细胞培养用培养基组合物的制备方法与流程

本发明涉及细胞培养用培养基组合物的制备方法，更详细地涉及通过大量培养干细胞，可提高收率且可提高干细胞内的有效成分收率的细胞培养用培养基组合物的制备方法及利用细胞培养用培养基组合物的制备方法和干细胞有效成分三低提取法的干细胞破碎提取物的制备方法、利用其的抗炎症治疗用组合物及细胞再生治疗用组合物。

背景技术：

干细胞(stemcell)作为具有可以分化成各种身体组织的能力的微分化细胞，因具有可分化为各种组织细胞的能力，所以进行很多利用其的研究。在干细胞中，成体干细胞容易从脂肪、骨骼、脐带血或胎盘等部位获得，与胚胎干细胞相比，伦理问题少，若使用使用者本人的细胞，则免疫排斥反应也少，因此多进行利用其的研究。

直接注入成体干细胞的治疗因免疫排斥反应等的理由仅限于自我治疗。为了跨越上述自我治疗的局限，通过破碎干细胞来，去除附有发生免疫排斥反应的免疫原性的细胞膜的方法可成为一种方法。本申请的发明人第一次确定了上述干细胞破碎提取物的概念，且申请过其开创性发明专利。其开创性专利的优点在于，通过去除附有发生免疫排斥反应的免疫原性的细胞膜，从而具有任何人均可使用的通用性，因此进行大量培养的理由成立，其结果可实现干细胞的大众化和产业化。

因此，为了实现干细胞的大众化和产业化，需要有利于干细胞的大量培养的方法、对其有效成分进行提取的方法的持续研究及开发。

技术实现要素：

要解决的技术问题

本发明用于解决上述的问题，目的在于，提供利用通过大量培养干细胞来提高细胞的获取的干细胞大量培养用培养基组成法和可提高干细胞有效成分收集率的干细胞有效成分三低提取法的干细胞破碎提取物的制备方法。

解决技术问题的手段

作为用于实现上述目的，本发明人的细胞培养用培养基组成物的制备方法的特征在于，包含基本培养基、透明质酸及添加剂组合物。

上述添加剂组合物的特征在于，包含甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、羟基脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)、表皮细胞生长因子(egf)、血管内皮生长因子(vegf)、角质细胞生长因子(kgf)、肝细胞生长因子(hgf)、转化生长因子(tgf)、维生素c、维生素b1、维生素b12、维生素e、硒及运铁蛋白。

上述基本培养基为达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(dmem，dulbecco’smodifiedeagle’smedium)、最小必需培养基(mem，minimalessentialmedium)、基础伊格培养基(bme，basalmediumeagle)、rpmi1640、f-10、f12、达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基-f12(dmem-f12)、α-最小必需培养基(α-minimalessentialmedium，α-mem)、格拉斯哥最小必需培养基(glasgow’sminimalessentialmedium，g-mem)、伊思考夫改良达尔伯克培养基(imdm，iscove’smodifieddulbecco’smedium)、maccoy’s5a培养基、amniomax、aminomaxⅱ完全培养基(aminomaxⅱcompletemedium)、chang中型mesemcult-xf培养基(chang’smediummesemcult-xfmedium)中的一种。

本发明的特征在于，相对于上述培养基组合物，上述添加剂组合物以10μg/ml的浓度包含透明质酸，以1ng/ml的浓度包含上述甘氨酸，以1ng/ml的浓度包含上述组氨酸，以1ng/ml的浓度包含上述异亮氨酸，以1ng/ml的浓度包含上述蛋氨酸，以1ng/ml的浓度包含上述苯丙氨酸，以10ng/ml的浓度包含上述脯氨酸，以5ng/ml的浓度包含上述羟基脯氨酸，以1ng/ml的浓度包含上述丝氨酸，以1ng/ml的浓度包含上述苏氨酸，以1ng/ml的浓度包含上述色氨酸，以1ng/ml的浓度包含上述酪氨酸，以2ng/ml的浓度包含上述缬氨酸，以9μg/ml的浓度包含上述碱性成纤维细胞生长因子，以1.5μg/ml的浓度包含上述表皮细胞生长因子，以1μg/ml的浓度包含上述血管内皮生长因子，以1.2μg/ml的浓度包含上述角质细胞生长因子，以0.5μg/ml的浓度包含上述肝细胞生长因子，以0.5μg/ml的浓度包含上述转化生长因子，以2μg/ml的浓度包含上述维生素c，以0.5μg/ml的浓度包含上述维生素b1，以3μg/ml的浓度包含上述维生素b12，以500μg/ml的浓度包含上述维生素e，以1.8μg/ml的浓度包含上述硒，以12μg/ml的浓度包含上述运铁蛋白。

