HOXB8基因的定量检测在结直肠癌预后判断中的应用的制作方法

本发明涉及分子生物学、临床预后判断领域，尤其涉及hoxb8基因的定量检测试剂在制备结直肠癌预后判断试剂盒中的应用。

背景技术

结直肠癌是最常见的恶性肿瘤之一，在世界范围内，疾病发生率在男性中排名第三位，死亡率第四位，在女性疾病发病率中排名第二位，死亡率达第三位。近年来，我国结直肠癌的发病率呈逐年上升的趋势。目前针对结直肠癌的治疗主要以手术为主，结合放疗化疗为辅的综合治疗方法。但目前结直肠癌的预后情况很差，术后存在生存率低、耐药性高或复发转移的情况，对病人及其家人身体及经济上带来很大的负担，严重影响着人们的生活水平和质量。

在临床实践中，目前结直肠癌的预后判断以病理学检查作为最重要和最可靠的预后指标，而分子标志物被认为是结直肠癌预后判断的新发展方向。目前，国内外研究者发现包括cd29、igr5、cd44和β-catenin等基因在结直肠癌组织中存在异常表达的情况，对这些关键分子标志在患者中的表达量测量有望成为新的结直肠癌的预后判断方式。尽管如此，这些标志物的特异性和灵敏度仍有待改善，严重影响其在结直肠癌预后判断中的效能，因此仍未进入临床应用阶段。鉴于此，更加特异的结直肠癌预后判断分子标志物仍有待开发。

hoxb8(homeoboxb8)基因位于人类染色体17q21.32区段，编码一个具有保守同源结构域的转录因子，在胚胎发育过程中的形态形成中起重要作用。hoxb8基因的表达在结直肠癌组织中异常升高，但是目前对于hoxb8基因作为潜在结直肠癌预后判断标志物的研究及检测技术方法仍是空白。

因此，现有技术还有待于改进和发展。

技术实现要素：

鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供hoxb8基因的定量检测试剂在制备结直肠癌预后判断试剂盒中的应用，旨在解决现有技术中结直肠癌预后标志物匮乏及特异性较低等的问题。

本发明提供hoxb8基因的定量检测试剂在制备结直肠癌预后判断试剂盒中的应用。

优选地，采用荧光定量pcr方法对组织样本中的hoxb8基因进行定量检测，确定组织样本中hoxb8基因的表达水平情况。具体包括：对组织样本进行荧光定量pcr检测，检测组织样本中的δct值，根据检测到的组织样本的δct值确定组织样本中hoxb8基因的表达水平情况。

本发明中，根据检测到的组织样本的δct值确定组织样本中hoxb8基因的表达水平情况的确定方法为：当检测到组织样本的δct值≥-10.68时，判断hoxb8基因为高表达；反之，当检测到组织样本的δct值<-10.68时，判断hoxb8基因为低表达。

