本发明涉及护理皮肤制剂领域，尤其是一种皮肤紧急修复用胶原三肽及其制备方法。
背景技术
胶原蛋白作为细胞外基质的主要成分，是多细胞动物中的典型纤维蛋白，占机体总蛋白含量的25-30％，是动物中含量最丰富的蛋白质，具有特殊的机械性能和生物特性。近年来，随着对胶原蛋白研究的不断深入，其在医学领域、美容业和食品工业中的应用也越来越广泛，目前胶原蛋白已被认为是一种性能优异、应用广泛和开发价值很高的天然生物物质。
胶原多肽可完全溶解于水，水溶液低黏度，在60％高浓度下也有流动性，耐酸性能好，在酸、碱的情况下均无沉淀，耐高温性能好，200℃加热亦无沉淀。由于其分子质量较小，所以更易被人体吸收。胶原多肽与植物蛋白相比，其吸收利用率更高，吸收程度可达到，没有过敏反应，且可以促进食品中的其他蛋白质的吸收。
蛋白质水解物的生产方式分为化学降解法和酶降解法。化学法是用酸、碱等化学试剂在一定温度下促使蛋白质分子的肤链断裂形成小分子物质。酸法多采用盐酸、硫酸等强酸在高温下反应，反应强烈，设备腐蚀严重，水解彻底，多生成氨基酸混合物，同时在高温下色氨酸完全被破坏。碱法水解还会使天然的l-氨基酸消旋，还能形成有毒物质，无生物利用价值，因此不宜采用。
到了20世纪80年代，随着酶制剂工业和食品工业的迅猛发展，人们发现酶法水解反应温度低，反应时间短，无环境污染。产品营养价值高，以多肽和型游离氨基酸为主，速溶性好，易于人体消化吸收，因而人们的注意力集中在利用酶水解产物上。
目前应用较广的蛋白酶有碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、风味蛋白酶flavourzyme、复合蛋白酶protamex等。
现有技术中，《酶法制取比目鱼皮胶原蛋白寡肽》(食品研究与开发，2006，27(8):104-107.)一文选用碱性蛋白酶水解比目鱼皮，得到了胶原肽，最大水解度为22.36％。授权公告号为cn104540960b的中国发明专利提供了一种用生姜根茎的酶来分解胶原得到胶原肽。又如，授权公告号为cn101870995b的中国发明专利，以鱼皮为原料采用三步酶解法制备胶原三肽。
通过上述文献可知，现有技术中酶解的原料大多选用哺乳动物的皮或骨或者鱼类的皮，罕有用贝类动物作为原料的报道。贝类动物作为一种非常常见、分布广泛的动物，有巨大的开发成胶原肽原料的商业潜力。
技术实现要素：
本发明提供了一种皮肤紧急修复用的胶原三肽及其制备方法，利用贻贝科动物制备的明胶通过双酶水解法制备胶原三肽，有效克服了现有技术中胶原肽原料来源窄的问题。本发明提供的皮肤紧急修复用的胶原三肽，分子小，吸收快，有着效果极佳的紧急修复皮肤作用，透皮吸收效果以及自由基清除效果。
本发明是通过如下技术方案实现的：
一种皮肤紧急修复用胶原三肽，由贻贝科动物明胶制备而成。
优选地，所述的贻贝科动物为寻氏肌蛤。
优选地，其特征在于，所述的贻贝科动物明胶制备步骤如下：
(1)清洗：将贻贝科动物肉与外壳分离，用贻贝科动物肉质量4-5倍的水洗涤，洗涤完成后再用贻贝科动物肉质量4-5倍的水浸泡1-2小时后取出备用；
(2)预处理：用组织匀浆机将清洗后的贻贝科动物肉匀浆，加入贻贝科动物肉质量2-3倍质量的水，加热至80-100℃，保持10-30分钟，得到预处理液；
(3)糖化酶降解：将预处理液用酸性溶液调节ph值至4.0-4.5，同时调节温度至60-65℃，加入糖化酶酶解2-3小时，得到酶解液；
(4)酶灭活：将酶解液升温至95-100℃，保持5-15分钟，冷却至30-40℃，离心过滤，除去滤渣，得到酶灭活液；