并且，利用干细胞大量培养用培养基组成法和干细胞有效成分三低提取法的干细胞破碎提取物的制备方法的特征在于，包括：第一步骤，提取干细胞；第二步骤，在上述的培养基组合物的培养基中对所提取的上述干细胞进行培养；第三步骤，对上述干细胞进行传代培养；第四步骤，从经培养的上述干细胞中获得细胞；第五步骤，对所获得的上述细胞进行破碎；第六步骤，对已破碎的上述物质进行过滤；以及第七步骤，对第六步骤的经过滤的物质进行冷冻干燥来保存或利用。

利用干细胞大量培养用培养基组成法和干细胞有效成分三低提取法的干细胞破碎提取物的制备方法的特征在于，在上述第五步骤中，利用干细胞有效成分提取装置，上述干细胞有效成分提取装置包括：本体部10，在内部形成空间且阻隔外部和内部；第一容器部12，设置于上述本体部10的内部且使上方开口，第二容器部14，相对于上述第一容器部12形成相对小的尺寸，设置于上述第一容器部12内，通过使上方开口来向第二容器部14内部投入干细胞；破碎部16，对上述第二容器部14内部的干细胞进行破碎；阀18，用于向上述本体部10内部约束空气的流动；以及泵20，在上述本体部10内部吸入空气，将上述干细胞投入于储存性溶液后，投入于上述第二容器部。

抗炎症治疗用组合物的特征在于，利用作为本发明再一实施例的干细胞破碎提取物。

细胞再生治疗用组合物的特征在于，利用作为本发明另一实施例的干细胞破碎提取物。

抗关节炎治疗用组合物的特征在于，利用作为本发明还一实施例的干细胞破碎提取物。

发明的效果

本发明的细胞培养用培养基组合物的制备方法及利用细胞培养用培养基组合物的制备方法和干细胞有效成分三低提取法的干细胞破碎提取物的制备方法的效果如下。

由于不使用血清，因而稳定，并且通过使用支架来培养增大，从而具有干细胞的有效因子的收率提高的优点。

当提取干细胞的有效成分时，在低温、低压及储存的三低环境下进行干细胞的破碎，因此，具有可防止干细胞的有效成分受到损伤的优点。

并且，并且利用上述两种方法的干细胞破碎提取物中完全去除附有免疫原性的细胞膜，从而具有任何人可使用的通用性，从而具有可实现干细胞的大众化和产业化的优点。

附图说明

图1为示出本发明的干细胞有效成分三低提取装置的图。

图2为为了确认基于本发明的干细胞破碎提取物的抗关节炎效果，利用作为软骨细胞的特定标记的cd44确认为软骨细胞的图。

图3为对软骨细胞按浓度处理干细胞破碎成分提取物，来培养24小时、测定细胞生存率，从而确认对物质的细胞的毒性的图。

图4为通过对软骨细胞处理白细胞介素-1α(il-1α)来引起炎症后，对引起炎症的软骨细胞按浓度处理干细胞破碎提取物，从而对作为炎症介质因子的no生成抑制进行确认的图。

图5为对利用白细胞介素-1α诱导的软骨细胞处理干细胞破碎提取物后，对所诱导的no的生成抑制效果与诱导型一氧化氮合酶(inos)和环氧化酶-2(cox-2)的表达抑制的关联进行确认的图。