本发明中，所述结直肠癌预后判断的方法：所述hoxb8基因为高表达时，表明结直肠癌患者术后生存期短；所述hoxb8基因为低表达时，表明结直肠癌患者术后生存期长。

本发明中，检测方法包括如下步骤：

(1)、取结直肠癌组织样本，提取组织样本的总rna；

(2)、对组织样本的总rna进行逆转录，得到组织样本的cdna；

(3)、以获得的组织样本的cdna为模板，采用设计的hoxb8基因的引物，进行荧光定量pcr检测，得到hoxb8基因的ct值(cyclethreshold)；

其中hoxb8基因的引物如下：

hoxb8-f:5’-gtccctgcgccccaattatta-3’；

hoxb8-r：5’-gcccgtggtagaactcctg-3’；

其中，所述荧光定量pcr检测的条件：95℃、3分钟，1个循环；95℃、15秒，60℃、30秒，72℃、30秒(荧光扩增数据采集阶段)，40个循环。

以获得的组织样本的cdna为模板，采用设计的gapdh基因的引物，进行荧光定量pcr检测，得到gapdh基因的ct值；

其中gapdh基因的引物如下：

gapdh-f：5’-gacaagcttcccgttctcag-3’；

gapdh-r2：5’-gagtcaacggatttggtcgt-3’；

其中，所述荧光定量pcr检测的条件：95℃、3分钟，1个循环；95℃、15秒，60℃、30秒，72℃、30秒(荧光扩增数据采集阶段)，40个循环；

(4)、根据组织样本的hoxb8基因的ct值和gapdh基因的ct值，得到组织样本的δct值，根据所述组织样本的δct值确定组织样本中hoxb8基因的表达水平情况。荧光定量pcr完成后将能够获得组织样本的hoxb8基因及内参gapdh基因的ct值。ct(cyclethreshold)值是荧光定量pcr扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值时的所对应的扩增循环数。组织样本的内参基因gapdh的ct值减去该样本hoxb8基因的ct值，得到的数值即命名为该组织样本的△ct值。△ct值即代表了hoxb8基因在该组织样本中的相对表达水平，△ct值越大代表hoxb8基因的表达量越高。

因此根据检测到的组织样本的δct值即可确定组织样本中hoxb8基因的表达水平情况。当检测到的组织样本的δct值≥-10.68时，判断hoxb8基因为高表达，表明结肠癌患者术后生存期短；当检测到的组织样本的δct值<-10.68时，判断hoxb8基因为低表达，表明结肠癌患者术后生存期长。

有益效果：本发明hoxb8基因的表达水平在结直肠癌病人的预后判断中有应用价值：当hoxb8基因为高表达，表明结直肠癌患者术后生存期短；反之，当hoxb8基因为低表达，表明结直肠癌患者术后生存期长。

附图说明

图1为hoxb8基因表达水平与结直肠癌病人预后生存率的关系图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下结合具体实施例对hoxb8基因的定量检测试剂在制备结直肠癌预后判断试剂盒中的应用作进一步说明。

一、检测方法：

1、原位结直肠癌组织中总rna的提取

1)原位结直肠癌组织样品用液氮充分研磨并放入1.5ml无rna酶离心管中，加入1ml总rna提取试剂trizol溶液(takara，#9109)，反复吹打使细胞完全脱离皿壁，并吸至1.5ml无rna酶离心管中，吹打混匀使细胞充分裂解，室温静置5分钟。

2)加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀15秒，使水相和有机相充分接触，室温静置10min。

3)4℃，12000rpm离心15分钟，可见分为三层，rna在上层水相，移至另一个新的rnasefreeep管(枪头应沿着液面上层吸取上清，枪头不可碰到、吸到中间层)。

4)加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀(颠倒6-8次)，室温静置10分钟。

5)4℃，12000rpm离心10分钟，弃去上清。

6)加入1ml75％乙醇轻轻颠倒清洗沉淀，4℃，7500rpm离心5分钟，弃上清，超净台风干。

7)加入适量无rna酶(rnase-free)水(invitrogen，#10977015)(至少15ul)溶解沉淀。

2、总rna浓度和纯度检测

用核酸蛋白检测仪(biotekepoch2)测定rna浓度(一般应大于100ng/ul)和纯度(od260/od280的比值在1.8-2.0之间，说明制备的rna较纯，无蛋白质污染，可用于后续反应检测)。

3、逆转录

从组织中提取出总rna后，使用逆转录试剂盒(dbi，#2220)将rna逆转录成为双链cdna。具体步骤如下：

1)rna在65℃下处理5分钟变性后，立即放于冰上冷却。

2)按照以下配方配制逆转录反应体系：

配制完成后轻柔混匀，快速离心之后按照如下pcr程序进行逆转录：

pcr程序：1、37℃，15分钟

2、98℃，5分钟

3、4℃，2小时

逆转录完成得到的cdna样品可以直接用于以下荧光定量pcr检测，或者储存于负八十度备用。

4、荧光定量pcr检测

1)针对人源hoxb8基因mrna序列(nm_024016.3)设计特异性的扩增引物，引物序列如下：

hoxb8-f:5’-gtccctgcgccccaattatta-3’

hoxb8-r：5’-gcccgtggtagaactcctg-3’

针对人源gapdh基因mrna序列(nm_002046.6)设计特异性的扩增引物，引物序列如下：

gapdh-f：5’-gacaagcttcccgttctcag-3’

gapdh-r2：5’-gagtcaacggatttggtcgt-3’

hoxb8基因及gapdh基因的引物的特异性扩增已在8个结肠癌细胞系中验证。

2)使用步骤3中得到的原位结直肠癌组织cdna以及如上设计的hoxb8及gapdh引物，按照以下配方配制荧光定量pcr反应体系：

配制好的反应液轻柔混匀和快速离心后，放置于荧光定量pcr仪(abi,quantstudio7)，按照如下pcr程序进行荧光定量pcr(pcr开始前选取在步骤3处收集荧光扩增数据)：