(5)凝胶成型：将交联剂溶液与酶灭活液混合，室温下静置10-12小时，得到贻贝科动物明胶；
所述的交联剂溶液与酶灭活溶液的体积比为1：(4-5)。
优选地，所述酸性溶液为0.01-0.15mol/l盐酸溶液、0.01-0.5mol/l乙酸水溶液、0.01-0.5mol/l甲酸水溶液、0.01-1.0mol/l苯甲酸水溶液、0.01-0.1mol/l柠檬酸水溶液中的任意一种。
优选地，所述交联剂溶液由摩尔比为(2-3):1:(30-40)的过渡金属盐:螯合剂:水混合得到；
所述螯合剂为乙二胺、乙二胺四乙酸、三亚乙基四胺六乙酸和环己烷二胺四乙酸钠中的任意一种。
优选地，所述的过渡金属盐为fe3+、co2+和ni2+的水溶性无机盐中的任意一种或多种。
更优选地，所述的过渡金属盐为fecl3和nicl2摩尔比为1:1的混合金属盐。
皮肤紧急修复用胶原三肽制备方法，步骤如下：
(1)将贻贝科动物明胶于70-80℃下加热5-10分钟后，用盐酸溶液或氢氧化钠水溶液调节ph值至蛋白酶a最适宜的ph值，同时调节温度至蛋白酶a最适宜的温度，加入蛋白酶a酶解2-3小时，再用10-20wt％盐酸溶液或20-40wt％氢氧化钠水溶液调节ph值至蛋白酶b最适宜的ph值，同时调节温度至蛋白酶b最适宜的温度，加入蛋白酶b酶解2-3小时，得到明胶酶解液；
所述的蛋白酶a和蛋白酶b均为植物蛋白酶，且蛋白酶a和蛋白酶b不相同；
(2)将酶解液升温至95-100℃，保持5-15分钟，冷却至30-40℃，离心过滤，取上清液，喷雾干燥，即得皮肤紧急修复用胶原三肽。
更优选地，皮肤紧急修复用胶原三肽制备方法，步骤如下：
(1)将贻贝科动物明胶于70-80℃下加热5-10分钟后，用盐酸溶液或氢氧化钠水溶液调节ph值至蛋白酶a最适宜的ph值，同时调节温度至蛋白酶a最适宜的温度，加入蛋白酶a酶解2-3小时，再用盐酸溶液或氢氧化钠水溶液调节ph值至蛋白酶b最适宜的ph值，同时调节温度至蛋白酶b最适宜的温度，加入蛋白酶b酶解2-3小时，得到明胶酶解液；
所述的蛋白酶a和蛋白酶b均为植物蛋白酶，且蛋白酶a和蛋白酶b不相同；
(2)向明胶酶解液中加入藕粉，静置1-2小时，升温至95-100℃，保持5-15分钟，冷却至30-40℃，离心，取上清液，喷雾干燥，即得皮肤紧急修复用胶原三肽；
所述藕粉的添加量为贻贝科动物明胶质量的5-20％。
优选地，所述的植物蛋白酶为菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶或生姜蛋白酶。
优选地，所述藕粉制备方法为将藕在-20℃下保存0.5-3小时后，加入匀浆机中，加入藕3-5倍质量的有机溶剂，匀浆2-3分钟，得到匀浆液，用5倍藕粉质量的丙酮洗涤一次，过滤，室温下自然风干，即得藕粉；
所述的有机溶剂为苯甲醚、三丁甲基乙醚或甲基异丁酮。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明作进一步的详细说明，以下实施例仅仅是用来解释本发明，并不用于限定本发明。
具体地，在下述实施例中使用的原料或设备来源如下：
寻氏肌蛤，拉丁学名为musculussenhousei，购自汕头安平路水产市场。
藕，拉丁学名为nelumbonuciferagaertn，购自汕头峡山市场。
组织匀浆机为杭州旭青科技有限公司生产的ds-1型组织匀浆机。
盐酸，cas号：7647-01-0。
柠檬酸，cas号：77-92-9。
