本发明涉及dna提取方法，特别涉及一种从人体粪便样本中高质量菌群dna的提取方法。
背景技术
人类活动离不开微生物，人体内栖息着大量细菌。肠道微生态系统是人体最大的微生态系统，据估计大概有1014数量级的正常菌群，是人细胞数的十倍。肠道菌群不仅数量大、种类多，而且与人类健康关系密切，对菌群的研究已经成为生命健康领域的一个重要主题。自粪便dna分析技术兴起后，国内外在这方面做出了巨大的成就，发展了多种粪便dna提取方法，充分证实了粪便dna分析的可行性。但仍存在以下问题：①各种提取方法通用性不好。许多刚开始分子粪便学研究的学者根据已发表论文中提供的方法进行粪便dna提取时，往往得不到预期的效果。这一直是阻碍粪便dna提取技术推广的主要障碍。因此构建一套通用性好、性价比高的粪便dna提取方法，可以大大推进粪便dna技术的推广。②现有的操作方法过于复杂、繁琐，易被外源杂菌污染，导致提取dna的质量得不到保证。菌群研究的核心步骤始终是高质量菌群dna的提取，这也是菌群研究的首要步骤。随着人类对菌群认识的深入，相关研究也会加速推进，因此，建立一种高质量、高可靠的菌群dna提取方法显得非常迫切和必要。
技术实现要素：
本发明针对上述现有技术所存在的不足之处开展的实验研究，旨在提供一种高质量菌群dna提取方法，推进肠道菌群相关研究的进步。
本发明实现其技术目的技术方案是：一种高质量菌群dna提取方法，包括粪便采集、保存和提取，采集的适量新鲜粪便溶解于在采样管中的缓冲液中形成样品保存，然后对缓冲液中新鲜粪便菌群进行预处理，去除缓冲液后形成粪便沉淀，然后进行菌群dna提取；对菌群dna提取包括以下步骤：
步骤a、裂解分离；该步骤中：在粪便沉淀中加入裂解缓冲液，于40－70℃条件下静置1.5-2.5h，离心分离，取上清液，用混合有机溶剂抽提出dna；
步骤b、析出；该步骤中：向含dna的抽提液中加入0.1～1倍体积2～4m浓度的naac和1～2倍体积的无水乙醇充分混匀后于-10～-30℃条件下静置0.5～lh，离心分离，析出dna沉淀，将析出的dna沉淀室温下干燥；
步骤c、纯化处理；该步骤中：向沉淀中加ph6～7的tris-hci缓冲液和硫氰酸胍(guscn)至dna沉淀完全溶解，然后加入二氧化硅微珠悬浮液，摇匀，离心分离，用50-80％乙醇洗涤硅珠沉淀，分离，脱去硅珠中残存的乙醇后加入te液洗脱，离心分离得到含dna的te液。
本发明提取产物dna的纯度大于1.7(od260/od280)，dna产物片断大于10kb，可进行基因扩增和测序。本方法对保存3年以内的样品均有效。
本发明的方法有较好的通用性，广泛适用于各种人类粪便中肠道菌群dna提取，且一般不需重复实验。在验证的众多人类粪便样本dna提取中，仅一次提取即得到高质量菌群dna，在对16srrna基因的扩增中，所有提取的菌群dna模板均能成功进行扩增。得到与预期大小相同的250bp产物，且浓度高、特异性强，测序结果证实了提取的真实性。
进一步的，上述的高质量菌群dna提取方法中：对缓冲液中新鲜粪便菌群进行预处理包括以下步骤：
步骤01、将缓冲液及新鲜粪便并捣碎至糊状并振荡混匀后，倒入无菌的离心管中；
步骤02、9000rpm-11000rpm离心2-5min，倾去上清；在沉淀中继续加入浊液，9000rpm-11000rpm离心2-5min，重复此步骤2～4次，获得粪便沉淀用于dna提取；
步骤03、粪便沉淀中加入lml1-0.8％的生理盐水，混匀后9000rpm-11000rpm离心2-5min，倾去上清保留沉淀，重复此步骤1-3次。
进一步的，上述的高质量菌群dna提取方法中：所述的步骤a中，所述的混合有机溶剂为酚、氯仿和异戊醇按30-20：28-18：1的体积比混合得到的混合溶剂。