5、hoxb8基因相对表达量的计算

荧光定量pcr完成后将能够获得每个结直肠癌组织样本的hoxb8基因及内参gapdh基因的ct值。ct(cyclethreshold)值是荧光定量pcr扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值时的所对应的扩增循环数。进行基因相对表达量计算时，每个样本的内参基因gapdh的ct值减去该样本hoxb8基因的ct值，得到的数值即命名为该样本的△ct值。△ct值即代表了hoxb8基因在该样本中的相对表达水平，△ct值越大代表hoxb8基因的表达量越高。

因此根据检测到的组织样本的δct值即可确定组织样本中hoxb8基因的表达水平情况。当检测到的组织样本的δct值≥-10.68时，判断hoxb8基因为高表达，表明结肠癌患者术后生存期短；当检测到的组织样本的δct值<-10.68时，判断hoxb8基因为低表达，表明结肠癌患者术后生存期长。

二、样本信息

在80例结直肠癌病人中验证hoxb8表达水平与病人预后的关系。本实验涉及的结直肠癌病人的临床信息特征及实验获得的对应的hoxb8表达水平见表1。

表1、样本信息参照表

根据上述表1，在此80例结直肠癌病人的原位癌组织样本中检测了hoxb8基因的mrna表达水平，根据检测到的组织样本的δct值确定组织样本中hoxb8基因的表达水平情况。当检测到的组织样本的δct值≥-10.68时，判断hoxb8基因为高表达，当检测到的组织样本的δct值<-10.68时，判断hoxb8基因为低表达。进一步，使用统计产品与服务解决方案软件spss21.0进行kaplan-meier生存分析，检验hoxb8基因的表达模式与病人预后存活时间的相关性。同时，利用卡方检验(chi-squaretest)对hoxb8基因表达水平与结肠癌病人各种临床指标的相关性进行分析，以映证其作为临床标记物的重要性。

如图1所示为hoxb8基因表达水平与结直肠癌病人预后生存率的关系图，其中hoxb8基因高表达患者组(δct值≥-10.68)较hoxb8基因低表达患者组(δct值<-10.68)预后存活率高(logrankp＝0.048)。

如表2所示为hoxb8基因表达水平与结直肠癌病人各种临床指标的相关性分析结果，其中hoxb8基因的表达水平与结直肠癌病人的临床分期显著相关，特别的，hoxb8基因的高表达与病人的高进展级别分期显著相关，进一步映证其作为临床标记物的重要性。

表2、统计分析hoxb8基因表达量与结肠癌病人临床指标的关系

本发明中，hoxb8基因mrna序列(nm_024016.3)如下：

>nm_024016.3homosapienshomeoboxb8(hoxb8),mrna

ccttttctattcctggaaaccacaaaaagtgtgtcggcttcgagatcttcttcgccttttctttcttttctttttttccctcctctctttccctctcctttcctggcgagggtgactaggagccggcgaatccgcgtttttttctctctctccctccctttccccctccccaccccctccccaacagcccccaactatagcctccgccgccgccgccgcctcaaaattcaataaaatgagctcttatttcgtcaactcactgttctccaaatacaaaaccggggagtccctgcgccccaattattatgactgcggcttcgcccaggacctgggcggccgacccaccgtggtgtacggtcccagcagcggcggcagcttccagcacccgtcgcaaatccaggagttctaccacgggccgtcgtcgctgtccacggctccctaccagcagaacccgtgcgccgtggcgtgccacggggaccccggcaatttctacggctacgacccgctgcaacgccagagcctattcggtgcgcaggatccagacctggtgcagtacgcagactgcaagcttgccgccgccagcggcctgggcgaggaggccgagggctccgagcagagcccgtcgcccacacagctcttcccctggatgcgcccgcaagcagccgccggacgcaggcgaggccgacagacctacagccgctaccagaccctggagctggagaaggagttcctatttaatccctatctgactcgtaagcggcgaatcgaggtatcgcacgccctgggactgacagagagacaggtcaaaatctggttccagaaccggaggatgaagtggaaaaaagagaacaacaaagacaagttccccagcagcaaatgcgagcaggaggagctggagaaacagaagctggagcgggccccagaggcggcggacgagggcgacgcgcagaagggcgacaagaagtaggcttcagctgggactgccagggccgcggccgcccgcacgtccgcgggtcccggccgcgccgccgccgcgcgcccctgcccgagagagctctggccccgctagcggggccaggagccgggcctcccaccgcagcgtcccccgccgcgccagtccccgctagtggtagtatctcgtaatagcttctgtgtgtgagctaccgtggatctccttcccttctcttgggggccggggggaaagaaaaggatttaagcaaaggctccctcgccctgtgagggcgagcggcaaaggcccggctgagccccccatgcccctcccctccccgtgtaaaaagcctccttgtgcaattgtcttttttttcctttgaacgtgcttctttgtaatgaccaaggtaccgatttctgctaagttctcccaacaacatgaaactgcctattcacgccgtaattctttctgtctcccttctctctctctctctcgctcgctcgctctcgctctcgctctctctcgctgcgtcctcatttcccctcccaatcctctctcccctctgcaaccccccagctcgctggctttctctctggcttctctcttttcctcctccacccaccccctttggtttgacaattttgtcttaagtgtttctcaaaagaggttactttagttagcatgcgcgctgtgggcaattgttacaagtgttcttaggtttactgtgaagagaatgtattctgtatccgtgaattgctttatgggggggagggagggctaattatatattttgttgttcctctatactttgttctgttgtctgcgcctgaaaagggcggaagagttacaataaagtttacaagcgagaacccgaaaaaaaaaaaa