氢氧化钠，cas号：1310-73-2。
糖化酶，酶活力8万u/g蛋白，山东康勤生物科技有限公司生产。
木瓜蛋白酶，酶活力50万u/g蛋白，上海丽珠东风生物科技有限公司生产。
生姜蛋白酶，按《生姜蛋白酶酶活测定方法的研究》(食品科技，2010(1):277-281.)一文制备，并根据该文的方法测定制得的生姜蛋白酶活性为14万u/g蛋白。
nicl2，cas号：7718-54-9。
fecl3，cas号：7705-08-0。
乙二胺四乙酸，cas号：60-00-4。
苯甲醚，cas号：100-66-3。
甲基异丁酮，cas号：108-10-1。
实施例1
一种皮肤紧急修复用胶原三肽，由寻氏肌蛤明胶制备而成。
寻氏肌蛤明胶制备步骤如下：
(1)清洗：将寻氏肌蛤肉与外壳分离，用寻氏肌蛤肉质量5倍的水洗涤，洗涤完成后再用寻氏肌蛤肉质量5倍的水浸泡2小时后取出备用；
(2)预处理：用组织匀浆机将清洗后的寻氏肌蛤肉匀浆，以10000rpm转速匀浆3分钟，加入寻氏肌蛤肉质量2倍质量的水，加热至80℃，保持15分钟，得到预处理液；
(3)糖化酶降解：将预处理液用0.02mol/l盐酸溶液调节ph值至4.2，同时调节温度至65℃，加入寻氏肌蛤肉质量3％的糖化酶酶酶解3小时，得到酶解液；
(4)酶灭活：将酶解液升温至100℃，保持10min，冷却至40℃，4000rpm离心10分钟，取上清液过200目筛，除去滤渣，得到酶灭活液；
(5)凝胶成型：将交联剂溶液与酶灭活液混合，室温下静置12小时，得到贻贝科动物明胶；
所述的交联剂溶液与酶灭活溶液的体积比为1:5。
所述交联剂溶液由摩尔比为3:1:36的nicl2:乙二胺四乙酸:水混合得到；
皮肤紧急修复用胶原三肽制备方法，步骤如下：
(1)将寻氏肌蛤明胶于70℃下加热6分钟后，用30wt％氢氧化钠水溶液调节ph值至6.5，同时调节温度60℃，加入寻氏肌蛤明胶质量3％的木瓜蛋白酶酶解2小时，再用30wt％氢氧化钠水溶液调节ph值至7.0，同时调节温度至50℃，加入寻氏肌蛤明胶质量3％的生姜蛋白酶酶解2小时，得到明胶酶解液；
(2)将明胶酶解液升温至100℃，保持10min，冷却至30℃，5000rpm离心5分钟，取上清液，以进风温度150℃，出风温度70℃喷雾干燥，即得皮肤紧急修复用胶原三肽。
实施例2
一种皮肤紧急修复用胶原三肽，由寻氏肌蛤明胶制备而成。
寻氏肌蛤明胶制备步骤如下：
(1)清洗：将寻氏肌蛤肉与外壳分离，用寻氏肌蛤肉质量5倍的水洗涤，洗涤完成后再用寻氏肌蛤肉质量5倍的水浸泡2小时后取出备用；
(2)预处理：用组织匀浆机将清洗后的寻氏肌蛤肉匀浆，以10000rpm转速匀浆3分钟，加入寻氏肌蛤肉质量2倍质量的水，加热至80℃，保持15分钟，得到预处理液；
(3)糖化酶降解：将预处理液用0.02mol/l盐酸溶液调节ph值至4.2，同时调节温度至65℃，加入寻氏肌蛤肉质量3％的糖化酶酶解3小时，得到酶解液；
(4)酶灭活：将酶解液升温至100℃，保持10min，冷却至40℃，4000rpm离心10分钟，过200目筛，除去滤渣，得到酶灭活液；
(5)凝胶成型：将交联剂溶液与酶灭活液混合，室温下静置12小时，得到贻贝科动物明胶；
所述的交联剂溶液与酶灭活溶液的体积比为1：5。
所述交联剂溶液由摩尔比为3:1:36的nicl2:乙二胺四乙酸:水混合得到；
皮肤紧急修复用胶原三肽制备方法，步骤如下：