图6为对处理干细胞破碎提取物的软骨细胞抑制基于白细胞介素-1α(il-1α)的核因子-κb(nf-κb)蛋白质向核内移动进行确认的图。

图7为通过对由白细胞介素-1α发生炎症的软骨细胞处理干细胞破碎提取物，来确认imapks活性的图。

图8为通过遗传学表达，对本干细胞提取物的抗炎症效果进行确认的图。

图9为通过参与软骨形成发达的sox-9的基因，对软骨形成效果进行确认的图。

图10为示出对本发明的干细胞破碎提取物按浓度进行处理后，是否显著表达细胞毒性的图。

图11为示出与脂多糖(lps)同时处理本发明的干细胞破碎提取物后，是否表达细胞毒性的图。

图12为示出与脂多糖处理本发明的干细胞破碎提取物后细胞形态的变化的图。

图13为示出与脂多糖处理本发明的干细胞破碎提取物后氧化氮浓度的变化的图。

图14为示出与脂多糖处理本发明的干细胞破碎提取物后inos及环氧化酶-2(cox-2)蛋白表达变化的图。

图15为示出与脂多糖处理本发明的干细胞破碎提取物后，肿瘤坏死因子α(tnfα)的变化的图。

图16为示出与脂多糖处理本发明的干细胞破碎提取物后，白细胞介素-1β(il-1β)的变化的图。

附图标记的说明

10：本体部12：第一容器部

14：第二容器部16：破碎部

18：阀20：泵。

具体实施方式

以下，参照附图对本发明的细胞培养用培养基组合物的制备方法及利用细胞培养用培养基组合物的制备方法和干细胞有效成分三低提取法的干细胞破碎提取物的制备方法的优选实施例进行详细说明。

首先、如图1所示，作为本发明的干细胞有效成分提取装置可包括：本体部10，在内部形成空间且阻隔外部和内部；第一容器部12，设置于上述本体部10的内部且上方开口；第二容器部14，相对于上述第一容器部12形成相对小的尺寸，设置于上述第一容器部12内，通过使上方开口来向第二容器部14内部投入干细胞；破碎部16，对上述第二容器部14内部的干细胞进行破碎；阀18，用于向上述本体部10内部约束空气的流动；以及泵20，在上述本体部10内部吸入空气。

首先，在作为本发明的提取装置设置有本体部10。如图1所示，上述本体部10通过在本体部的内部设置封闭的空间，来阻隔外部和内部。

在上述本体部10的内部设置有第一容器部12。上述第一容器部12在内部设置有内部，并且上部开放。在上述第一容器部12装载有冰，从而起到降低在下面进行说明的第二容器部14内部的干细胞的温度的作用。

在上述第一容器部12的内部设置有第二容器部14。上述第二容器部14与上述第一容器部12相同地，在内部设置有空间，并且上部开放。尤其，上述第二容器部14的大小相对小于上述第一容器部12，上述第二容器部14可装载于上述第一容器部12的内部。在上述第二容器部14可装载有干细胞。

并且，在本发明中还可设置破碎部16。上述破碎部16起到利用装载于上述第二容器部14的内部的干细胞破碎的作用。

并且，在本发明中设置有空气与外部流动的流路，并设置对通过上述流路的空气的流动选择性地进行阻隔的阀18。在上述流路的另一端设有泵20，来向外部排出上述本体部10内部的空气，从而可使上述本体部10内部处于真空状态。

并且，投入于上述第二容器部的干细胞可通过放入储存液，来使上述干细胞膨胀。即，将上述干细胞放入如蒸馏水等储存液，来上述干细胞可借助渗透压进行膨胀，从而利用小的冲击进行破碎。

并且，对本发明的干细胞大量培养用培养基组合物及其的培养基组成方法进行详细说明。

在本发明中通过制备培养基，来提高细胞获得量，并且当破碎细胞时，可获得更多的有效成分。

在上述培养基中，基本培养基作为在细胞的培养中通常所使用的公知的培养基，例如，可以为达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(dulbecco’smodifiedeagle’smedium)、最小必需培养基(minimalessentialmedium)、基础伊格培养基(basalmediumeagle)、rpmi1640、f-10、f12、达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基-f12、α-最小必需培养基(α-minimalessentialmedium)、格拉斯哥最小必需培养基(glasgow’sminimalessentialmedium)、伊思考夫改良达尔伯克培养基(iscove’smodifieddulbecco’smedium)、maccoy’s5a培养基、amniomax、aminomaxⅱ完全培养基、chang中型mesemcult-xf培养基等，但是并不限定于此。

并且，向上述培养基追加添加剂组合物。上述添加剂组合物可包含透明质酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、羟基脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、碱性成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、血管内皮生长因子、角质细胞生长因子、肝细胞生长因子、转化生长因子、维生素c、维生素b1、维生素b12、维生素e、硒及运铁蛋白。