本发明中，gapdh基因mrna序列(nm_002046.6)如下：

>nm_002046.6homosapiensglyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase(gapdh),transcriptvariant1,mrna

gctctctgctcctcctgttcgacagtcagccgcatcttcttttgcgtcgccagccgagccacatcgctcagacaccatggggaaggtgaaggtcggagtcaacggatttggtcgtattgggcgcctggtcaccagggctgcttttaactctggtaaagtggatattgttgccatcaatgaccccttcattgacctcaactacatggtttacatgttccaatatgattccacccatggcaaattccatggcaccgtcaaggctgagaacgggaagcttgtcatcaatggaaatcccatcaccatcttccaggagcgagatccctccaaaatcaagtggggcgatgctggcgctgagtacgtcgtggagtccactggcgtcttcaccaccatggagaaggctggggctcatttgcaggggggagccaaaagggtcatcatctctgccccctctgctgatgcccccatgttcgtcatgggtgtgaaccatgagaagtatgacaacagcctcaagatcatcagcaatgcctcctgcaccaccaactgcttagcacccctggccaaggtcatccatgacaactttggtatcgtggaaggactcatgaccacagtccatgccatcactgccacccagaagactgtggatggcccctccgggaaactgtggcgtgatggccgcggggctctccagaacatcatccctgcctctactggcgctgccaaggctgtgggcaaggtcatccctgagctgaacgggaagctcactggcatggccttccgtgtccccactgccaacgtgtcagtggtggacctgacctgccgtctagaaaaacctgccaaatatgatgacatcaagaaggtggtgaagcaggcgtcggagggccccctcaagggcatcctgggctacactgagcaccaggtggtctcctctgacttcaacagcgacacccactcctccacctttgacgctggggctggcattgccctcaacgaccactttgtcaagctcatttcctggtatgacaacgaatttggctacagcaacagggtggtggacctcatggcccacatggcctccaaggagtaagacccctggaccaccagccccagcaagagcacaagaggaagagagagaccctcactgctggggagtccctgccacactcagtcccccaccacactgaatctcccctcctcacagttgccatgtagaccccttgaagaggggaggggcctagggagccgcaccttgtcatgtaccatcaataaagtaccctgtgctcaaccagttaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa

综上所述，本发明提供的hoxb8基因的定量检测试剂在制备结直肠癌预后判断试剂盒中的应用，本发明发现hoxb8基因的表达水平在结直肠癌病人的预后判断中有应用价值：通过荧光定量pcr方法检测hoxb8基因在原位结直肠癌样本中的表达水平，当检测到的组织样本的δct值≥-10.68时，判断hoxb8基因为高表达，表明结直肠癌患者术后生存期短；反之，当检测到的组织样本的δct值<-10.68时，判断hoxb8基因为低表达，表明结直肠癌患者术后生存期长。

应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

序列表

<160>0

<170>siposequencelisting1.0