进一步的，上述的高质量菌群dna提取方法中：所述的步骤a中，所述的裂解缓冲液是ctab溶液；
500ml2％ctab按照如下步骤制备：
取：
ctab5－15g；
碱性的0.5－3mmol/l规格的tris-hcl溶液20－100ml；
碱性的0.2－1.0mmol/l规格的edta10－50ml；
用100－500ml水溶解；
然后定容至500ml；
灭菌。
进一步的，上述的高质量菌群dna提取方法中：所述的步骤a中，离心分离采用离心速度15000-10000rpm，离心时间10-4分钟。
进一步的，上述的高质量菌群dna提取方法中：所述的步骤a中，用混合有机溶剂抽提出dna包括以下步骤：
向上清液中加入混合有机溶剂，震荡10min后，采用离心速度11000-9000rpm离心时间8-15min进行分离；吸出上清液，重复本步骤，直至离心后水相和有机相之间不再有白色沉淀。
进一步的，上述的高质量菌群dna提取方法中：所述的步骤b中，离心分离采用离心速度11000-9000rpm,离心时间8-15min。
进一步的，上述的高质量菌群dna提取方法中：所述的步骤c中，加入二氧化硅微珠悬浮液，摇匀，离心分离时，离心分离采用离心速度11000-9000rpm，离心时间3-8min。
以下将结合附图和实施例，对本发明进行较为详细的说明。
附图说明
图1为不同方法菌群dnaod比值(od260/od280)。
图中，1为本发明的方法，2是ctab法，3是预处理有机溶剂抽提法，4是试剂盒法。
具体实施方式
本实施例是一种提供的高质量菌群dna提取方法，其方法如下所述：
一、粪便样本的采集与保存：
采样过程中使用一次性无菌供应品以防止采样时的人为污染和样品间的交叉污染，采集后立即用缓冲液进行保存。
本实施例中缓冲液可以采用无水也可以使用按照下面的配方配制的dets。
dets中的一般可以采用如下组份：
10％－30％二甲亚砜(dmso)、1－2mm/ledta、80－120mmol/ltris-hcl，配好后加nacl至溶液饱和，用hcl调节ph至微碱性，高压灭菌10－30min，室温保存。
采用下面的组分的dets做缓冲液效果最好。
采用20％浓度的二甲亚砜(dmso)、0.25mmol/ledta、100mmol/ltris-hcl，配好后加nacl至溶液饱和，用hcl调节ph至7.4，高压灭菌20min，室温保存。
具体采集过程是：用户使用采样管内无菌棉签擦拭新鲜粪便后，将棉签插入采样管，轻轻晃动棉签，使粪便样本溶于采样管中的缓存液，随后采样管寄回实验室。
二、样品的预处理：
在缓存液中浸泡时间过长，粪便在样品管中散开，故采用均质法进行取样：用灭过菌的玻棒将离心管中的粪便捣碎至糊状，振荡混匀后取2ml浊液于2ml无菌的离心管中，10，000rpm离心3min，倾去上清；在沉淀中继续加入浊液，10，000rpm离心3min后保留沉淀，重复此步骤2～4次以获得大约200mg的粪便沉淀用于dna提取。往粪便沉淀中加入lml0.9％的生理盐水，混匀后10，000rpm离心3min，倾去上清保留沉淀，重复此步骤2次，目的是去除在粪便沉淀中残留少量保存液(无水乙醇或dets)。实践中，离心的速度有±20％余量，时间也有±20％余量，如标注10，000rpm离心3min时，可以在9000rpm-11000rpm离心2-5min之间选择。
三、实验准备
准备好量程分别为1ml、2ml、50ml的微量移液器；水浴锅温度至55℃；高速离心机离心力要能达到10000g；确保1.5ml和2m1离心管均己灭菌：确保所有溶液无沉淀、无结晶，若有沉淀或结晶，可用70℃水浴让其溶解；将无水乙醇置于-20℃冷冻，将te加热到65℃以利于dna的溶解或洗脱。