(1)将寻氏肌蛤明胶于70℃下加热6分钟后，用30wt％氢氧化钠水溶液调节ph值至6.5，同时调节温度60℃，加入寻氏肌蛤明胶质量3％的木瓜蛋白酶酶解2小时，再用30wt％氢氧化钠水溶液调节ph值至7.0，同时调节温度至50℃，加入寻氏肌蛤明胶质量3％的生姜蛋白酶酶解2小时，得到明胶酶解液；
(2)向明胶酶解液中加入藕粉，静置2小时，将明胶酶解液升温至100℃，保持10min，冷却至30℃，5000rpm离心5分钟，取上清液，以进风温度150℃，出风温度70℃喷雾干燥，即得皮肤紧急修复用胶原三肽；
所述藕粉的添加量为寻氏肌蛤明胶质量的10％；
藕粉制备方法为将藕在-20℃下保存2小时后，切片加入匀浆机中，加入藕3倍质量的苯甲醚，10000rpm匀浆3分钟，得到匀浆液，用藕5倍质量的丙酮洗涤一次，过1000目筛，所得固体室温下自然风干，即得藕粉。
实施例3
一种皮肤紧急修复用胶原三肽，由寻氏肌蛤明胶制备而成。
寻氏肌蛤明胶制备步骤如下：
(1)清洗：将寻氏肌蛤肉与外壳分离，用寻氏肌蛤肉质量5倍的水洗涤，洗涤完成后再用寻氏肌蛤肉质量5倍的水浸泡2小时后取出备用；
(2)预处理：用组织匀浆机将清洗后的寻氏肌蛤肉匀浆，以10000rpm转速匀浆3分钟，加入寻氏肌蛤肉质量2倍质量的水，加热至80℃，保持15分钟，得到预处理液；
(3)糖化酶降解：将预处理液用0.02mol/l盐酸溶液调节ph值至4.2，同时调节温度至65℃，加入寻氏肌蛤肉质量3％的糖化酶酶解3小时，得到酶解液；
(4)酶灭活：将酶解液升温至100℃，保持10min，冷却至40℃，4000rpm离心10分钟，过200目筛，除去滤渣，得到酶灭活液；
(5)凝胶成型：将交联剂溶液与酶灭活液混合，室温下静置12小时，得到贻贝科动物明胶；
所述的交联剂溶液与酶灭活溶液的体积比为1：5。
所述交联剂溶液由摩尔比为3:1:36的nicl2:乙二胺四乙酸:水混合得到；
皮肤紧急修复用胶原三肽制备方法，步骤如下：
(1)将寻氏肌蛤明胶于70℃下加热6分钟后，用30wt％氢氧化钠水溶液调节ph值至6.5，同时调节温度60℃，加入寻氏肌蛤明胶质量3％的木瓜蛋白酶酶解2小时，再用30wt％氢氧化钠水溶液调节ph值至7.0，同时调节温度至50℃，加入寻氏肌蛤明胶质量3％的生姜蛋白酶酶解2小时，得到明胶酶解液；
(2)向明胶酶解液中加入藕粉，静置2小时，将明胶酶解液升温至100℃，保持10min，冷却至30℃，5000rpm离心5分钟，取上清液，以进风温度150℃，出风温度70℃喷雾干燥，即得皮肤紧急修复用胶原三肽；
所述藕粉的添加量为寻氏肌蛤明胶质量的10％；
藕粉制备方法为将藕在-20℃下保存2小时后，切片加入匀浆机中，加入藕3倍质量的甲基异丁酮，10000rpm匀浆3分钟，得到匀浆液，用藕5倍质量的丙酮洗涤一次，过1000目筛，所得固体室温下自然风干，即得藕粉。
实施例4
一种皮肤紧急修复用胶原三肽，由寻氏肌蛤明胶制备而成。
寻氏肌蛤明胶制备步骤如下：
(1)清洗：将寻氏肌蛤肉与外壳分离，用寻氏肌蛤肉质量5倍的水洗涤，洗涤完成后再用寻氏肌蛤肉质量5倍的水浸泡2小时后取出备用；
(2)预处理：用组织匀浆机将清洗后的寻氏肌蛤肉匀浆，以10000rpm转速匀浆3分钟，加入寻氏肌蛤肉质量2倍质量的水，加热至80℃，保持15分钟，得到预处理液；
(3)糖化酶降解：将预处理液用0.05mol/l柠檬酸水溶液调节ph值至4.2，同时调节温度至65℃，加入寻氏肌蛤肉质量3％的糖化酶酶解3小时，得到酶解液；
(4)酶灭活：将酶解液升温至100℃，保持10min，冷却至40℃，4000rpm离心10分钟，过200目筛，除去滤渣，得到酶灭活液；
