本发明涉及生物制药疫苗生产领域，具体是一种用于bhk-21细胞培养及相应病毒生产的低血清培养基。
背景技术：
bhk细胞是指幼年叙利亚地鼠肾细胞(babyhamstersyriankidney)，1961年建株。原始的细胞株是成纤维细胞，贴壁依赖性。1963年获得单细胞克隆细胞。后经无数次传代后细胞可悬浮生长，它广泛用于增殖各种病毒，生产兽用疫苗。
传统bhk-21细胞培养方式为dmem高糖培养基添加8％小牛血清培养细胞，血清用量大，成本高；传统方式生产伪狂犬疫苗半成品滴度在7.0-8.0之间，且在冷冻条件下毒价下降较快，保存时间短，较难获得符合配苗标准的半成品。
市场上有一些低血清细胞培养产品，虽解决了血清用量问题，但是仍未解决伪狂犬疫苗半成品毒价下降快的问题，基于此，我们提出一种用于bhk-21细胞培养及相应病毒生产的低血清培养基。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种用于bhk-21细胞培养及相应病毒生产的低血清培养基，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种用于bhk-21细胞培养及相应病毒生产的低血清培养基，包括以下组成成分：氨基酸、维生素、无机盐类、蛋白质、微量元素和辅助成分；所述氨基酸包括甘氨酸10-50mg/l、l-丙氨酸5-15mg/l、l-精氨酸盐酸盐50-150mg/l、l-天冬酰胺250-350mg/l、l-天冬氨酸10-15mg/l、l-胱氨酸二盐酸50-120mg/l、半胱氨酸45-110mg/l、l-谷氨酸100-200mg/l、l-谷氨酰胺200-400mg/l、l-组氨酸盐酸一水合物20-50mg/l、l-异亮氨酸50-120mg/l、l-亮氨酸50-120mg/l、l-赖氨酸盐酸盐100-200mg/l、l-甲硫氨酸20-50mg/l、l-苯丙氨酸50-100mg/l、l-脯氨酸5-15mg/l、l-丝氨酸100-200mg/l、l-苏氨酸50-120mg/l、l-色氨酸10-20mg/l、l-酪氨酸二钠二水合物50-120mg/l、l-缬氨酸50-120mg/l；所述蛋白质包括4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes)1000-1500mg/l、一水磷酸二氢钠50-150mg/l、乳蛋白水解物50-600mg/l、牛血清白蛋白100-600mg/l、牛转铁蛋白5-15mg/l、重组人胰岛素5-15mg/l。
作为本发明进一步的方案：所述辅助成分包括d-葡萄糖2000-5000mg/l、乙醇胺0.5-3mg/l、还原型谷胱甘肽0.5-3mg/l、苯酚红5-15mg/l、丙酮酸钠50-150mg/l、胸苷0.1-0.5mg/l、腺嘌呤0.1-0.5mg/l、次黄嘌呤钠1-5mg/l、亚油酸0.02-0.1mg/l、硫辛酸0.05-0.15mg/l、腐胺二盐酸0.05-0.15mg/l。
作为本发明再进一步的方案：所述微量元素包括偏钒酸铵0.0001-0.0005mg/l、五水硫酸铜0.0005-0.0015mg/l、二氯化锰0.00001-0.00006mg/l、亚硒酸钠0.002-0.006mg/l。
作为本发明再进一步的方案：所述维生素包括抗坏血酸磷酸酯1-3mg/l、氯化胆碱2-5mg/l、d-泛酸钙2-5mg/l、叶酸2-5mg/l、烟酰胺2-5mg/l、盐酸吡哆素2-5mg/l、核黄素0.1-1mg/l、盐酸硫胺素2-5mg/l、肌醇5-10mg/l、生物素0.01-0.04mg/l、b12维生素2-5mg/l。