三、实验具体步骤：
本实验所有过程均使用一次性手套、一次性无菌供应品并在无菌工作台中进行，以避免在取样、提取和扩增过程中引入人为污染
1)取200mg粪便于2ml离心管中，加入lmlctab裂解缓冲液中(100mmtris-hcl，ph8，1.4mnacl，20mmedta，2％ctab)，混匀后55℃水浴2小时，每隔半小时取出摇匀一次；
本实验的裂解缓冲液是2％的ctab，500ml2％ctab按照下面方法制备：
步骤1、取如下份量和规格的组份：
ctab10g；
ph值是8.0的1mmol/l规格的tris-hcl溶液50ml；
ph值是8.0的0.5mmol/l规格的edta20ml；
步骤2、用200ml水溶解上述组份；
步骤3、定容至500ml；
步骤4、灭菌。
2)12，000rpm离心5min，离心结束后移出700μl上清至一无菌1.5ml离心管中，弃沉淀。向上清中加入等体酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)，震荡10min后10，000rpm离心10min；吸出上清至另一无菌1.5ml离心管中，加入等体酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)重新抽提，直至离心后水相和有机相之间不再有白色沉淀；
3)向上清中加入0.1倍体积的3mnaac，在旋涡混合器上混匀后加入1.5倍体积(加入盐之后计算的体积)预冷的无水乙醇，充分混匀后-20℃放置0.5～1h；
4)12，000rpm离心10min，吸弃上清，沉淀在室温中凉干；
5)在沉淀中加入lmlguscn洗液(5mguscn，0.1mtris-hcl，ph6.4)，摇匀至沉淀完全溶解；
6)加入100μl硅珠悬液，缓慢摇匀吸附dna10min，10，000rpm离心5min，吸弃上清；在硅珠沉淀中加入500μlguscn洗液，混匀后10，000rpm离心5min，吸弃上清并重复一次；
7)离心弃上清，用500μl70％乙醇重新洗涤沉淀2次；
8)离心弃上清，将1.5ml离心管置于55℃烘箱内5min烘干残余乙醇，再向硅珠沉淀中加入100μlte，震荡混匀5min洗脱dna，最后12，000rpm离心5min，移出约80μl上清至一无菌200μl或1.5ml离心管中保存。
操作实例1：
1、粪便样本的采集与保存
采样时使用一次性无菌供应品进行粪便样本采集，采集后立即用无水乙醇和dets分别进行保存。
2、样本的预处理
用灭过菌的玻棒将离心管中的粪便捣碎至糊状，振荡混匀后取2ml浊液于2ml无菌的离心管中，10，000rpm离心3min，倾去上清；在沉淀中继续加入浊液，10000rpm离心3min后保留沉淀，重复此步骤2～4次以获得大约200mg的粪便沉淀用于dna提取。往粪便沉淀中加入lml0.9％的生理盐水，混匀后10，000rpm离心3min，倾去上清保留沉淀，重复此步骤2次，目的是去除在粪便沉淀中残留少量保存液(无水乙醇或dets)。解，常温保存10min，再次12000rpm离心1min，弃上清液。
3、粪便样本的提取
(1)取200mg粪便于2ml离心管中，加入lmlctab裂解缓冲液中(100mmtris-hcl，ph8，1.4mnacl，20mmedta，2％ctab)，混匀后55℃水浴2小时，每隔半小时取出摇匀一次；
(2)12，000rpm离心5min，离心结束后移出700μl上清至一无菌1.5ml离心管中，弃沉淀。向上清中加入等体酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)，震荡10min后10，000rpm离心10min；吸出上清至另一无菌1.5ml离心管中，加入等体酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)重新抽提，直至离心后水相和有机相之间不再有白色沉淀；