首先、在上述添加剂组合物中包含透明质酸。当细胞培养时，上述透明质酸起到支架作用，相对于上述培养基组合物，能够以10μg/ml的浓度被包含。

并且，上述添加剂组合物包含甘氨酸。上述甘氨酸作为氨基酸对细胞的生长起到营养成分作用，相对于上述培养基组合物，能够以1ng/ml的浓度被包含。

上述添加剂组合物包含组氨酸。上述组氨酸作为氨基酸对细胞的生长起到营养成分作用，相对于上述培养基组合物，能够以1ng/ml的浓度被包含。

上述添加剂组合物包含异亮氨酸。上述组氨酸作为氨基酸对细胞的生长起到营养成分作用，相对于上述培养基组合物，能够以1ng/ml的浓度被包含。

上述添加剂组合物包含蛋氨酸。上述蛋氨酸作为氨基酸对细胞的生长起到营养成分作用，相对于上述培养基组合物，能够以1ng/ml的浓度被包含。

上述添加剂组合物包含苯丙氨酸。上述苯丙氨酸作为氨基酸对细胞的生长起到营养成分作用，相对于上述培养基组合物，能够以1ng/ml的浓度被包含。

上述添加剂组合物包含脯氨酸。上述脯氨酸作为氨基酸对细胞的生长起到营养成分作用，相对于上述培养基组合物，能够以10ng/ml的浓度被包含。

上述添加剂组合物包含羟基脯氨酸。上述羟基脯氨酸作为氨基酸对细胞的生长起到营养成分作用，相对于上述培养基组合物，能够以5ng/ml的浓度被包含。

上述添加剂组合物包含丝氨酸。上述丝氨酸作为氨基酸对细胞的生长起到营养成分作用，相对于上述培养基组合物，能够以1ng/ml的浓度被包含。

上述添加剂组合物包含苏氨酸。上述苏氨酸作为氨基酸对细胞的生长起到营养成分作用，相对于上述培养基组合物，能够以1ng/ml的浓度被包含。

上述添加剂组合物包含色氨酸。上述色氨酸作为氨基酸对细胞的生长起到营养成分作用，相对于上述培养基组合物，能够以1ng/ml的浓度被包含。

上述添加剂组合物包含酪氨酸。上述酪氨酸作为氨基酸对细胞的生长起到营养成分作用，相对于上述培养基组合物，能够以1ng/ml的浓度被包含。

上述添加剂组合物包含缬氨酸。上述缬氨酸作为氨基酸对细胞的生长起到营养成分作用，相对于上述培养基组合物，能够以2ng/ml的浓度被包含。

并且，上述添加剂组合物包含碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)。上述碱性成纤维细胞生长因子有助于所培养的细胞的生长，相对于上述培养基组合物能够以9μg/ml的浓度被包含。

上述添加剂组合物包含表皮细胞生长因子(egf)。上述表皮细胞生长因子有助于所培养的细胞的生长，相对于上述培养基组合物能够以1.5μg/ml的浓度被包含。

上述添加剂组合物包含血管内皮生长因子(vegf)。上述血管内皮生长因子有助于所培养的细胞的生长，相对于上述培养基组合物能够以1μg/ml的浓度被包含。

上述添加剂组合物包含角质细胞生长因子(kgf)。上述角质细胞生长因子有助于所培养的细胞的生长，相对于上述培养基组合物能够以1.2μg/ml的浓度被包含。

上述添加剂组合物包含肝细胞生长因子(hgf)。上述肝细胞生长因子有助于所培养的细胞的生长，相对于上述培养基组合物能够以0.5μg/ml的浓度被包含。

上述添加剂组合物包含转化生长因子(tgf)。上述转化生长因子有助于所培养的细胞的生长，相对于上述培养基组合物能够以0.5μg/ml的浓度被包含。

并且，上述添加剂组合物包含维生素c。上述维生素c有助于所培养的细胞的生长，相对于上述培养基组合物能够以2μg/ml的浓度被包含。

上述添加剂组合物包含维生素b1。上述维生素b1有助于所培养的细胞的生长，相对于上述培养基组合物能够以0.5μg/ml的浓度被包含。

上述添加剂组合物包含维生素b12。上述维生素b12有助于所培养的细胞的生长，相对于上述培养基组合物能够以3μg/ml的浓度被包含。

上述添加剂组合物包含维生素e。上述维生素e有助于所培养的细胞的生长，相对于上述培养基组合物能够以500μg/ml的浓度被包含。

并且，上述添加剂组合物包含硒。上述硒有助于细胞的活性，相对于上述培养基组合物能够以1.8μg/ml的浓度被包含。

上述添加剂组合物包含运铁蛋白。上述运铁蛋白有助于细胞的活性，相对于上述培养基组合物能够以12μg/ml的浓度被包含。

并且，利用本发明的干细胞有效成分提取装置对细胞培养用培养基组合物的制备方法及利用细胞培养用培养基组合物的制备方法和干细胞有效成分三低提取法的干细胞破碎提取物的制备方法进行说明。