(5)凝胶成型：将交联剂溶液与酶灭活液混合，室温下静置12小时，得到贻贝科动物明胶；
所述的交联剂溶液与酶灭活溶液的体积比为1：5。
所述交联剂溶液由摩尔比为3:1:36的nicl2:乙二胺四乙酸:水混合得到；
皮肤紧急修复用胶原三肽制备方法，步骤如下：
(1)将寻氏肌蛤明胶于70℃下加热6分钟后，用30wt％氢氧化钠水溶液调节ph值至6.5，同时调节温度60℃，加入寻氏肌蛤明胶质量3％的木瓜蛋白酶酶解2小时，再用30wt％氢氧化钠水溶液调节ph值至7.0，同时调节温度至50℃，加入寻氏肌蛤明胶质量3％的生姜蛋白酶酶解2小时，得到明胶酶解液；
(2)向酶解液中加入藕粉，静置2小时，将明胶酶解液升温至100℃，保持10min，冷却至30℃，5000rpm离心5分钟，取上清液，以进风温度150℃，出风温度70℃喷雾干燥，即得皮肤紧急修复用胶原三肽；
所述藕粉的添加量为寻氏肌蛤明胶质量的10％；藕粉制备方法为将藕在-20℃下保存2小时后，切片加入匀浆机中，加入藕3倍质量的甲基异丁酮，10000rpm匀浆3分钟，得到匀浆液，用藕5倍质量的丙酮洗涤一次，过1000目筛，所得固体室温下自然风干，即得藕粉。
实施例5
一种皮肤紧急修复用胶原三肽，由寻氏肌蛤明胶制备而成。
寻氏肌蛤明胶制备步骤如下：
(1)清洗：将寻氏肌蛤肉与外壳分离，用寻氏肌蛤肉质量5倍的水洗涤，洗涤完成后再用寻氏肌蛤肉质量5倍的水浸泡2小时后取出备用；
(2)预处理：用组织匀浆机将清洗后的寻氏肌蛤肉匀浆，以10000rpm转速匀浆3分钟，加入寻氏肌蛤肉质量2倍质量的水，加热至80℃，保持15分钟，得到预处理液；
(3)糖化酶降解：将预处理液用0.05mol/l柠檬酸水溶液调节ph值至4.2，同时调节温度至65℃，加入寻氏肌蛤肉质量3％的糖化酶酶解3小时，得到酶解液；
(4)酶灭活：将酶解液升温至100℃，保持10min，冷却至40℃，4000rpm离心10分钟，过200目筛，除去滤渣，得到酶灭活液；
(5)凝胶成型：将交联剂溶液与酶灭活液混合，室温下静置12小时，得到贻贝科动物明胶；
所述的交联剂溶液与酶灭活溶液的体积比为1：5。
所述交联剂溶液由摩尔比为3:1:36的fecl3:乙二胺四乙酸:水混合得到；
皮肤紧急修复用胶原三肽制备方法，步骤如下：
(1)将寻氏肌蛤明胶于70℃下加热6分钟后，用30wt％氢氧化钠水溶液调节ph值至6.5，同时调节温度60℃，加入寻氏肌蛤明胶质量3％的木瓜蛋白酶酶解2小时，再用30wt％氢氧化钠水溶液调节ph值至7.0，同时调节温度至50℃，加入寻氏肌蛤明胶质量3％的生姜蛋白酶酶解2小时，得到明胶酶解液；
(2)向明胶酶解液中加入藕粉，静置2小时，将明胶酶解液升温至100℃，保持10min，冷却至30℃，5000rpm离心5分钟，取上清液，以进风温度150℃，出风温度70℃喷雾干燥，即得皮肤紧急修复用胶原三肽；
所述藕粉的添加量为寻氏肌蛤明胶质量的10％；
藕粉制备方法为将藕在-20℃下保存2小时后，切片加入匀浆机中，加入藕3倍质量的甲基异丁酮，10000rpm匀浆3分钟，得到匀浆液，用藕5倍质量的丙酮洗涤一次，过1000目筛，所得固体室温下自然风干，即得藕粉。
实施例6
一种皮肤紧急修复用胶原三肽，由寻氏肌蛤明胶制备而成。
寻氏肌蛤明胶制备步骤如下：
(1)清洗：将寻氏肌蛤肉与外壳分离，用寻氏肌蛤肉质量5倍的水洗涤，洗涤完成后再用寻氏肌蛤肉质量5倍的水浸泡2小时后取出备用；