作为本发明再进一步的方案：所述无机盐类包括无水氯化钙100-300mg/l、九水硝酸铁0.05-0.2mg/l、无水硫酸镁50-100mg/l、氯化钾300-500mg/l、氯化钠4000-6000mg/l。
作为本发明再进一步的方案：包括以下组成成分：甘氨酸37.5mg/l、l-丙氨酸8.9mg/l、l-精氨酸盐酸盐84mg/l、l-天冬酰胺256.8mg/l、l-天冬氨酸13.3mg/l、l-胱氨酸二盐酸63mg/l、半胱氨酸99mg/l、l-谷氨酸195.3mg/l、l-谷氨酰胺398.8mg/l、l-组氨酸盐酸一水合物42mg/l、l-异亮氨酸105mg/l、l-亮氨酸105mg/l、l-赖氨酸盐酸盐146mg/l、l-甲硫氨酸30mg/l、l-苯丙氨酸66mg/l、l-脯氨酸11.5mg/l、l-丝氨酸167.5mg/l、l-苏氨酸95mg/l、l-色氨酸16mg/l、l-酪氨酸二钠二水合物104mg/l、l-缬氨酸94mg/l、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes)1287mg/l、一水磷酸二氢钠125mg/l、乳蛋白水解物400mg/l、牛血清白蛋白200mg/l、牛转铁蛋白7.5mg/l、重组人胰岛素12.5mg/l、偏钒酸铵3.00e-04mg/l、五水硫酸铜0.00125mg/l、二氯化锰5.00e-05mg/l、亚硒酸钠0.005mg/l、d-葡萄糖4500mg/l、乙醇胺1.9mg/l、还原型谷胱甘肽2mg/l、苯酚红8.1mg/l、丙酮酸钠110mg/l、胸苷0.365mg/l、腺嘌呤0.365mg/l、次黄嘌呤钠2.39mg/l、亚油酸0.042mg/l、硫辛酸0.105mg/l、腐胺二盐酸0.081mg/l、抗坏血酸磷酸酯2.5mg/l、氯化胆碱4mg/l、d-泛酸钙4mg/l、叶酸4mg/l、烟酰胺4mg/l、盐酸吡哆素4mg/l、核黄素0.4mg/l、盐酸硫胺素4mg/l、肌醇7.2mg/l、生物素0.035mg/l、b12维生素2.72mg/l、无水氯化钙200mg/l、九水硝酸铁0.1mg/l、无水硫酸镁97.67mg/l、氯化钾400mg/l、氯化钠5000mg/l。
作为本发明再进一步的方案：所述d-葡萄糖为无水葡萄糖
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明制备的用于bhk-21细胞培养及相应病毒生产的低血清培养基在用于bhk-21细胞生产伪狂犬疫苗维持阶段不再需要添加血清，进一步降低血清用量，仍可保持细胞良好的生长状态，提高病毒滴度，半成品毒价降低幅度小，延长半成品保存时间；同时用于bhk-21细胞培养及相应病毒生产的低血清培养基具有细胞生长快、酸碱度稳定、适应于低密度培养等特点，以及在实际生产应用中能够降低成本、提升效率、保证生产质量稳定可持续且能够满足大规模prv生产需要。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
实施例1
一种用于bhk-21细胞培养及相应病毒生产的低血清培养基，包括以下组成成分：甘氨酸37.5mg/l、l-丙氨酸8.9mg/l、l-精氨酸盐酸盐84mg/l、l-天冬酰胺256.8mg/l、l-天冬氨酸13.3mg/l、l-胱氨酸二盐酸63mg/l、半胱氨酸99mg/l、l-谷氨酸195.3mg/l、l-谷氨酰胺398.8mg/l、l-组氨酸盐酸一水合物42mg/l、l-异亮氨酸105mg/l、l-亮氨酸105mg/l、l-赖氨酸盐酸盐146mg/l、l-甲硫氨酸30mg/l、l-苯丙氨酸