第一步骤：从人体的脂肪、骨髓、脐带血或胎盘中的一个中提取干细胞。在本发明中，利用脂肪吸收术收取脂肪后，通过酶处理和多次的离心分离进行纯化而分离脂肪干细胞。

第二步骤：利用通过使用大量培养用培养基组合物而制备的培养基对已分离的上述干细胞进行培养。若使用上述干细胞大量培养用培养基组合物，则通过提高干细胞的生长速度，来使干细胞的获取率变高。

第三步骤：去除已培养干细胞的培养液后，分离干细胞，并获取细胞漂浮液来进行传代培养。

第四步骤：若细胞生长为充分的密度，则从板中分离细胞。分离干细胞后，利用生理食盐水或磷酸盐缓冲液(pbs，phosphatebuffersaline)清洗数次。通过利用细胞计数(cellcounting)器测定细胞数，来总是制备规定浓度的漂浮液。

第五步骤：去除上清液并添加增量剂，从而可实现干细胞膜的破碎。通过施加超声波，来利用干细胞有效成分三低提取法破碎细胞。若通过显微镜确认干细胞全部破碎，则结束破碎。若经过上述三低提取法的过程，则在短时间内进行有效的细胞膜破碎，从而保持干细胞内部的生长因子和细胞活性物质等有效成分的大部分。

第六步骤：在储存性增量剂和干细胞破碎混合物中与作为干细胞内容物的多种生长因子、细胞活性物质一同存在细胞膜残留物。其中，利用离心分析及微过滤器去除不需要的细胞膜残留物。此时去除附在细胞膜的引起免疫排斥反应的免疫原性来提取任何人可使用的干细胞有效成分。

第七步骤；对通过上述制备的干细胞破碎提取物进行冷冻保存或进行冷冻干燥来保存并利用。

将通过上述步骤获得的效成分称为干细胞破碎提取物，作为一名还称为去壳干细胞(shelledstemcell)。

以下，示出利用基于本发明添加剂组合物的干细胞大量培养用培养基组合物提取干细胞的破碎提取物有效成分进行实验的结果。

比较例1

在100重量份的达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(dmem，dulbecco’smodifiedeaglemedium)，作为血清添加11、12重量份的胎牛血清(fbs)，作为抗生素混合0.6重量份的青霉素(penicillin)的培养基中培养干细胞，并使干细胞通过上述的过程生长，提取了有效因子。

实施例2

在100重量份的达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(dmem，dulbecco’smodifiedeaglemedium)，不包含血清且混合含有营养成分的20重量份的血清(serum)的培养基中培养干细胞，并使干细胞根据上述过程生长，提取了有效因子。

实施例3

在100重量份的达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(dmem，dulbecco’smodifiedeaglemedium)中混合5重量份的表1所示的本发明的添加剂组合物的培养基中，培养干细胞，并使干细胞根据上述过程生长，提取了有效因子。

实施例4

在100重量份的达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(dmem，dulbecco’smodifiedeaglemedium)中混合10重量份的表1所示的本发明的添加剂组合物的培养基中，培养干细胞，并使干细胞根据上述过程生长，提取了有效因子。

实施例5

在100重量份的达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(dmem，dulbecco’smodifiedeaglemedium)中混合15重量份的表1所示的本发明的添加剂组合物的培养基中，培养干细胞，并使干细胞根据上述过程生长，提取了有效因子。

实施例6

在100重量份的达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(dmem，dulbecco’smodifiedeaglemedium)中混合20重量份的表1所示的本发明的添加剂组合物的培养基中，培养干细胞，并使干细胞根据上述过程生长，提取了有效因子。

实施例7

在100重量份的达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(dmem，dulbecco’smodifiedeaglemedium)中混合25重量份的表1所示的本发明的添加剂组合物的培养基中，培养干细胞，并使干细胞根据上述过程生长，提取了有效因子。