(2)预处理：用组织匀浆机将清洗后的寻氏肌蛤肉匀浆，以10000rpm转速匀浆3分钟，加入寻氏肌蛤肉质量2倍质量的水，加热至80℃，保持15分钟，得到预处理液；
(3)糖化酶降解：将预处理液用0.05mol/l柠檬酸水溶液调节ph值至4.2，同时调节温度至65℃，加入寻氏肌蛤肉质量3％的糖化酶酶解3小时，得到酶解液；
(4)酶灭活：将酶解液升温至100℃，保持10min，冷却至40℃，4000rpm离心10分钟，过200目筛，除去滤渣，得到酶灭活液；
(5)凝胶成型：将交联剂溶液与酶灭活液混合，室温下静置12小时，得到贻贝科动物明胶；
所述的交联剂溶液与酶灭活溶液的体积比为1：5。
所述交联剂溶液由摩尔比为1.5:1.5:1:36的fecl3：nicl2：乙二胺四乙酸：水混合得到；
皮肤紧急修复用胶原三肽制备方法，步骤如下：
(1)将寻氏肌蛤明胶于70℃下加热6分钟后，用30wt％氢氧化钠水溶液调节ph值至6.5，同时调节温度60℃，加入寻氏肌蛤明胶质量3％的木瓜蛋白酶酶解2小时，再用30wt％氢氧化钠水溶液调节ph值至7.0，同时调节温度至50℃，加入寻氏肌蛤明胶质量3％的生姜蛋白酶酶解2小时，得到明胶酶解液；
(2)向明胶酶解液中加入藕粉，静置2小时，将明胶酶解液升温至100℃，保持10min，冷却至30℃，5000rpm离心5分钟，取上清液，以进风温度150℃，出风温度70℃喷雾干燥，即得皮肤紧急修复用胶原三肽；
所述藕粉的添加量为寻氏肌蛤明胶质量的10％；
藕粉制备方法为将藕在-20℃下保存2小时后，切片加入匀浆机中，加入藕3倍质量的甲基异丁酮，10000rpm匀浆3分钟，得到匀浆液，用藕5倍质量的丙酮洗涤一次，过1000目筛，所得固体室温下自然风干，即得藕粉。
测试例1
透皮吸收测试
由于只有当胶原肽透过皮肤角质层、表皮层到达真皮层后才能真正被人体吸收并用来修复皮肤，因此通过透皮吸收测试测定单位时间内样品单位面积累计透过量就可以鉴定其皮肤紧急修复功能。
测试方法参考《海蜇、牛骨和鳕鱼皮胶原肽的透皮吸收性能研究》(日用化学工业，2017(3):164-167.)一文中的胶原肽吸收试验。用实施例1-6制备得到的皮肤紧急修复用的胶原三肽分别配制成10g/l的水溶液进行透皮吸收测试，测试结果如表1所示。
表1透皮吸收测试结果
由上表可知，本发明提供的紧急修复用胶原三肽有较好的透皮吸收效果，当在制备过程中时添加了藕粉(实施例2)，可以有效提升单位面积累计透过率，此外寻氏肌蛤明胶制备过程中添加的交联剂最终也会影响透皮吸收效率，由摩尔比为1.5:1.5:1的fecl3：nicl2：乙二胺四乙酸混合后溶于5倍金属盐质量的水制备而成交联剂溶液制备的明胶制备而成的胶原三肽(实施例6)有最好的透皮吸收效果。
测试例2
体外抗氧化测试
实验操作方法如下：配制250μmol/l的dpph标准液，4℃下避光保存，现用现配，配制浓度为12mg/ml的实施例1-6制备的胶原三肽水溶液，取2ml与等体积的dpph标准液混合，避光反应30分钟，于515nm处测定吸光度a1，用乙醇代替胶原三肽水溶液，于515nm处测定吸光度a2，三肽溶液(2ml胶原三肽水溶液+2ml乙醇)在515nm出测定吸光度a3。自由基清除能力按下式计算：
测试结果如表2所示。
表2dpph自由基清除率
由上表可知，本发明提供的胶原三肽均有着较高的自由基清除率，添加藕粉、改变明胶制备时的酸溶液和改变交联剂都会影响到自由基清除率，其中按实施例6方法制备的胶原三肽有着最佳的30分钟自由基清除率，可达86％。