牛体细胞及未转牛源4因子牛体细胞样品基因组dna进行荧光定量pcr反应，根据荧光定量pcr反应实验检测结果得出△ct值，△ct(转基因型)＝ct(转基因型待测基因)-ct(转基因型gapdh)，△ct(野生型)＝ct(野生型待测基因)-ct(野生型gapdh)。
所述步骤(7)包括以下步骤：
(1)根据已转牛源四因子oct4、sox2、klf4、cmyc转基因牛体细胞△ct(转基因型)值代入对应的标准曲线进行拷贝数分析；
(2)根据未转牛源四因子oct4、sox2、klf4、cmyc牛体细胞△ct(野生型)值代入对应的标准曲线进行拷贝数分析。
本发明的优点和有益效果是：
1.本发明利用该对检测引物，能够快速、准确鉴定牛外源基因的拷贝数。
2.本发明利用检测引物和方法，能够快速鉴定出牛转基因的拷贝数，提高了检测转基因动物转基因拷贝数检测效率，节省了dna用量。
3.该检测引物和方法所需的实验材料量少、工作量小，省时，结果准确可靠，对指导牛转基因拷贝数鉴定，尤其是与內源基因相同的转基因拷贝数检测具有重要的理论和现实意义。
附图说明
图1是本发明质粒构建流程图。
图2是本发明转基因拷贝数对应△ct值标准曲线图。
图3是本发明溶解曲线分析图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明：
引物设计：gapdh基因作为内参基因，gapdh基因在genbank中的登录号为nm_001034034.2。牛源四因子oct4、sox2、klf4、cmyc基因在genbank中的登录号分别为nm_174580.3、nm_001105463.2、nm_001105385.1、nm_001046074.2。标准曲线法荧光定量pcr鉴定牛转基因拷贝数的基因扩增引物对，采用primerpremier5.0软件设计内参基因gapdh及待检转基因oct4、sox2、klf4、cmyc的荧光定量引物，引物长度在17-25bp之间，上下游引物不能相差太大，荧光定量产物长度80-150bp最好，最长是300bp；tm值在55-65℃之间，其中每对检测引物的上游引物tm值和下游引物tm值相差不大于4℃；产物不能形成二级结构。
所述的引物对进一步优选：gapdh、oct4、sox2、klf4、cmyc正向引物序列，反向引物序列如引物序列表1所示。
表1引物序列表
转基因质粒：牛源四因子oct4、sox2、klf4、cmyc转基因质粒构建方法piggybac(pb)转座子+oct4、sox2、klf4、cmyc基因，质粒载体构建顺序如图1所示。牛源四因子oct4、sox2、klf4、cmyc基因在genbank中的登录号分别为nm_174580.3、nm_001105463.2、nm_001105385.1、nm_001046074.2。载体构建采用转座子piggybac携带oct4、sox2、klf4、cmyc核转录因子，piggybac是一种转座效率较高的转座子，可以在许多物种中以较高的频率准确切出和转座，与其他载体相比，操作简单，效率相近，是比较理想的载体。
构建方法：设计含有酶切位点ecolri(上游)和xbai(下游)的oct4、sox2、klf4、cmyccdna扩增引物，通过pcr法，采用上述引物从牛囊胚中扩增oct4、sox2、klf4和cmyccdna，使用pcr纯化试剂盒纯化4个扩增产物，之后采用ecolri,xbai酶切piggybac转座子质粒，回收骨架部分，最后将骨架与pcr扩增产物分别16度过夜连接，连接产物转化大肠杆菌dh5α,菌落pcr法初步鉴定阳性克隆，分别挑取3个阳性质粒进一步扩增，送测序公司测序鉴定质粒是否构建成功，测序结果显示成功的质粒用于后续转基因实验。
表2构建质粒使用引物表
标准曲线法荧光定量pcr鉴定牛转基因拷贝数的方法，包括以下步骤：
(1)提取已转牛源四因子oct4、sox2、klf4、cmyc牛体细胞(转基因型)及未转牛源4因子oct4、sox2、klf4、cmyc牛体细胞(野生型)基因组dna；
(2)已经构建完成的牛源四因子oct4、sox2、klf4、cmyc转基因质粒dna；
(3)测定已转牛源四因子牛体细胞(转基因型)及未转牛源4因子牛体细胞(野生型)样品基因组dna质量和浓度，统一稀释成同一浓度50ng/ul；
(4)根据待测牛源四因子oct4、sox2、klf4、cmyc转基因质粒dna基因片段设计并合成引物，设计参数为引物长度18-25bp，tm55-65℃，其中前后引物tm值相差不大于2℃，产物大小为100-300bp；
(5)标准曲线法荧光定量pcr，在thermotcr0096型号荧光定量仪上进行荧光定量pcr反应：
(a)、测定牛源四因子oct4、sox2、klf4、cmyc转基因质粒dna质量和浓度，将提取的牛源四因子oct4、sox2、klf4、cmyc转基因质粒dna统一10x稀释5个梯度，分别为100,10-1,10-2,10-3,10-4倍，分别以不同稀释度的转基因质粒dna为标准品模板；
(b)、用待测基因oct4、sox2、klf4、cmyc引物及内参基因gapdh引物对100,10-1,10-2,10-3,10-4倍不同稀释度的转基因质粒dna标准品模板进行荧光定量pcr反应，根据转基因质粒dna标准品荧光定量pcr反应实验检测结果绘制出△ct值对应的log2n(n代表拷贝数)的标准曲线，计算公式为：log2n＝a*△ct+bn代表拷贝数，△ct＝ct(待测基因)-ct(gapdh)，转基因拷贝数对应△ct值标准曲线如图2所示；