实施例8

在100重量份的达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(dmem，dulbecco’smodifiedeaglemedium)中混合30重量份的表1所示的本发明的添加剂组合物的培养基中，培养干细胞，并使干细胞根据上述过程生长，提取了有效因子。

实施例9

在100重量份的达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(dmem，dulbecco’smodifiedeaglemedium)中混合35重量份的表1所示的本发明的添加剂组合物的培养基中，培养干细胞，并使干细胞根据上述过程生长，提取了有效因子。

实施例10

在100重量份的达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(dmem，dulbecco’smodifiedeaglemedium)中混合40重量份的表1所示的本发明的添加剂组合物的培养基中，培养干细胞，并使干细胞根据上述过程生长，提取了有效因子。

实施例11

在100重量份的达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(dmem，dulbecco’smodifiedeaglemedium)中混合45重量份的表1所示的本发明的添加剂组合物的培养基中，培养干细胞，并使干细胞根据上述过程生长，提取了有效因子。

实施例12

在100重量份的达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(dmem，dulbecco’smodifiedeaglemedium)中混合50重量份的表1所示的本发明的添加剂组合物的培养基中，培养干细胞，并使干细胞根据上述过程生长，提取了有效因子。

表1

然后，说明对基于本发明的细胞培养用培养基组合物的细胞进行培养后，比较所获取的细胞量的实验结果。

表2

如表2所示，实施例2至实施例12的结果可知细胞的获取量高。只是，在实施例2的情况下，与投入血清的实施例1近似，实施例11及实施例12的增加率相对低，从而可确认获取效率降低。

然后，说明对基于本发明的细胞培养用培养基组合物的细胞进行培养后对所获取的细胞进行破碎后，比较有效成分的检测量的实验结果。尤其，对与实施例1相比添加剂组合物的追加量相同的实施例6进行了比较。

表3

如表3所示，可确认实施例6的结果中细胞的有效成分的检测量高。并且，在与实施例1相比，获取量类似或大的实施例3至实施例10的情况下，可预计与实施例1及比较例1相比，检测量高。

以下，详细说明对干细胞破碎提取物作用于软骨细胞来具有抗关节炎及软骨再生效果进行确认的试验。

1-1.关节软骨细胞的分离及培养

试验前，对wistar大鼠(wistarrat)类雌性白鼠的软骨进行采样，来在包含10％的胎牛血清(fbs)的达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(dmem)中培养后，利用作为软骨细胞的特定标记的cd44确认为软骨细胞。(培养条件(37°5％co²)

1-2.结果

利用作为软骨细胞的特定标记的cd44确认为软骨细胞。

2-1.细胞毒性及no生成抑制效果

1)对软骨细胞按浓度处理干细胞破碎成分提取物，来培养24小时，并测定细胞生存率，来确认了与物质的细胞相关的毒性。

2)通过对软骨细胞处理处理白细胞介素-1α(il-1α)来引起炎症。

3)对引起炎症的软骨细胞按浓度处理干细胞破碎成分提取物，来确认作为炎症介质因子的no生成抑制.(*no；一氧化氮(nitricoxide))

2-2.结果

1)按浓度进行处理，来测定细胞生存率，结果在20ng为止的浓度中未呈现细胞毒性(浓度0ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml)

2)在处理作为炎症诱导物质的白细胞介素-1α的细胞中确认了no增加。对诱导炎症的软骨细胞处理干细胞破碎成分提取物，结果在20ng/ml的浓度下，确认了约30％的炎症抑制反应(未诱导浓度炎症的细胞、诱导炎症的细胞5ng、10ng、20ng)。

3-1.诱导型一氧化氮合酶、环氧化酶-2及核因子kb表达变化

1)通过对处理白细胞介素-1α(il-1α)的软骨细胞适用作为阳性对照组的卡洛芬(carprofen，非甾体物质)和干细胞破碎成分提取物，来确认no生成和环氧化酶-2(cox-2)、核因子-kb(nf-kb)表达的关联性。

no：发生炎症时增加的数值

环氧化酶-2(cox-2)：一种蛋白质，由炎症因子活性增加且随着炎症消失减少的物质

2)确认了对引起炎症的软骨细胞的干细胞破碎成分提取物的处理，对核因子-κb(nf-κb)的表达产生的影响。

3-2.结果

1)对通过处理白细胞介素-1α(il-1α)诱导的软骨细胞处理干细胞破碎成分提取物的结果

意味着通过处理白细胞介素-1α(il-1α)诱导的no的生成抑制效果与诱导型一氧化氮合酶(inos)和环氧化酶-2(cox-2)的表达抑制建立关联。

2)确认了处理干细胞破碎成分提取物的软骨细胞通过抑制基于白细胞介素-1α(il-1α)的核因子-κb蛋白向核内移动，来可阻隔核因子-κb途径(nf-κbpathway)。