66mg/l、l-脯氨酸11.5mg/l、l-丝氨酸167.5mg/l、l-苏氨酸95mg/l、l-色氨酸16mg/l、l-酪氨酸二钠二水合物104mg/l、l-缬氨酸94mg/l、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes)1287mg/l、一水磷酸二氢钠125mg/l、乳蛋白水解物400mg/l、牛血清白蛋白200mg/l、牛转铁蛋白7.5mg/l、重组人胰岛素12.5mg/l、偏钒酸铵3.00e-04mg/l、五水硫酸铜0.00125mg/l、二氯化锰5.00e-05mg/l、亚硒酸钠0.005mg/l、d-葡萄糖4500mg/l、乙醇胺1.9mg/l、还原型谷胱甘肽2mg/l、苯酚红8.1mg/l、丙酮酸钠110mg/l、胸苷0.365mg/l、腺嘌呤0.365mg/l、次黄嘌呤钠2.39mg/l、亚油酸0.042mg/l、硫辛酸0.105mg/l、腐胺二盐酸0.081mg/l、抗坏血酸磷酸酯2.5mg/l、氯化胆碱4mg/l、d-泛酸钙4mg/l、叶酸4mg/l、烟酰胺4mg/l、盐酸吡哆素4mg/l、核黄素0.4mg/l、盐酸硫胺素4mg/l、肌醇7.2mg/l、生物素0.035mg/l、b12维生素2.72mg/l、无水氯化钙200mg/l、九水硝酸铁0.1mg/l、无水硫酸镁97.67mg/l、氯化钾400mg/l、氯化钠5000mg/l。
其中，d-葡萄糖为无水葡萄糖。
实施例2
一种用于bhk-21细胞培养及相应病毒生产的低血清培养基，包括以下组成成分：甘氨酸10mg/l、l-丙氨酸5mg/l、l-精氨酸盐酸盐50mg/l、l-天冬酰胺250mg/l、l-天冬氨酸10mg/l、l-胱氨酸二盐酸50mg/l、半胱氨酸45mg/l、l-谷氨酸100mg/l、l-谷氨酰胺200mg/l、l-组氨酸盐酸一水合物20mg/l、l-异亮氨酸50mg/l、l-亮氨酸50mg/l、l-赖氨酸盐酸盐100mg/l、l-甲硫氨酸20mg/l、l-苯丙氨酸50mg/l、l-脯氨酸5mg/l、l-丝氨酸100mg/l、l-苏氨酸50mg/l、l-色氨酸10mg/l、l-酪氨酸二钠二水合物50mg/l、l-缬氨酸50mg/l、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes)1000mg/l、一水磷酸二氢钠50mg/l、乳蛋白水解物50mg/l、牛血清白蛋白100mg/l、牛转铁蛋白5mg/l、重组人胰岛素5mg/l、偏钒酸铵0.0001mg/l、五水硫酸铜0.0005mg/l、二氯化锰0.00001mg/l、亚硒酸钠0.002mg/l、d-葡萄糖2000mg/l、乙醇胺0.5mg/l、还原型谷胱甘肽0.5mg/l、苯酚红5mg/l、丙酮酸钠50mg/l、胸苷0.1mg/l、腺嘌呤0.1mg/l、次黄嘌呤钠1mg/l、亚油酸0.02mg/l、硫辛酸0.105mg/l、腐胺二盐酸0.05mg/l、抗坏血酸磷酸酯1mg/l、氯化胆碱2mg/l、d-泛酸钙2mg/l、叶酸2mg/l、烟酰胺2mg/l、盐酸吡哆素2mg/l、核黄素0.1mg/l、盐酸硫胺素2mg/l、肌醇5mg/l、生物素0.01mg/l、b12维生素2mg/l、无水氯化钙100mg/l、九水硝酸铁0.05mg/l、无水硫酸镁50mg/l、氯化钾300mg/l、氯化钠4000mg/l。
其中，d-葡萄糖为无水葡萄糖。
实施例3