(3)向上清中加入0.1倍体积的3mnaac，在旋涡混合器上混匀后加入1.5倍体积(加入盐之后计算的体积)预冷的无水乙醇，充分混匀后-20℃放置0.5～1h；
(4)12，000rpm离心10min，吸弃上清，沉淀在室温中凉干；
(5)在沉淀中加入lmlguscn洗液(5mguscn，0.1mtris-hcl，ph6.4)，摇匀至沉淀完全溶解；
(6)加入100μl硅珠悬液，缓慢摇匀吸附dna10min，10，000rpm离心5min，吸弃上清；在硅珠沉淀中加入500μlguscn洗液，混匀后10，000rpm离心5min，吸弃上清并重复一次；
(7)离心弃上清，用500μl70％乙醇重新洗涤沉淀2次；
(8)离心弃上清，将1.5ml离心管置于55℃烘箱内5min烘干残余乙醇，再向硅珠沉淀中加入100μlte，震荡混匀5min洗脱dna，最后12，000rpm离心5min，移出约80μl上清至一无菌200μl或1.5ml离心管中保存。
本实施例中，硫氰酸胍(guscn)是一种很强的蛋白变性剂，可以使细胞裂解，并使核酸水解酶失活。当硫氰酸胍的浓度较高时，二氧化硅颗粒可以特异性吸附dna，利用这种特异性吸附，可以从溶液中直接提取出高纯度的dna而有效避免一些干扰因子(如多糖、胆碱等)的影响，达到纯化dna的目的。此方法中硫氰酸胍既起了裂解细胞、变性蛋白的作用，又起了辅助吸附作用，因此不需要多次转管，在节省了许多步骤的同时即节约了提取时间，也避免了污染。
ctab是一种阳离子去污剂，原多被用于植物dna的提取，它能与蛋白质和大多数的多糖(酸性多糖除外)形成复合物，从而使dna与多糖分开，再用乙醇沉淀dna可除去ctab从而得到纯度较高的dna。因此，利用ctab来处理一些植食性动物的粪便，可以有效的除去多糖、蛋白等粪便中主要影响pcr扩增的杂质，得到高质量的dna。
本实施例的方法提取产物dna的纯度大于1.7(od260/od280)，dna产物片断大于10kb，可进行基因扩增和测序。本方法对保存3年以内的样品均有效。如图1所示，1为本发明的方法，2是ctab法，3是预处理有机溶剂抽提法，4是试剂合法。可以本实施例的方法纯度最大。
本实施例的方法有较好的通用性，广泛适用于各种人类粪便中肠道菌群dna提取，且一般不需重复实验。在验证的众多人类粪便样本dna提取中，仅一次提取即得到高质量菌群dna，在对16srrna基因的扩增中，所有提取的菌群dna模板均能成功进行扩增。得到与预期大小相同的250bp产物，且浓度高、特异性强，测序结果证实了提取的真实性。
本实施例中所用的试剂及设备如下所述：
(一)试剂耗材：
苯酚：英杰生命科技有限公司；
异戊醇：英杰生命科技有限公司；
氯仿：广州瑞舒；
te缓冲液：生工生物工程(上海)股份有限公司；
pbs缓冲液；国药集团化学试剂有限公司；
硫氰酸胍(guscn)：生工生物工程(上海)股份有限公司；
二氧化硅微珠：生工生物工程(上海)股份有限公司；
乙醇：生工生物工程(上海)股份有限公司；
生理盐水：国药集团化学试剂有限公司；
醋酸钠：国药集团化学试剂有限公司；
1.5ml、2.0ml无菌离心管：nestbiotechnology；
移液枪：eppendorfcompany
(二)设备
电热恒温水槽：型号dk-s420，上海申贤恒温设备厂台式高速离心机：型号d3024，scilogexcompany微型旋涡混合仪：型号xw-80a，上海沪西分析仪器厂全自动雪花制冰机：型号sn-25，常熟市菱科电器。