4.对imapks活性产生的影响

1)通过对由白细胞介素-1α(il-1α)发生炎症的软骨细胞处理干细胞破碎成分提取物，来确认imapks活性。

1)抗炎症机制的确认

意味着干细胞破碎成分提取物的抗炎症功效通过p38mapk信号传导抑制实现。

5-1.参与软骨形成及发达的因子的定量聚合酶链式反应(qpcr)测定

1)通过遗传学表达确认本干细胞成分提取物的抗炎症效果。

2)通过参与软骨形成发达的sox-9基因确认软骨形成。

5-2.结果

1)基质金属蛋白酶(mmps)作为参与软骨组织的异化作用的主要蛋白质，确认了当处理il-1α(炎症诱发物质)时，基质金属蛋白酶-13(mmp-13)的基因表达大大地增加，但是当处理干细胞破碎成分提取物时，表达减少。

2)确认了参与软骨形成及发达的sox-9的基因也根据干细胞破碎成分提取物的按浓度的处理基因表达增加。

以下，对确认干细胞破碎提取物的抗炎症作用效果的试验进行详细说明。

1-1.细胞毒性评价

1)对小鼠巨噬细胞(raw246.7)将干细胞破碎提取物(t-stem)以从0.1μg/ml至3μg/ml的浓度处理了24小时。

2)同时处理干细胞破碎提取物和脂多糖。

1-2.结果

1)如图10所示，以独立的方式按浓度处理干细胞破碎提取物，结果，在统计上未呈现显著的细胞毒性。

2)如图11所示，与作为小鼠巨噬细胞的炎症反应诱发物质的1μg/ml的脂多糖(lipopolysaccharide，lps)一同处理干细胞破碎提取物，结果未呈现细胞毒性。

2-1.细胞形态变化

对小鼠巨噬细胞(raw246.7)将2μg/ml的干细胞破碎提取物处理24小时后，确认了细胞形态的变化。

2-2.结果

确认了与对照组的组相比，在处理作为炎症诱发因子的1μg/ml的脂多糖的组中，巨噬细胞的活性化比较增加。

如图12所示，与独立处理1μg/ml的脂多糖的组相比，在一同处理1μg/ml的干细胞破碎提取物和脂多糖的细胞中巨噬细胞的活性化发生得较少。

3-1.氧化氮

对预处理作为生成炎症诱发因子的1μg/ml的脂多糖的小鼠巨噬细胞(raw246.7)将干细胞破碎提取物以从0.4μg/ml至2μg/ml的浓度处理24小时后，通过格里斯分析(griessassay)确认了细胞的氧化氮浓度。

3-2.结果

通过脂多糖刺激氧化氮的生成增加。

如图13所示，确认了与仅处理脂多糖的组相比，在一同处理脂多糖和干细胞破碎提取物的氧化氮的浓度呈现显著的减少。

4-1.诱导型一氧化氮合酶(inos)及环氧化酶-2(cox-2)蛋白表达变化

对预处理作为炎症诱发因子的1μg/ml的脂多糖(lps)的小鼠巨噬细胞(raw246.7)，将作为试验物质的干细胞破碎提取物以1μg/ml和2μg/ml的浓度处理24小时后，通过免疫印迹(westernblot)分析确认了酶诱导型一氧化氮合酶(inos)和环氧化酶-2(cox-2)蛋白表达。

4-2.结果

如图14所示，确认了与仅处理脂多糖(lps)的组相比，在一同处理试验物质t-stem的组中，浓度依赖性地诱导型一氧化氮合酶和环氧化酶-2蛋白的表达减少。

5-1.炎性细胞因子的生成

对预处理作为炎症诱发因子的1μg/ml的脂多糖的小鼠巨噬细胞(raw246.7)，将干细胞破碎提取物以1μg/ml和2μg/ml的浓度处理24小时后，通过酶联免疫吸附测定(elisa)分析确认了炎性细胞因子的生成(肿瘤坏死因子α(tnfα)、白细胞介素-1β(il-1β))。