一种用于bhk-21细胞培养及相应病毒生产的低血清培养基，包括以下组成成分：甘氨酸50mg/l、l-丙氨酸15mg/l、l-精氨酸盐酸盐150mg/l、l-天冬酰胺350mg/l、l-天冬氨酸15mg/l、l-胱氨酸二盐酸120mg/l、半胱氨酸110mg/l、l-谷氨酸200mg/l、l-谷氨酰胺400mg/l、l-组氨酸盐酸一水合物50mg/l、l-异亮氨酸120mg/l、l-亮氨酸120mg/l、l-赖氨酸盐酸盐200mg/l、l-甲硫氨酸50mg/l、l-苯丙氨酸100mg/l、l-脯氨酸15mg/l、l-丝氨酸200mg/l、l-苏氨酸120mg/l、l-色氨酸20mg/l、l-酪氨酸二钠二水合物120mg/l、l-缬氨酸120mg/l、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes)1500mg/l、一水磷酸二氢钠150mg/l、乳蛋白水解物600mg/l、牛血清白蛋白600mg/l、牛转铁蛋白15mg/l、重组人胰岛素15mg/l、偏钒酸铵0.0005mg/l、五水硫酸铜0.0015mg/l、二氯化锰0.00006mg/l、亚硒酸钠0.006mg/l、d-葡萄糖5000mg/l、乙醇胺3mg/l、还原型谷胱甘肽3mg/l、苯酚红15mg/l、丙酮酸钠150mg/l、胸苷0.5mg/l、腺嘌呤0.5mg/l、次黄嘌呤钠5mg/l、亚油酸0.1mg/l、硫辛酸0.15mg/l、腐胺二盐酸0.15mg/l、抗坏血酸磷酸酯3mg/l、氯化胆碱5mg/l、d-泛酸钙5mg/l、叶酸5mg/l、烟酰胺5mg/l、盐酸吡哆素5mg/l、核黄素1mg/l、盐酸硫胺素5mg/l、肌醇10mg/l、生物素0.04mg/l、b12维生素5mg/l、无水氯化钙300mg/l、九水硝酸铁0.2mg/l、无水硫酸镁100mg/l、氯化钾500mg/l、氯化钠6000mg/l。
其中，d-葡萄糖为无水葡萄糖。
实施例4
一种用于bhk-21细胞培养及相应病毒生产的低血清培养基，包括以下组成成分：甘氨酸10mg/l、l-丙氨酸5mg/l、l-精氨酸盐酸盐50mg/l、l-天冬酰胺250mg/l、l-天冬氨酸10mg/l、l-胱氨酸二盐酸50mg/l、半胱氨酸45mg/l、l-谷氨酸100mg/l、l-谷氨酰胺200mg/l、l-组氨酸盐酸一水合物20mg/l、l-异亮氨酸50mg/l、l-亮氨酸50mg/l、l-赖氨酸盐酸盐100mg/l、l-甲硫氨酸20mg/l、l-苯丙氨酸50mg/l、l-脯氨酸5mg/l、l-丝氨酸100mg/l、l-苏氨酸50mg/l、l-色氨酸10mg/l、l-酪氨酸二钠二水合物50mg/l、l-缬氨酸50mg/l、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes)1000mg/l、一水磷酸二氢钠50mg/l、乳蛋白水解物50mg/l、牛血清白蛋白100mg/l、牛转铁蛋白5mg/l、重组人胰岛素5mg/l、偏钒酸铵3.00e-04mg/l、五水硫酸铜0.00125mg/l、二氯化锰5.00e-05mg/l、亚硒酸钠0.005mg/l、d-葡萄糖4500mg/l、乙醇胺1.9mg/l、还原型谷胱甘肽2mg/l、苯酚红8.1mg/l、丙酮酸钠110mg/l、胸苷0.365mg/l、腺嘌呤0.365mg/l、次黄嘌呤钠2.39mg/l、亚油酸0.042mg/l、硫辛酸0.105mg/l、腐胺二盐酸0.081mg/l、抗坏血酸磷酸酯2.5mg/l、氯化胆碱4mg/l、d-泛酸钙4mg/l、叶酸4mg/l、烟酰胺4mg/l、盐酸吡哆素4mg/l、核黄素0.4mg/l、盐酸硫胺素4mg/l、肌醇7.2mg/l、生物素0.035mg/l、b12维生素2.72mg/l、无水氯化钙200mg/l、九水硝酸铁0.1mg/l、无水硫酸镁97.67mg/l、氯化钾400mg/l、氯化钠5000mg/l。