(c)、用待测基因oct4、sox2、klf4、cmyc引物及内参基因gapdh引物对已转牛源四因子牛体细胞(转基因型)及未转牛源4因子牛体细胞(野生型)样品基因组dna进行荧光定量pcr反应，根据荧光定量pcr反应实验检测结果得出△ct值，△ct(转基因型)＝ct(转基因型待测基因)-ct(转基因型gapdh)，△ct(野生型)＝ct(野生型待测基因)-ct(野生型gapdh)；
(6)溶解曲线分析确定其唯一性：溶解曲线若为单峰，说明在荧光定量pcr扩增过程中没有出现非特异性扩增，由此推断荧光定量pcr扩增所获得的数据是可靠的。溶解曲线分析如图3所示；
(7)分析荧光定量pcr数据，确定转基因拷贝数n：
(a)牛源四因子oct4、sox2、klf4、cmyc标准曲线制备，计算公式为：log2n＝a*△ct+b△ct值对应的log2n(n代表拷贝数)的标准曲线，n代表拷贝数，△ct＝ct(待测基因)-ct(gapdh)，牛源四因子oct4、sox2、klf4、cmyc转基因拷贝数n对应△ct值标准曲线如图2所示；
(b)根据已转牛源四因子oct4、sox2、klf4、cmyc转基因牛体细胞(转基因型)△ct(转基因型)值代入对应的标准曲线公式进行拷贝数分析；
(c)根据未转牛源四因子oct4、sox2、klf4、cmyc牛体细胞(野生型)△ct(野生型)值代入对应的标准曲线公式进行拷贝数分析。
实施例分析：
标准曲线法荧光定量pcr鉴定牛体细胞(转基因型)1号样品、牛体细胞(转基因型)2号样品、牛体细胞(野生型)3号样品进行转oct4基因拷贝数分析：
(1)、oct4转基因拷贝数n对应△ct值标准曲线如图2所示：log2n＝-1.103*△ct-2.952
(2)、用待测基因oct4引物、内参基因gapdh引物对已转牛源oct4基因牛体细胞(转基因型)1号样品基因组dna、2号样品基因组dna进行荧光定量pcr反应，根据荧光定量pcr反应实验检测结果得出△ct值，根据公式△ct(转基因型)＝ct(转基因型待测oct4基因)-ct(转基因型gapdh)计算结果，△ct(转基因型1号样品)＝14.71-18.04＝-3.33△ct(转基因型2号样品)＝15.00-18.55＝-3.55；
(3)、用待测基因oct4引物、内参基因gapdh引物对未转牛源oct4基因牛体细胞(野生型)3号样品基因组dna进行荧光定量pcr反应，根据荧光定量pcr反应实验检测结果得出△ct值，根据公式△ct(野生型)＝ct(野生型待测oct4基因)-ct(野生型gapdh)计算结果，△ct(野生型3号样品)＝16.11-17.25＝-1.41
(4)、△ct(转基因型1号样品)＝-3.33，△ct(转基因型2号样品)＝-3.55，△ct(野生型3号样品)＝-1.41。代入oct4转基因拷贝数n对应△ct值标准曲线公式log2n＝-1.103*△ct-2.952计算出,(转基因型1号样品)拷贝数为1.65，(转基因型2号样品)拷贝数为1.95，(野生型3号样品)拷贝数为0.38。
(5)、根据转基因拷贝数计算结果分析得出，转基因型1号样品转基因拷贝数为2个，转基因型2号样品转基因拷贝数为2个，野生型3号样品转基因拷贝数为0个。该检测引物和方法所需的实验材料量少、工作量小，省时，结果准确可靠，对指导牛转基因拷贝数鉴定，尤其是与內源基因相同的转基因拷贝数检测具有重要的理论和现实意义。
本发明采用sybrgreenⅱ实时荧光定量pcr法是在pcr反应体系中加入sybrgreenⅱ荧光染料，该染料能够结合于所有dna双螺旋小沟区域，并具有受激发产生绿色荧光的能力；当它与pcr合成的双链dna结合，在激发光照射下产生荧光，由于荧光信号强度的增加与pcr产物的增加完全同步，因此，通过对pcr反应进程中的荧光信号强度进行实时检测，便可间接的获得pcr扩增数据；转基因拷贝数通过标准曲线法荧光定量pcr法可以直接分析获得。
虽然近年来，利用高通量、快速、灵敏的定量pcr方法检测转基因拷贝数逐渐受到科研人员的青睐。以实验室已经构建完成的转牛源四因子oct4、sox2、klf4、cmyc牛体细胞为检测对象。所转入的oct4、sox2、klf4、cmyc基因属牛本身的基因，在检测引物设计时加上一段外源载体基因，则可直接检测是否转入oct4、sox2、klf4、cmyc外源基因及其拷贝数。
以上所述的实施例仅用于说明本发明的技术思想及特点，其目的在于使本领域内的技术人员能够理解本发明的内容并据以实施，不能仅以本实施例来限定本发明的专利范围，即凡本发明所揭示的精神所作的同等变化或修饰，仍落在本发明的专利范围内。
序列表
<110>内蒙古赛科星家畜种业与繁育生物技术研究院有限公司；内蒙古赛科星繁育生物技术（集团）股份有限公司
<120>标准曲线法荧光定量pcr鉴定牛转基因拷贝数的方法及引物
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<170>siposequencelisting1.0
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