5-2.结果

通过脂多糖的刺激确认了炎性细胞因子的生成量增加。

如图15及图16所示，通过处理试验物质干细胞破碎提取物，来观察了炎性细胞因子的减少。

本发明的干细胞破碎提取物的有效成分的功效如下。

首先、确认了人痴呆的原因为因β淀粉样蛋白毒性蛋白和tau蛋白的变性发生，当将来源于脐带血的间充质干细胞反复移植于阿尔茨海默氏症生鼠的两侧海马时，使记忆力提高、大脑内的β淀粉样蛋白的量减少，并且在生鼠的脑组织中作为生成β淀粉样蛋白的酶的β–分泌酶(β-secretase1)的量减少，抑制小胶质细胞的炎性细胞因子的分泌，并且抗炎症细胞因子的分泌增加。因上述结果tau蛋白的过磷酸化也被抑制。

因此，因为具有间充质干细胞抑制阿尔茨海默氏症的进行，并且减少成为痴呆的原因的β淀粉样蛋白毒性蛋白的量的结果，从而干细胞破碎成分提取物(去壳干细胞)作为密集有去除免疫排斥反应的干细胞有效成分的物质，可适用于痴呆症的治疗。并且，通过本发明提高细胞收率、有效成分的收率，因而，可用作与使用现有干细胞本身相比，危险性小且效果优秀的治疗剂。

并且，牙龈病为因牙根和牙龈的骨头、牙龈等中产生炎症而发病，本发明的干细胞的破碎提取物有助于干细胞可使牙龈、牙槽骨再生。

即，干细胞生长因子有助于炎症抑制、骨头、软骨、牙龈细胞再生、伤口治愈再生促进，因而可用作牙龈治疗剂。尤其，预胶原蛋白、如网状的胶原蛋白网使细胞和细胞坚硬地相粘结，并提供有助于生成细胞，血管、骨头、关节等人体的很多部分起到完整的功能的环境，因而可用作牙龈病治疗剂。并且，通过本发明提高细胞收率、有效成分的收率，因而与使用现有干细胞本身相比，危险性少且可用作效果优秀的治疗剂。

并且，关节及关节周围炎为因老化、负伤等关节周围炎症发生，本发明的干细胞破碎提取物有助于炎症抑制、骨头、软骨、牙龈细胞再生、伤口治愈再生促进，因而可用作牙龈治疗剂。预胶原蛋白、如网状的胶原蛋白网使细胞和细胞坚硬地相粘结，并提供有助于生成细胞，血管、骨头、关节等人体的很多部分起到完整的功能的环境，因而可用作关节炎及关节周围炎的治疗剂。并且，通过本发明提高细胞收率、有效成分的收率，因而与使用现有干细胞本身相比，危险性少且可用作效果优秀的治疗剂。

并且，脱毛的原因为环境因素、遗传因素等多种，本发明的干细胞破碎提取物中血管内皮生长因子有助于毛囊生长，并通过刺激角质细胞生长因子及毛根，来有助于增强毛发，因而可用作脱毛的治疗剂。并且，通过本发明提高细胞收率、有效成分的收率，因而与使用现有干细胞本身相比，危险性少且可用作效果优秀的治疗剂。

并且，皮肤老化的原因为环境因素、遗传因素等多种，作为本发明的干细胞破碎提取物中的角质细胞生长因子通过细胞生成(胶原蛋白)功能有助于皱纹防止、恢复、皮肤保护、保持年轻的皮肤及紫外线(uv)刺激，如网状的胶原蛋白网使细胞和细胞相互坚固的粘结，从而有助于皮肤弹力，因而可用作皮肤治疗剂。并且，通过本发明提高细胞收率、有效成分的收率，因而与使用现有干细胞本身相比，危险性少且可用作效果优秀的治疗剂。

如上所述，本发明所属技术领域的普通技术人员能够理解上述的本发明的技术结构可以在不变更本发明的技术思想或必要特征的情况下，以其他不同的具体形态来实施。

因此，要理解的是，以上所述的实施例在所有方面均为例示，并非限定，应解释为本发明的范围通过后述的发明要求保护范围来示出，而不是上述的详细说明，其发明要求保护范围的意义及范围以及从其等价概念导出的所有变更或所变形的形态包括在本发明的范围。