其中，d-葡萄糖为无水葡萄糖。
实施例5
一种用于bhk-21细胞培养及相应病毒生产的低血清培养基，包括以下组成成分：甘氨酸50mg/l、l-丙氨酸15mg/l、l-精氨酸盐酸盐150mg/l、l-天冬酰胺350mg/l、l-天冬氨酸15mg/l、l-胱氨酸二盐酸120mg/l、半胱氨酸110mg/l、l-谷氨酸200mg/l、l-谷氨酰胺400mg/l、l-组氨酸盐酸一水合物50mg/l、l-异亮氨酸120mg/l、l-亮氨酸120mg/l、l-赖氨酸盐酸盐200mg/l、l-甲硫氨酸50mg/l、l-苯丙氨酸100mg/l、l-脯氨酸15mg/l、l-丝氨酸200mg/l、l-苏氨酸120mg/l、l-色氨酸20mg/l、l-酪氨酸二钠二水合物120mg/l、l-缬氨酸120mg/l、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes)1000mg/l、一水磷酸二氢钠50mg/l、乳蛋白水解物50mg/l、牛血清白蛋白100mg/l、牛转铁蛋白5mg/l、重组人胰岛素5mg/l、偏钒酸铵0.0001mg/l、五水硫酸铜0.0005mg/l、二氯化锰0.00001mg/l、亚硒酸钠0.002mg/l、d-葡萄糖2000mg/l、乙醇胺0.5mg/l、还原型谷胱甘肽0.5mg/l、苯酚红5mg/l、丙酮酸钠50mg/l、胸苷0.1mg/l、腺嘌呤0.1mg/l、次黄嘌呤钠1mg/l、亚油酸0.02mg/l、硫辛酸0.105mg/l、腐胺二盐酸0.05mg/l、抗坏血酸磷酸酯1mg/l、氯化胆碱2mg/l、d-泛酸钙2mg/l、叶酸2mg/l、烟酰胺2mg/l、盐酸吡哆素2mg/l、核黄素0.1mg/l、盐酸硫胺素2mg/l、肌醇5mg/l、生物素0.01mg/l、b12维生素2mg/l、无水氯化钙100mg/l、九水硝酸铁0.05mg/l、无水硫酸镁50mg/l、氯化钾300mg/l、氯化钠4000mg/l。
其中，d-葡萄糖为无水葡萄糖。
bhk-21细胞增殖prv中试实验
实验步骤如下：
1)用生长液培养传代已驯化的低血清适应细胞株bhk-lsa细胞单层，每转瓶接种2.5×108cells；
2)每转瓶添加bhk-slm+2％血清生长液约300m；
3)37℃温室以12转/小时旋转培养72h；
4)取已增殖良好的bhk-lsa细胞，弃去生长液，按适当体积比接入伪狂犬病毒，37℃吸附60分钟。吸附完成后补足300ml维持液，再置于温室培养24-36h，当细胞病变达80％以上时收获病毒。毒种质量优良时，可在24h内收获；
5)病毒收获后，冻融1次；将各瓶病毒混合后取样待检。
实验结果
根据中试实验所用金周生物bhk-21低血清培养基在转瓶传代后增殖prv病毒，维持阶段不需添加血清、收获时间短，且三批次毒价均超出预估范围的实验结果表明：用于bhk-21细胞培养及相应病毒生产的低血清培养基具有细胞生长快、酸碱度稳定、适应于低密度培养等特点，同时说明在实际生产应用中能够降低成本、提升效率、保证生产质量稳定可持续且能够满足大规模prv生产需要。
本发明制备的用于bhk-21细胞培养及相应病毒生产的低血清培养基在用于bhk-21细胞生产伪狂犬疫苗维持阶段不再需要添加血清，进一步降低血清用量，仍可保持细胞良好的生长状态，提高病毒滴度，半成品毒价降低幅度小，延长半成品保存时间。
上面对本发明的较佳实施方式作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。